环境土壤中抗生素的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测抗生素的领域，特别是涉及一种在土壤和底泥样品中测定22种抗 生素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 药物和个人护理品（Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)包 括治疗疾病、保障健康的人用和兽用药物，洗浴、护肤等个人护理用品以及香薰、消毒剂等 日用化学品，是一类对生态环境和人体健康具有潜在危害的新兴污染物，其环境存在、风险 评价和毒理学等方面的研究引起了环境科学领域的广泛关注。环境中PPCPs的来源非常广 泛，制药厂、医院、畜禽养殖场、人类日常生活产生的废水和固体废物中都含有大量的 PPCPs，并以污水、固体废物等形式进入环境。抗生素作为PPCPs的一类，被广泛应用于畜牧 养殖、水产养殖等领域，进入动物体内的抗生素绝大部分随排泄物进入土壤，极易造成土壤 抗生素的污染。
[0003] 在目前的相关研究中，抗生素通常使用超声提取、固相萃取和液相色谱串联质谱 (SPE-LC-MS/MS)法分析，方法主要基于EPA 1694优化获得。现有的检测法规和大多数实验 室，均使用典型的内标法对几种或十几种目标物进行分析，内标和目标物之间存在结构和 性质差异，在前处理过程中的损耗、色谱保留行为及响应强度均存在较大差异，导致分析方 法检出限较高、稳定性较差，无法对低浓度抗生素准确定量。并且一些抗生素本身具有稳定 性差的特点，使用内标法进行测定时，样品的保存时间较短，对分析测定要求较为苛刻:采 集的样品需避光低温保存，尽量在3天内完成前处理、45天内完成仪器分析测定。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种环境样品中22种抗生素的分析方法，可以准 确测定环境样品中的抗生素含量，并有效补偿抗生素因降解而导致的浓度变化。从而解决 现有的测定方法无法准确测定环境样品中的抗生素含量和延长保存时间的问题。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明引入更多的同位素内标，改进原有分析方法，建立多 同位素内标的分析方法，做到大多数目标物都有对应的同位素标记物作为内标，对应无法 购买同位素标记物的目标物，选择结构、性质相近物质的同位素标记物作为内标。建立灵敏 度更高、检测限更低、稳定性更强的多同位素内标的分析方法。本发明的目的在于提供一种 土壤环境样品中抗生素的测定方法，其特征在于，包括样品提取步骤、富集净化步骤、分离 净化步骤、分析检测步骤，其中，所述的样品提取步骤还包括加入N种同位素净化内标以及 13C内标提取液的步骤，其中N为1以上22以下的整数，优选4~22，更优选4~16。
[0006] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的样品提取步骤包括向样品中加入磷 酸盐缓冲盐，调节pH后加入提取内标液后;再加入乙腈重复超声提取，合并提取液，旋蒸浓 缩。
[0007] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的富集净化步骤为将提取液用超纯水 稀释、玻璃纤维滤纸过滤后，用固相萃取柱富集，优选亲水亲脂型固相萃取小柱。
[0008] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的富集净化步骤中，富集前将小柱用甲 醇、高纯水、PH4~5的高纯水淋洗。
[0009] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述分析检测步骤采用HPLC-MS/MS仪器，对 所述净化试样进行分析测定。
[0010] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的分析检测步骤还包含:将得到的所述 净化试样经浓缩后体积比为1:4的甲醇/水定容至500yL，加入 13C-AtraZine的进样内标后涡 旋混合均匀，用0.22μπι的尼龙针筒过滤器过滤后，作为待仪器检测的净化试样。
[0011]本发明所述的测定方法，其特征在于，所述分析检测步骤还包括采用HPLC-MS/MS 仪器对所述净化试样分别进行分析测定，采用的测定参数为：
[0012] HPLC检测条件为进样体积10yL;柱温40°C，色谱柱为C18液相色谱柱，规格为3.5μπι X 3.0mmX 150mm，流动相为含0.01 %甲酸的高纯水和乙腈，流速为0.40mL/min，质谱条件为 电喷雾电离源ESI，多反应监测模式MRM。本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的抗生 素选自磺胺类、解热止痛药、四环素类、青霉素类、大环内酯类、林可酰胺类中任意一种以 上。
[0013] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述抗生素为，磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲 基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺 胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶、对乙酰氨基酚、四环素、金 霉素、青霉素 G、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰乐菌素、克林霉素、林可霉素。
[0014] 本发明所述的测定方法，其特征在于，所述环境样品为土壤和底泥样品中的任一 种。
[0015] 本发明通过如下技术方案予以实现。
[0016] -种环境样品中抗生素的测定方法，具有如下步骤：
[0017] (1)样品提取步骤:称取一定量冻干研磨后的样品，加15mL磷酸盐缓冲盐，用NaOH 或HC1溶液调节pH至4~5后，加入同位素提取内标液;再加入20mL乙臆后，超声重复提取二 次，合并提取液，旋蒸浓缩。
[0018] (2)富集净化步骤:将上述所述提取液用超纯水稀释、玻璃纤维滤纸450°C灼烧4小 时过滤后，用亲水亲脂型固相萃取柱富集，得到含有抗生素的萃取小柱;富集净化还包括富 集前萃取柱使用前依次用10mL甲醇、6mL高纯水、pH=4~5的高纯水6mL淋洗，富集小柱规格 为200mg，6mL固相萃取柱优选亲水亲脂型固相萃取小柱。
[0019] (3)分离净化步骤:将所述含有抗生素的萃取小柱，用10mL高纯水清洗，抽真空至 填料完全干，再加入8mL甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，浓缩定容后得到净化 试样；将得到的所述净化试样经浓缩后体积比1:4的甲醇/水定容至500yL，加入 13C-Atrazine的进样内标后涡旋混合均匀，用0.22μπι的尼龙针筒过滤器过滤后，作为待仪器检 测的净化试样;采用的是氮吹浓缩至恰好吹干，干浴温度为35°C。
[0020] (4)分析检测步骤:采用HPLC-MS/MS仪器，对所述净化试样进行分析测定，采用的 测定参数为:HPLC检测条件为进样体积10yL;柱温40°C，色谱柱为C18液相色谱柱，规格为 3.5μηι X 3.0mm X 150mm，流动相为含0.01 %甲酸的高纯水和乙腈，流速为0.40mL/min。质谱 条件为电喷雾电离源ESI，多反应监测模式MRM。通过各目标物的保留时间、定性离子对进行 定性分析;通过同位素的峰面积比值进行定量分析，得出对所述净化试样中抗生素含量的 测定结果。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] (1)由于目标物和对应的同位素内标具有近乎完全相同的化学性质和状态，在样 品过滤、净化、浓缩等前处理过程中，同位素标记物和目标物具有相同的损耗特性，可以有 效补偿抗生素因降解而导致的浓度变化，延长了样品的保存时间；
[0023] (2)仪器测定时，两者在色谱柱中的吸附行为、在质谱中的响应强度同样具有很好 的一致性，尤其在对低浓度样品测定时，即使存在较高的仪器噪音或者背景干扰，两者的仪 器响应强度和浓度之间仍然具有较好的对应关系，有效降低了仪器和基质干扰对测定结果 的影响，提高了低浓度样品的检测准确度，降低了方法检测限。
[0024] (3)通过采用冊^：-13/^3仪器，可以对地表水和地下水中22种抗生素中的一种或 多种，即对磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲 氧哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺 间甲氧嘧啶、对乙酰氨基酚、四环素、金霉素、青霉素 G、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰乐菌 素、克林霉素、林可霉素同时进行测定，定量精准，灵敏度高。
【附图说明】
[0025]图1为测定方法流程图；
[0026]图2为净化试样测定的色谱图
【具体实施方式】
[0027] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术 人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0028] 本发明实施例提供一种环境样品中抗生素的测定方法，是一种对土壤和底泥中抗 生素含量测定的方法，如图1所示，该方法包括以下步骤：
[0029] (1)样品提取步骤:称取一定量冻干研磨后的样品至于50mL PP离心管中，加15mL 磷酸盐缓冲盐，用NaOH或HC1溶液调节pH至4~5,加入50ngl3C标记的提取内标液，混合均 勾，老化30min;加入20mL乙腈，祸旋、超声30min，离心后取上清液;重复提取三次，合并提取 液，35°C以下旋蒸至20~30mL。
[0030] (2)富集净化步骤:将上述所述提取液用超纯水稀释至500mL，盛放于棕色玻璃材 质或高密度聚乙烯(HDPE)材质的采水瓶(使用前用高纯水和甲醇清洗并晾干）中，将稀释液 用玻璃纤维滤纸(450 °C灼烧4小时)过滤;NaOH或HC1溶液调节pH至4~5;依次用10mL甲醇、 6mL高纯水、6mL高纯水(pH=4~5)冲洗固相萃取小柱，达到活化填料和去除杂质的目的；将 过滤后的稀释液通过小柱，流速控制在5-1 OmL/min;随后用1 OmL高纯水清洗小柱，抽真空至 填料完全干(约需1-2小时）。
[0031] (3)分离净化步骤:用4mL甲醇洗脱小柱两次