一种骨质疏松血液检测靶点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种骨质疏松血液检测靶点及其应用，更具 体的涉及骨质疏松血液检测靶点CCDC91及其应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症(Osteoporosis)是以骨生成减少、骨吸收增加为特征，骨骼脆性增加 及易发生脆性骨折的全身性疾病，主要临床表现为:躯体疼痛、身高短缩、驼背、尤其老年人 容易脆性骨折，特别是股骨近端骨折等，骨密度值下降目前也是骨质疏松症的诊断标准之 一。骨质疏松症随年龄的增大，其发病率逐渐增加，由于受我国人口基数大、人口老龄化、环 境污染、生活饮食习惯变化等影响因素，骨质疏松症发病率呈逐年上升趋势，且发病年龄有 所提前。骨质疏松性骨折是老年骨质疏松症最严重后果，容易造成老年人髓部骨折、椎体压 缩骨折等疾病，其发病率高，手术风险大，效果欠佳，是造成老年人致残和致死的重要原因 之一，并且给社会增加了沉重的经济负担。
[0003] 目前对骨质疏松的治疗措施主要分为基础措施和药物治疗两个方面。基础治疗措 施中主要是补充钙剂和维生素 D。药物治疗主要包括抗骨吸收药物、促骨形成药物和其他药 物。但由于对骨质疏松的发病机制并不完全清楚，所以当前对于骨质疏松的治疗并不理想。 因此，进一步研究骨质疏松形成的分子机制以及寻求更好的治疗方法，降低骨折发病率和 提高生活质量是当前骨质疏松治疗研究的重点。
[0004] 为解决目前骨质疏松分子标记物稀缺的问题，发明人对9例骨质疏松外周血样本 及6例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法分析进行致病靶点基 因的筛选，挑选出候选基因 CCDC91，进一步，通过实验证实了 (XDC91基因与骨质疏松具有很 好的相关性，为临床诊断提供后备靶点，发明同时设计了针对CCDC91的高效干扰RNA，为后 期的基因治疗打下基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供CCDC91基因和/或其表达的蛋白在制备抗骨质疏松制剂 和/或骨质疏松诊断制剂中的应用。
[0006] 本发明的目的在于提供检测CCDC91基因和/或其表达蛋白的制剂在制备骨质疏松 诊断制剂中的应用。
[0007] 进一步，骨质疏松诊断制剂检测外周血中CCDC91基因和/或其表达蛋白的表达情 况。
[0008] 进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测 外周血中(XDC91基因和/或(XDC91蛋白的表达。
[0009] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[00?0] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;三是可同时检测多种疾病。
[0011] 所述的用于荧光定量PCR方法检测骨质疏松中CCDC91基因的产品含有一对特异性 扩增CCDC91基因的引物;所述的基因芯片包括与CCDC91基因的核酸序列杂交的探针。
[0012] 进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用免疫方法检测CCDC91蛋白的表达。优 选所述免疫检测方法检测骨质疏松中(XDC91蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/胶 体金检测方法。优选的，一对特异性扩增(XDC91基因的引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1， 下游引物序列为SEQ ID NO.2。
[0013] 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA JLISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。
[0014] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的 抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集 在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
[0015 ]进一步，所述检测CCDC91蛋白的EL ISA法为使用EL ISA检测试剂盒。所述试剂盒中 的抗体可采用市售的CCDC91单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被CCDC91单克隆抗 体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止 液等。
[0016]进一步，所述检测CCDC91蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的CCDC91单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 CCDC91单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0017] 本发明的目的在于提供一种检测骨质疏松的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒检测基因 CCDC91，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
[0018] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0019] 进一步，上述焚光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、焚光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.1， 下游引物序列为SEQ ID NO. 2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3,下游引物序列为SEQ ID NO.4。
[0020] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TR Izol? Reagent进行样本RNA提取。
[0021] 本发明目的是提供了一种骨质疏松检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测CCDC91蛋 白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0022] 本发明目的是提供了一种检测骨质疏松的基因芯片，所述的基因芯片包括与 (XDC91基因的核酸序列杂交的探针。
[0023]本发明的目的在于提供CCDC91基因和/或其蛋白抑制剂在制备抗骨质疏松制剂中 的应用。
[0024]为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 CCDC91，继而通过分子生物学方法验证了 CCDC91与骨质疏松的关系：(XDC91与骨质疏松 具有很好的相关性，可用于制备抗骨质疏松制剂和/或骨质疏松诊断制剂，具有重要的临床 应用价值。
[0025]进一步，所述抗骨质疏松制剂是指可以抑制CCDC91基因的表达的制剂。本领域人 员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种:通过激活CCDC91基因 的抑制基因、激活(XDC91基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制(XDC91基因表 达、激活促进CCDC91基因 mRNA降解的mi croRNA、导入促进(XDC91基因编码蛋白降解的分子、 抑制促进CCDC91基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活CCDC91基因的抑制基因、激活 抑制CCDC91基因表达的蛋白、导入抑制(XDC91基因表达的s iRNA、激活促进CCDC9 ImRNA降解 的mi croRNA、导入促进CCDC91蛋白降解的分子、抑制促进CCDC91基因表达的因子及蛋白的 表达。
[0026] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RN