的孵箱内进行培养，直至细胞长满。此时，约有一半细胞悬浮，一半细胞 贴壁，贴壁细胞贴壁不紧牢，增殖速度减慢。
[0040]有序地，细胞长满后，进行传代培养，连续传代5次后(约6-8天/传代，约共需30-40 天时间），对部分细胞取样冻存。
[0041 ] 步骤S7、用含0.05 % (体积比）胎牛血清的CDM培养基，将步骤S6培养获得的293T细 胞放在37 °C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满。此时，细胞增殖速度无明显变化，但 贴壁逐渐较紧。
[0042]有序地，细胞长满后，进行传代培养，连续传代5次后（约共需30-40天时间），对部 分细胞取样冻存。
[0043] 步骤S8、用CDM培养基，将步骤S7培养获得的293T细胞放在37°C、5%⑶2的孵箱内 进行培养，直至细胞长满；由此获得用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞。
[0044] 由上述可知，经过持续不断的培养，驯化(整个培养过程约需60-80天时间），在无 血清CDM条件下培养的293T细胞增殖速度逐渐较快。至此，可以得到驯化成功、能够在无血 清条件下培养的293T细胞。
[0045] 图1示出了无血清⑶Μ条件和亲代细胞10 %牛血清培养条件的293T细胞的形态和 增殖速度。
[0046] 其中，在图1中，
[0047] Α示出了含血清条件(DMEM/10%FBS)下的293Τ细胞；
[0048] B示出了无血清条件(使用无血清培养基，Pro293a-CDM)下的293T细胞；
[0049] C示出了 MTS法测定两种生长条件下293T细胞的增殖速度，无血清条件下培养前两 天细胞之间生长速度无差异，后两天无血清条件下生长速度变慢。
[0050] 对比例
[00511使用无血清培养的293T细胞包装慢病毒，我们对包装慢病毒的条件和上清中是否 含有足够数量的慢病毒进行了实验。
[0052]具体实验方案见下：
[0053] 1.病毒包装条件的优化
[0054] 1.1种细胞:种植1 X 106293T细胞/孔(6孔板），共3孔，使用无血清培养条件；
[0055] 1.2转染，过夜培养后，显微镜下观察，细胞密度约80 % -90 %，设计不同的转染条 件，以确定得到最佳转染效率，病毒包装效率较高，转染条件和分组见下表1。
[0056] 表1分组和转染条件、步骤
[0057]
[0058] 1.3转染2天后，收获培养基病毒上清，1500rpm室温离心5分钟，取上清测定病毒含 量。
[0059] 2.培养上清病毒的检测
[0060] 2.1种细胞1 X 104293T细胞/孔(96孔板），共种植6孔；
[0061] 2.2过夜培养后，细胞密度约50%-60%，取1.3收获的病毒上清50μ1，加入96孔板 的6孔内，A、B、C每种病毒上清各设一复孔；
[0062] 2.3感染3天后，观察荧光(包装的病毒载体？1^-11^5-?1^〇含绿色荧光），照相，图 片见下图2。
[0063] 图2示出了不同转染包装条件得到的病毒量比较。
[0064] 其中，A表示表1中转染分组A包装的病毒；
[0065] B表示表1中转染分组B包装的病毒；
[0066] C表示表1中转染分组C包装的病毒；
[0067] D表示使用含10%血清培养的293T细胞包装的病毒。
[0068]图2中，绿色荧光点表示病毒成功感染了293T，绿色荧光点多表明病毒数量较多， 可见C转染包装条件得到病毒量较多，A、B转染条件病毒量非常少。C和D相比，荧光点数量区 别不大，表明无血清条件培养的细胞能够包装出高质量的病毒。
[0069]结果表明，转染条件C包装病毒的效果较好。这些结果表明，采用本发明所培养得 到的无血清培养293T能够高效的包装得到慢病毒颗粒，将可以用于包装符合GMP标准的 CAR-T用慢病毒。
[0070] 根据本发明实施例的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，可以解决相 关技术中慢病毒包装过程中混入牛血清成分的问题。通过本发明的方法培养得到的293T细 胞能够在无血清条件下，快速增殖，能够用于慢病毒的包装，得到的慢病毒具有较高的滴 度，能够用于CAR-T制备的产业化要求，解决了使用牛血清不符合GMP制品要求的问题。
[0071] 相关技术建立了无血清条件培养的293T细胞，但293T细胞为悬浮细胞，主要应用 于生物工程中蛋白质的高效表达，不能用于慢病毒包装。本发明建立了贴壁的无血清培养 的293T细胞。使用无血清培养包装的慢病毒，在后续的浓缩、纯化过程中，可以不使用昂贵 的灌流设备和耗材，慢病毒浓缩倍数更高，从而能够高效感染T细胞。
[0072] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤S1、用含10% (体积比）胎牛血清的DMEM培养基，将293T细胞放在37°C、5%⑶2的孵 箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S2、用含5% (体积比）胎牛血清的CDM培养基，将步骤S1培养获得的293T细胞放在 37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S3、用含2% (体积比）胎牛血清的CDM培养基，将步骤S2培养获得的293T细胞放在 37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S4、用含1 % (体积比）胎牛血清的CDM培养基，将步骤S3培养获得的293T细胞放在 37°C、5 % C02的孵箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S5、用含0.5 % (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S4培养获得的293T细胞放 在37°C、5 % 0)2的孵箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S6、用含0.1 % (体积比）胎牛血清的⑶Μ培养基，将步骤S5培养获得的293T细胞放 在37°C、5 % 0)2的孵箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S7、用含0.05 % (体积比）胎牛血清的CDM培养基，将步骤S6培养获得的293T细胞放 在37°C、5 % 0)2的孵箱内进行培养，直至细胞长满； 步骤S8、用CDM培养基，将步骤S7培养获得的293T细胞放在37°C、5 % C02的孵箱内进行培 养，直至细胞长满；由此获得用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞。2. 根据权利要求1所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S3之前，将步骤S2培养获得的293T细胞，在步骤S2的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。3. 根据权利要求2所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S4之前，将步骤S3培养获得的293T细胞，在步骤S3的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。4. 根据权利要求3所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S5之前，将步骤S4培养获得的293T细胞，在步骤S4的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。5. 根据权利要求4所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S6之前，将步骤S5培养获得的293T细胞，在步骤S5的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。6. 根据权利要求5所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S7之前，将步骤S6培养获得的293T细胞，在步骤S6的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。7. 根据权利要求6所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S8之前，将步骤S7培养获得的293T细胞，在步骤S7的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。8. 根据权利要求7所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 还包括在步骤S8之后，将步骤S8培养获得的293T细胞，在步骤S8的培养条件下进行多次传 代培养的步骤。9. 根据权利要求8所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在于， 所述多次传代培养的次数均为五次。10.根据权利要求1所述的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，其特征在 于，还包括在步骤S8之后，将培养获得的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞进行冻存 的步骤。
【专利摘要】本发明提出一种用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，包括在37℃、5％CO2的孵箱内，依次用含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基、用含5％(体积比)胎牛血清的CDM培养基、用含2％(体积比)胎牛血清的CDM培养基、用含1％(体积比)胎牛血清的CDM培养基、用含0.5％(体积比)胎牛血清的CDM培养基、用含0.1％(体积比)胎牛血清的CDM培养基、用含0.05％(体积比)胎牛血清的CDM培养基、用CDM培养基，对前步获得的293T细胞进行培养，直至获得用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞。根据本发明实施例的用于慢病毒包装的无血清培养293T细胞的方法，可以解决慢病毒包装过程中混入牛血清成分的问题，符合GMP制品要求。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105647852
【申请号】
【发明人】何昱, 栗红建, 何嵘, 姜冬冬
【申请人】北京普瑞金科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月30日