齿上无反应条带，说 明检测有效，在此基础上进行下一步待测样品的判定；（2)待测样品检测的免疫梳齿上与阳 性对照梳齿上相同位置处出现可见反应条带的判定为阳性检测结果，若待测样品检测的免 疫梳齿上无反应条带出现则判定为阴性检测结果。
[0040] 实施例11猴MeV病毒血清抗体免疫梳检测的特异性与敏感性分析 先将10倍样品稀释液用去离子水稀释至1倍工作浓度，然后放于EP管中，依次分别以1: 50稀释阳性、阴性以及待检血清至EP管中各0.5 mL作为一抗，室温放置备用。将阳性对照 和阴性对照血清进行1:50倍稀释各0.5 mL，再将猴MeV病毒阳性血清1:25-1:6400倍稀释用 于敏感性检验；将其它猴病毒(SRV1、SIV、STLV1和MeV)阳性血清稀释1:25倍和1:50倍用作 特异性检验;然后将各稀释血清样品依次转移至96孔酶标反应板中（2 300 μ!7孔），标记顺 序号。取免疫梳依次插入各反应孔内的血清液面之下，以37 °C条件下轻轻震荡作用30-60 min。取出免疫梳用TBS-T缓冲液冲洗免疫梳三次、每次3-5 min，然后放置于吸水纸上吸干。 用样品稀释液将碱性磷酸酶标记兔抗猴二抗（1:500)稀释，并顺次加入另一排酶标反应板 孔中（2 300 yL /孔），将免疫梳依次伸入各反应孔中、37 °C条件下轻轻震荡作用30-60 min。取出免疫梳按上述方法冲洗5次，然后放置于吸水纸上吸干。将BCIP/NBT显色片剂一片 溶于30 mL去离子水中溶解后。取10 mL显色液加入一干净方盒中，然后将免疫梳浸于显色 液中，静止、闭光显色1-15 min，最后用蒸馏水冲洗终止显色，并观察记录免疫梳上反应结 果。
[0041 ]特异性检验结果如图9所示，猴MeV病毒抗体免疫梳均能够特异性检测到猴MeV病 毒的阳性血清而不与其它病毒阳性血清间发生交叉反应，由此说明设计制备的猴MeV病毒 免疫梳特异性良好。
[0042]敏感性检验结果如图10所示，猴MeV病毒抗体免疫梳的最大血清阳性检测稀释度 为1:100,说明设计制备的猴MeV病毒免疫梳敏感性良好达到了预期。
[0043]实施例12免疫梳的重复性与稳定性检测 (1)免疫梳的重复性检测 在同一批试验中每份样品平行作3次(批内），在3个不同试验日重复测定6份样品（批 间）。分别统计分析批内和批间重复试验变异系数情况。结果显示，批内重复试验变异系数 (CV)小于7 %，批间重复试验CV小于10 %。说明免疫的重复性良好。
[0044] (2)免疫梳的稳定性检测 将同一批次3条4 °C保存，分别在1、3和6个月的间隔与新制备的免疫梳同时对猴MeV病 毒的阴、阳性血清进行检测，统计分析免疫梳的特异性与敏感性没有明显变化，并再次对同 一份样品平行作3次进行比较分析其稳定性。结果显示，免疫梳的特异性与敏感性没有明显 变化，对同一份样品平行作3次进行比较，CV均小于10 %。说明免疫梳的稳定性良好。
【主权项】
1. 一种用于构建猴MeV病毒抗体的免疫梳的SOE-PCR引物组，其特征在于，引物MeVF:如 序列表Seq No.1所示，引物MeVRl:如序列表Seq No.2所示，引物MeVR2:如序列表Seq No.3 所示。2. -种用于制备猴MeV病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-MeV，其特征在于， 序列如序列表Seq No.4所示。3. -种用于制备猴MeV病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-MeV的构建方法，其 特征在于，包括如下步骤： (1) 根据猴MeV病毒的基因序列，设计SOE-PCR扩增引物，引物MeVF:如序列表Seq No. 1 所示，引物MeVRl:如序列表Seq No.2所示，引物MeVR2:如序列表Seq No.3所示； (2) 进行SOE-PCR扩增猴MeV病毒基因； (3) 猴MeV病毒基因的回收； (4) 克隆质粒pMDlST-MeV的构建及测序； (5 )表达载体pGEX-4T-MeV的构建，序列如序列表Seq No. 4所示。4. 根据权利要求3所述的一种用于制备猴MeV病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-MeV的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)采用SOE-PCR反应的具体步骤如下： 第一轮PCR反应条件： 将混合液在95 °C预变性5 min,94 °C变性1 min,60 °C退火30 S，72 °C延伸1 min, 15 个循环，72 °C总延伸10 min; 上述混合液如下所示：第二轮PCR反应条件： 将混合液在95 °C预变性5 min,94 °C变性1 min,63 °C退火30 S，72 °C延伸1 min,30 个循环，72 °C总延伸10 min; 上述混合液如下所示：5. 根据权利要求3所述的一种用于制备猴MeV病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-MeV的构建方法，其特征在于，所述的步骤巧)pGEX-4T-MeV的构建方法具体步骤如下:利 用EcoRI与化〇1分别将pMDlST-MeV和PGEX-4T-1进行双酶切，并胶回收酶切的目的片段，将 回收的目的片段进行连接，将连接产物转化到化21(DE3)pLysS感受态细胞中，利用氨节青 霉素抗性筛选阳性菌落，并提取质粒进行PvuI酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒命名为pGEX- 4T-MeV。6. -种猴MeV病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) W重组表达载体pGEX-4T-MeV表达猴MeV病毒蛋白； (2 )猴MeV蛋白的纯化与定量； (3 )免疫梳检测试纸的制备： (3.1) 将步骤（1)中表达的猴MeV病毒蛋白Wo. 1 mg/mL的浓度进行线性包被NC膜，将膜 惊干； (3.2) 用0.05g/mL的BSA封闭液封闭NC膜过夜，弃去封闭液后再次惊干； (3.3) 将包被好的NC膜裁剪成标准尺寸的试纸条，依次按一定间距整齐固定于PVC板 上，十二条为一组或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳检测试纸，最终于自封袋中低溫保 存备用。7. 根据权利要求6所述的一种猴MeV病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法制备的一 种猴MeV病毒抗体的免疫梳检测试纸。8. 根据权利要求7所述的一种猴MeV病毒抗体的免疫梳检测试纸，其特征在于，其检测 方法如下： (1) 将1:25倍稀释的待检血清样品转移至96孔酶标反应板中，标记顺序号； (2) 将免疫梳检测齿依次伸入各反应孔内的血清液面之下，37 °C轻轻震荡30-60 min; (3) 取出免疫梳用TBS-T缓冲液冲洗S次，每次3-5 min,同时将稀释好的碱性憐酸酶标 记1:500兔抗猴二抗溶液顺次加入另一排酶标反应板孔中，每孔含300 yL，将洗过的免疫梳 依次伸入各反应孔中，37 °C震荡30-60 min; (4) 取出免疫梳按上述方法冲洗3次后置于干净的方盒中加入显色液，静止、闭光显色 1-15 min,最后用蒸馈水冲洗免疫梳并观察记录反应结果； 巧)上述操作过程中设立阳性对照与阴性对照各巧L; (6) 阳性对照免疫梳齿上有明显的肉眼可见反应条带，蓝紫或黑色，且阴性对照梳齿上 无反应条带，说明检测有效，在此基础上进行下一步待测样品的判定； (7) 待测样品检测的免疫梳齿上与阳性对照梳齿上相同位置处出现可见反应条带的判 定为阳性检测结果，若待测样品检测的免疫梳齿上无反应条带出现则判定为阴性检测结 果。9. 根据权利要求7所述的一种猴MeV病毒抗体的免疫梳检测试纸在检测猴MeV病毒抗体 中的应用。
【专利摘要】本发明主要涉及到一种猴MeV病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。用于制建免疫梳的重组质粒pGEX-4T-？MeV，如序列表Seq？No.4所示。用于构建重组质粒的引物对，上引物MeVF：如序列表Seq？No.1所示；下引物MeVR1：如序列表Seq？No.2所示；下引物MeVR2：如序列表Seq？No.3所示。构建方法，包括如下步骤：根据猴MeV病毒的核苷酸序列设计SOE-PCR引物对；进行SOE-PCR扩增猴MeV基因；构建重组质粒pGEX-4T-？MeV。最后利用酶联免疫原理和膜层析技术制成快速检测实验猴血液或血清中的抗体的免疫梳。免疫梳具有良好的稳定性、特异性、敏感性及重复性。
【IPC分类】C12N15/11, G01N33/52, G01N33/68, C12N15/66, C12N15/70, G01N33/569
【公开号】CN105647916
【申请号】
【发明人】李丹丹, 徐义刚, 高慎阳, 王昱
【申请人】海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月17日