一种短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物农药与微生物肥料技术领域，具体涉及一种含有短短芽孢萌发剂 的短短芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国每年使用大量的化学农药制剂与化肥，极易造成农药残留超标，生物富集，不 仅污染生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小，对人无害，是一种具有广阔前 景的绿色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
[0003] 芽孢杆菌是目前生物农药与生物肥料中研究最多的一种微生物，它具有广谱抗菌 活性和极强的抗逆能力，其营养细胞能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌 生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面显示出了广阔的应用前 景。
[0004] 短短芽孢杆菌是一种在土壤中分离得到的微生物，通过研究发现，其对多种动、植 物病原细菌和真菌如：大肠杆菌、鸡巴氏杆菌、金黄葡萄球菌、黑胸败血病菌、棉花枯萎病 菌、黄萎病，黄瓜枯萎病菌、茶轮斑病菌，烟草青枯病菌等有较强拮抗作用。
[0005] 陈莉等研究了分离自棉花根际土壤的短短芽孢杆菌A57菌株对棉花立枯病菌、枯 萎病菌和黄萎病菌的拮抗作用，在PDA平板上对峙培养，平均抑制率分别是33. 5 %、39.5 %、29.5 %。通过显微镜观察，发现拮抗细菌的主要拮抗机理是通过产生拮抗物质能够造成 病原真菌菌丝体断裂、扭曲、畸形，抑制分生孢子的萌发，造成孢子畸形。以枯萎病菌为指示 菌，研究了该菌株表现最佳拮抗活性时的菌液发酵条件，结果表明，A57适宜培养基为LB培 养基，PH8,好气条件下抑菌活性最好。用硫酸铵沉淀法提取A57菌株的粗提蛋白，对供试的 病原菌仍具有较高的拮抗活性，70%浓度时其拮抗活性最大，A57粗提蛋白对枯萎病原菌的 最大抑制率为23.7%，同时该菌经硫酸铵沉淀后获得的粗体蛋白的上清液对病原指示菌仍 具有一定的拮抗活性，说明A57拮抗细菌起拮抗作用的不仅有大分子蛋白类物质还有小分 子拮抗物质。
[0006] 朱忠彬等研究烟草根际生防菌株短短芽孢杆菌(BrevibaciIlus brevis)DZQ3对 烟草促生效果及诱导系统抗性，在温室内进行盆栽试验，以浸根加灌根的方式接种DZQ3。用 测定各处理烟株生理指标的方法，包括烟株的农艺性状、生物量，烟草叶片叶绿素含量、电 解相对渗透率、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶和过氧化氢酶 等系统抗性相关指标及根系发育情况，评价接种DZQ3对烟株的影响。结果表明，DZQ3处理后 烟株农艺性状及生物量好于对照，30 d时较为显著(p〈0.05);系统抗性相关生理指标优于 对照，60 d时最为显著(p〈0.05)。生防菌DZQ3对烟草的生长发育具有促进作用，能够诱导系 统抗性，增强烟草的抗病能力。
[0007] 黄素芳等从土壤中分离得到一株短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)JK_2,已 有研究表明它对西瓜枯萎病菌、大丽轮枝菌、苦瓜炭疽病菌、桃褐腐病菌、番茄青枯雷尔氏 菌、禽致病性大肠杆菌K88菌株都具有强的抑制作用，是一株具有广谱抗菌活性的生防菌， 经室内毒力测定，JK-2的发酵液对香蕉枯萎病菌具有良好的防治效果。易有金等在烟草青 枯病区采取健康烟草植株，从其茎杆内分离到2株对烟草青枯拉尔氏菌（Ralstonia solanacarum )有强诘抗作用的内生短短芽孢杆菌菌株009和011。温室内用淋根法分别 先接种009和011菌株，后接种病原菌，其防效分别为87.25%和52.30%。用009和011菌液分 别和烟草青枯病菌的混合液淋根，其防效明显低于前者。田间小区试验结果表明，011菌株 的防效明显高于009菌株和农用链霉素。黄黎锋等在专利号201410519415. X中公开了一种 短短芽孢杆菌H3及其在制备腐熟剂中的应用。周礼红等在专利号201410003514.2中公开了 一株短短芽孢杆菌菌株，其菌株的培养方法及其在除臭方面的应用。胡雪芹等在专利号 201010607988.X中公开了一株防治植物真菌病害的短短芽孢杆菌及生物农药的制备方法， 其能显著降低瓜类的枯萎病。叶建仁等在专利号201210111439.2中公开了一种短芽孢杆菌 及其在促进松树生长中的应用。林壁润在专利号201110030249.3中公开了一种防治辣椒疫 病的短芽孢杆菌及生物制剂的制备方法与应用。易有金等在专利号201410013801.1中公开 了一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由短短芽孢杆菌发酵液，滑石粉，木质素 磺酸钙，DBS、CMC-Na、糊精及白炭黑按一定比例组成。车建美等在专利号201010296437.6中 公开了一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用，该菌株发酵液制剂对龙眼进行保鲜的微生物 保鲜菌剂，该菌剂能够降低龙眼的腐烂率，且可保持果实的色泽和口味。
[0008] 虽然以芽孢杆菌为主制备的微生物农药产品不少，但总体说来，还存在包括研究 开发与生产脱节，制剂化困难，产品质量稳定性差、生产工艺落后，产品一致性不高，生产企 业规模小，应用推广难度大的问题，除些之外，目前芽孢杆菌以可湿性粉剂为主，这种剂型 虽然便于储存和运输，但在生产应用中存在很多制约因子。如施用的可湿性粉剂中大部份 以芽孢作为衡量产品中有效成分的惟一标准，若芽孢不能及时萌发，施用效果则不佳，如王 倩利用枯草芽孢杆菌TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用TR21菌株NB发酵液灌根和叶 腋接种都能有效防治枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的灌根与叶腋效果却不理想， 验证了去掉发酵液后的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。
[0009] 芽孢杆菌在自然界中分布广泛，当外部条件适合生长时，芽胞会由休眠状态经过 一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用，这个过程称为萌发 (germination)。自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为"萌发 剂"，通常营养诱导芽孢萌发包括氨基酸、糖类和嘌吟核苷的单一作用，也包括它们的协同 作用（例如:AGFK; A: L-天冬酞胺;G:葡萄糖;F:果糖;K:钾离子）。当营养物质接触到芽孢 时，芽孢内部会发生一系列变化，（1 )、芽孢核内部H+和Zn2+释放出来，致使芽孢核内部pH由 弱酸性上升至弱碱性；（2)、芽孢核内部Ca 2+--DPA的大量释放；（3)、芽孢核水合，内部Ca2+--DPA被水所替代，芽孢的耐热性下降；（4)、芽孢皮层的芽孢肤聚糖层水解，芽孢核膨胀；（5)、 芽孢核进一步水合，芽孢核内部蛋白质流动性增强，酶活性加强，合成ATP; (6)、降解SASP蛋 白，以释放芽孢DNA，进而引导芽孢生长过程中RNA、蛋白质、DNA的合成。
[0010] 芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层 到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接 着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。
[0011]在芽胞杆菌属中，枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌 因与人类的生产生活息息相关而备受关注。研究表明，枯草芽胞杆菌的基因组包含一系列 与抗生素及重要工业用酶相关的基因簇，炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌对人畜均有很强的 致病性，由于前者用于制造生物武器，而后者产生致人呕吐和腹泻的毒素，因此两者时刻威 胁着人类的健康和生命安全，当处于芽孢状态时它们均不具备感染能力，但当进入萌发状 态后开始具有感染人畜的能力，并最终产生致病甚至致人死亡的毒素;而昆虫的病原细菌 苏云金芽胞杆菌对昆虫具有特异的毒杀作用，在寄主体内的芽胞萌发后能够引起败血症， 并且它们的芽胞能够有效提高杀虫晶体蛋白的毒力，芽胞的萌发在增效作用中可能是必要 的。因此，对芽胞杆菌萌发过程的研究为抑制其致病性，维护人类健康及生命安全具有至关 重要的理论意义与实际应用价值，因此这四种芽孢对其萌发机理与相关的萌发剂研究得比 较多，但有关短短芽孢杆菌的芽孢萌发剂还未见公开。也未有在短短芽孢杆菌可湿性粉剂 中加入芽孢萌发剂的研究的报道。