用于慢病毒包装的无血清培养293t细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 随着免疫细胞治疗产业的发展，越来越多的研究机构、医药公司和初创公司投身 于免疫细胞治疗技术的明星:CAR-T，的研发、临床试验和产业化制备。CAR-T全称嵌合抗原 受体T细胞，是一种利用基因工程的方法设计、合成CAR基因，转至慢病毒载体，利用293T包 装为慢病毒，然后感染肿瘤患者的T细胞，从而得到CAR-T细胞，回输患者，用于肿瘤患者的 免疫细胞治疗。由于CAR基因设计了识别肿瘤细胞的单链抗体和活化T细胞的胞浆内活化结 构域，因此，CAR-T治疗肿瘤具有极好的效果，针对急性淋巴细胞性白血病的完全缓解率达 到了 93%，是一种能够治愈肿瘤的技术。目前，美国和中国的CAR-T研发非常活跃，中国仅次 于美国申请了关于CAR-T细胞治疗的20多项临床试验方案，可以说，CAR-T治疗正在中国如 火如荼的开展，很有可能开发出治愈肿瘤的细胞治疗方案，造福广大肿瘤患者。
[0003] 在CAR-T的制备过程中，最常用到的基因操作技术是慢病毒包装技术，需要利用贴 壁培养的293T细胞，通过转染试剂转入CAR慢病毒载体和病毒包装质粒，2天后在细胞培养 上清内得到慢病毒颗粒，此慢病毒为人工包装的病毒，只具有一次感染能力，可以高效的感 染T细胞，具有其他基因操作技术:转染、电转、逆转录病毒、腺病毒等无法比拟的优势，因 此，CAR-T制备过程中慢病毒包装是必需的过程，在CAR-T产业化和人体应用的过程中，必需 解决如何得到符合GMP标准的慢病毒颗粒的问题。
[0004] 相关技术中，慢病毒包装主要采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养293T细 胞，慢病毒颗粒制备过程中，不可避免的混入胎牛血清成分，如牛血清白蛋白（BSA)。然而， 依据GMP标准，用于人体的生物制品必须不含动物源性成分，为了解决这一问题，目前通用 的做法是得到慢病毒液后，利用离子交换、灌流的方法去除牛血清，这种方法虽然满足了牛 血清成分去除的要求，但操作过程复杂，使用的灌流设备和耗材、试剂费用较高，并且采用 此技术浓缩、纯化慢病毒的倍数不高，会影响CAR-T后续步骤中的慢病毒感染效率。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006] 为此，本发明的一个目的在于提出一种用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的 方法，可以解决慢病毒包装过程中混入牛血清成分的问题，以符合GMP制品要求。
[0007] 根据本发明实施例的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，包括以下步 骤：
[0008] 步骤S1、用含10% (体积比）胎牛血清的DMEM培养基，将293T细胞放在37°C、5%C〇2 的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0009] 步骤S2、用含5% (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S1培养获得的293T细胞 放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0010] 步骤S3、用含2% (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S2培养获得的293T细胞 放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0011] 步骤S4、用含1 % (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S3培养获得的293T细胞 放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0012] 步骤S5、用含0.5%(体积比）胎牛血清的001培养基，将步骤34培养获得的2931'细 胞放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0013] 步骤S6、用含0.1%(体积比）胎牛血清的001培养基，将步骤35培养获得的2931'细 胞放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0014] 步骤S7、用含0.05 % (体积比）胎牛血清的CDM培养基，将步骤S6培养获得的293T细 胞放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满；
[0015] 步骤S8、用CDM培养基，将步骤S7培养获得的293T细胞放在37°C、5%⑶2的孵箱内 进行培养，直至细胞长满；由此获得用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞。
[0016] 根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S3之前，将步骤S2培养获得的293T细胞，在步骤S2的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0017] 根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S4之前，将步骤S3培养获得的293T细胞，在步骤S3的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0018] 根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S5之前，将步骤S4培养获得的293T细胞，在步骤S4的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0019] 根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S6之前，将步骤S5培养获得的293T细胞，在步骤S5的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0020] 根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S7之前，将步骤S6培养获得的293T细胞，在步骤S6的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0021] 根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S8之前，将步骤S7培养获得的293T细胞，在步骤S7的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0022]根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S8之后，将步骤S8培养获得的293T细胞，在步骤S8的培养条件下进行多次传代培 养的步骤。
[0023]根据本发明的一个示例，所述多次传代培养的次数均为五次。
[0024]根据本发明的一个示例，所述用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法还包 括在步骤S8之后，将培养获得的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞进行冻存的步骤。 [0025]根据本发明实施例的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，可以解决相 关技术中慢病毒包装过程中混入牛血清成分的问题。通过本发明的方法培养得到的293T细 胞能够在无血清条件下，快速增殖，能够用于慢病毒的包装，得到的慢病毒具有较高的滴 度，能够用于CAR-T制备的产业化要求，解决了使用牛血清不符合GMP制品要求的问题。
【附图说明】
[0026]图1示出了无血清⑶Μ条件和亲代细胞10 %牛血清培养条件的293T细胞的形态和 增殖速度。
[0027]图2示出了无血清CDM条件培养的293Τ细胞能够包装得到足够数量的慢病毒。
【具体实施方式】
[0028] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0029] 实施例1
[0030] 步骤S1:用含10% (体积比）胎牛血清的DMEM培养基，将293Τ细胞放在37°C、5%C02 的孵箱内进行培养，直至细胞长满。
[0031 ]步骤S2 :用含5 % (体积比）胎牛血清的CDM培养基（步骤2中，将培养基更换为 Pro293a-⑶M，简称⑶Μ培养基，这是一种无血清的293细胞培养基，L0NZA公司，货号：12-764Q)，将步骤S1培养获得的293Τ细胞放在37 °C、5 %⑶2的孵箱内进行培养，直至细胞长满。 此时，细胞形态和增殖速度没有发生明显改变。
[0032]有序地，细胞长满后，进行传代培养，连续传代5次后(传代5次约需10-12天时间）， 对部分细胞取样冻存。
[0033] 步骤S3、用含2% (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S2培养获得的293T细胞 放在37°C、5%C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满。此时，细胞少部分死亡，增殖速度明显 减慢。
[0034]有序地，细胞长满后，进行传代培养，连续传代5次后(传代5次约需15-20天时间）， 对部分细胞取样冻存。可以看出，由于细胞少部分死亡，增殖速度明显减慢，传代间隔时间 延长(时间范围约3-4天/传代）。
[0035]步骤S4、用含1 % (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S3培养获得的293T细胞 放在37 °C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满。此时，细胞无明显变化，增殖速度亦无 明显变化。
[0036]有序地，细胞长满后，进行传代培养，连续传代5次后(传代5次约需15-20天时间）， 对部分细胞取样冻存。
[0037] 步骤S5、用含0.5%(体积比）胎牛血清的001培养基，将步骤34培养获得的2931'细 胞放在37 °C、5 %C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满。此时，细胞形态变圆，贴壁不紧，部 分细胞变为悬浮生长，增殖速度减慢。
[0038]有序地，细胞长满后，进行传代培养，连续传代5次后（传代5次约共需25-30天时 间）。传代培养时，需要丢弃悬浮细胞，保留贴壁细胞，对部分细胞取样冻存。
[0039] 步骤S6、用含0.1%(体积比）胎牛血清的001培养基，将步骤35培养获得的2931'细 胞放在37 °C、5 % C02