代表猴MeV病毒阴性血清抗体对 照，1代表1:50抗猴MeV病毒阳性血清，2-5分别代表抗猴1:25的BV、SRV1、SIV和STLV1病毒阳 性血清参照，6为roS对照，7-10分别代表1: 50的抗猴BV、SRV1、SIV和STLV1病毒阳性血清参 照。
[0023]图10为制备的猴MeV病毒抗体抗检测免疫梳的敏感性检验结果图， 其中，"+"代表1:50猴MeV病毒阳性血清抗体对照，代表猴MeV病毒阴性血清抗体对 照，1-9 分别代表 1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200 以及 1:6400倍的抗 猴MeV病毒阳性血清，10代表空白对照。
【具体实施方式】
[0024]实施例1 S0E-PCR引物的设计与合成 根据猴MeV病毒的基因序列，利用交叠延伸PCR(SOE-PCR)的原理设计S0E-PCR扩增引 物，引物序列如下所示： MeVF:5 '- GAATTCTGATCAAAGTGAGAATGAGCTCCCAAGTGATCAAA GTGAGAATGAGCTCCCAA -3， MeVRl:5'_ GAGCTCATTCTCACTTTGATCACTTGGGAGCTCATTCTCA -3' MeVR2:5 '- CTCGAGCTTGGGAGCTCATTCTCACTTTGATCACTTGG GAGCTCATTCTCACTTTGATC -3 ' 实施例2猴MeV病毒MeV32基因的克隆和测序 (1)猴MeV病毒MeV32基因的克隆 以实施例1设计合成的引物进行S0E-PCR，PCR反应体系如下： 第一轮PCR反应条件： 将混合液在95 °C预变性5 min，94 °C变性1 min，60 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，15 个循环，72 °C总延伸10 min。
[0025] 上述混合液如下所示：
第二轮PCR反应条件： 将混合液在95 °C预变性5 min，94 °C变性1 min，63 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，30 个循环，72 °C总延伸10 min。
[0026] 上述混合液如下所示:_
' 经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，如图/所示，表明实验获得了与预期相符的特异胃 DNA片段。
[0027] (2) PCR产物的回收 用DNA回收试剂盒回收交叠式PCR扩增产物。具体操作见试剂盒说明书。
[0028] (3)克隆载体的构建及基因测序 将回收的PCR产物连接PMD18-T载体，并将其转化到DH5a感受态细胞中，在含氨苄青霉 素的LB培养基平皿中培养18 h，挑取单个菌落，37 °C、200 r/min震荡培养至OD600为0.5-1 时，用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，经酶切鉴定的阳性质粒送生工生物工程股份公司测 序。将测序正确的阳性质粒命名为PMD18T- MeV。
[0029] 实施例3表达载体的构建 利用EcoRI与Xhol分别将pMD18T- MeV和pGEX-4T-l进行双酶切，并胶回收酶切的目的 片段。将回收的目的片段进行连接，连接体系如下所示：
16 °C过夜连接。
[0030] 将连接产物转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性 菌落，并提取质粒进行Pvul酶切鉴定。结果如图2所示。将鉴定阳性的质粒命名为pGEX-4T-MeV〇
[0031] 实施例4目的基因的表达及分析 (1)目的基因的诱导表达 取重组阳性菌株10 yL接种到5 mL含有25 yg的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C、 200 r/min摇菌培养至对数期0D6Q()为0.5-1.0值时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG继续同 条件下诱导培养5 h。
[0032] (2)目的基因的分析 参照《分子克隆实验指南》(第三版），对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测。将诱导后和 对照组的菌液分别1 2000 r/min离心1 min收集菌体，用等体积2倍蛋白电泳上样缓冲液 悬浮菌体后，置沸水浴中煮5-10 min，以5 %的浓缩胶和12 %的分离胶进行SDS-PAGE分析表 达情况。结果如图3所示。目的基因获得了表达。
[0033]实施例5目的蛋白的纯化与定量 采用KC1染色切胶纯化方法进行表达产物的纯化。将诱导后的重组菌PGEX-4T- MeV / BL2UDE3)进行SDS-PAGE电泳，然后用0.25 mol/L的KC1溶液染色胶片5 min，小心切下染成 银白色的目的条带并用PBS洗3次，最后将胶条碾碎后置于EP管中，加 500 yLPBS振荡混匀，_ 20 °C反复冻溶3次，12 000 r/min离心2 min，取上清即为纯化的融合表达蛋白。纯化后的 蛋白如图4所示。采用BAC方法进行蛋白定量，并分装于-20°C保存备用。
[0034] 实施例6 Western-blot确定最佳抗原包被量 固定阳性血清浓度（1:50)，将纯化定量后的目的蛋白调整至1 mg/mL作为起始检测量， 进行1(^-106梯度稀释包被NC膜，然后进行Western-blot分析，筛选最佳抗原包被量。
[0035] 先将纯化蛋白分别进行SDS-PAGE电泳，再并按常规方法进行蛋白转印。将电转后 NC膜置于5 % BSA封闭液(PBS-T)中，37 °C摇动封闭2 h，用TBS-T洗膜3次后，加阳性血清 (一抗)37 °C摇动孵育1 h;取出，用TBS-T洗5次，加入碱性磷酸酶标记兔抗猴IgG二抗溶液 (Rabbit Anti-monkey IgG/AP，l:500 稀释），37 °C 摇动孵育 1 h，用TBS-T洗5次。将NC膜 浸入碱性磷酸酶显色底物液(BICP/NBT，Schleicher and Schuell公司）中，静止，闭光显色 lmin后每隔30s观察一次，至条带明显或本底出现时终止显色，用去离子水漂洗后置吸水纸 上晾干观察、拍照记录结果。如图5所示，最大检测极限为10 3稀释倍数的量浓度。从肉眼可 见度判定，以101稀释倍数的量浓度(〇. 1 mg/mL)确定为最佳包被量。
[0036] 实施例7表达蛋白的Western-blot特异性检测 以上述抗原最佳包被量〇. 1 mg/mL为标准，进行表达蛋白的特异性检验。选择将五种猴 病毒（猴B病毒、猴SIV、猴SRV1、猴STLV1、猴MeV)阳性血清分别交叉用作待检一抗进行 Western-blot特异性检测。如图6所示，重组猴MeV病毒MeV32能够特异性地识别猴MeV病毒 阳性血清而不与其它参考的猴病毒阳性血清发生交叉反应，说明重组猴MeV病毒MeV32蛋白 特异性良好，达到了预期要求。
[0037] 实施例8重组猴MeV病毒MeV32蛋白抗原敏感性分析 将猴MeV病毒阳性血清进行2倍倍比稀释（1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800)，以 纯化回收的重组猴MeV病毒MeV32蛋白以0.1 mg/mL量浓度的最佳包被量进行Western-blot 敏感性分析。如图7所示，重组猴MeV病毒MeV32蛋白能够敏感地检测到1:100倍稀释的猴MeV 病毒阳性血清，由此说明重组猴MeV病毒MeV32蛋白敏感性良好，达到了预期要求。
[0038]实施例9免疫梳检测试纸的制备 根据上述试验方法确定的抗原最佳包被浓度参数，将猴MeV病毒抗原蛋白进行线性包 被NC膜，将膜晾干。用5 % BSA封闭液封闭NC膜过夜，弃去封闭液后再次晾干。将包被好的NC 膜裁剪成10.5 X 4 mm标准尺寸的试纸条，依次按4.5 mm间距整齐固定于150 X 1 mm的 PVC板上，十二条为一组或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳，最终于自封袋中4 °C保存备 用。具体制备的流程如图8所示。
[0039] 实施例10免疫梳的使用方法与判定方法 将1:25倍稀释的待检血清样品转移至96孔酶标反应板中，标记顺序号。将免疫梳检测 齿依次伸入各反应孔内的血清液面之下，以37 °C条件下轻轻震荡作用30-60 min。取出免 疫梳用TBS-T缓冲液冲洗免疫梳三次、每次3-5 min;同时将稀释好的碱性磷酸酶标记兔抗 猴二抗(1:500)溶液顺次加入另一排酶标反应板孔中（2 300 μL7孔），将洗过的免疫梳依次 伸入各反应孔中、37 °C条件下轻轻震荡作用30-60 min;取出免疫梳按上述方法冲洗3次后 置于干净的方盒中加入显色液，静止、闭光显色1-15 min，最后用蒸馏水冲洗免疫梳并观察 记录反应结果。上述操作过程中设立阳性对照与阴性对照各1孔。判定方法如下：（1)阳性对 照免疫梳齿上有明显的肉眼可见反应条带(蓝紫或黑色)且阴性对照梳