一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于饲料添加剂中成分分析检测技术领域，具体涉及一种饲料添加剂中纽 甜含量的高效液相色谱测定方法。
【背景技术】
[0002] 高效液相色谱法是一项高压、高效、高灵敏度的分离技术，可用于分离分析高沸 点、相对分子量大、难挥发的有机化合物，广泛应用于化学、化工、高分子、生物、食品、医药 等领域。
[0003] 纽甜，化学名称是N-[N-(3,3-二甲基丁基）-L-a-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲 酯，白色结晶粉末，含约4.5%的结晶水，是一种功能性甜味剂，其具有纯正的甜味，甜味协 和，十分接近阿斯巴甜，没有其他强力甜味剂常带的苦味和金属味，甜度比蔗糖甜7000~ 13000倍，比阿斯巴甜甜30~60倍，纽甜在常温(25°C)下水中的溶解度为12.6g/L，此溶解度 能完全满足正常的生产需要。
[0004] 在饲料添加剂领域，纽甜纯净的甜味，没有苦、涩、金属的异味，可有效地遮蔽糖精 的后苦等特征，因而纽甜可用于配制饲料甜味剂，通常将纽甜以及其他有效成分加入到二 氧化硅和/或蛭石等载体中混合均匀制备成所需产品。然而，目前饲料添加剂中纽甜含量的 检测没有国家标准，也没有现成的方法。《GB/T 29944-2013食品安全国家标准食品添加剂 纽甜》规定了食品中纽甜含量的检测方法，但其不适用于混合型饲料添加剂中纽甜含量的 检测，该标准适用于以阿斯巴甜和3,3_二甲基丁醛为主要原料，在氢气存在下甲醇溶液中 进行反应而制得的纽甜，采用高效液相色谱法外标单点进行定量，适用于大浓度下纽甜含 量的检测，而饲料添加剂中纽甜含量低，采用该标准检测产生的误差大，故不能用于饲料添 加剂中甲酸的定量测定。《GB/T 23378-2009食品中纽甜的测定方法高效液相色谱法》，该标 准提供了一种定量检测纽甜的方法，但该方法在样品处理过程中采用固相萃取柱，过程复 杂，工作量大，不适用于大批量检测;流动相采用走梯度方式，液相采用二元栗，而对于液相 只有单栗的企业，并不适用。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：怎样提供一种饲 料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，使其能够对饲料添加剂中纽甜含量进行精 准定量，且具有无需进行复杂的前处理、检测灵敏、高效、准确和稳定的特点。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种饲料添加剂中纽甜含量 的高效液相色谱测定方法，包括如下步骤：
[0007] 1)配制梯度浓度的纽甜标准溶液;所述纽甜标准溶液以水作为溶剂；
[0008] 2)采用液相色谱法对步骤1)配制的纽甜标准溶液进行检测，计算得到纽甜出峰的 峰面积，以纽甜标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线;其中，色谱条件 为采用C 18液相色谱柱，检测波长210nm，流动相为pH 3.5~4.0的庚烷磺酸钠、三乙胺和乙腈 的混合水溶液，庚烷磺酸钠、三乙胺、乙腈和水的质量体积比为2.6~3.4g:3~4.5mL:300~ 450mL：500-650mL；
[0009] 3)将饲料添加剂加入水中，并进行超声处理，得到样品处理液；
[0010] 4)将步骤3)得到的样品处理液在与步骤2)相同的液相色谱条件下进行检测，计算 得到纽甜出峰的峰面积，根据步骤2)建立的标准曲线计算出样品处理液中纽甜的浓度，并 结合所述样品处理液的体积和样品重量，计算出所述饲料添加剂中纽甜的含量。
[0011]相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0012] 1、饲料添加剂中纽甜含量较少，针对现有的国家标准仅适用于大浓度下纽甜含量 的检测，而并不适用于饲料添加剂中纽甜含量的检测，且前处理方法过于繁琐等不足之处， 本发明考虑到纽甜的特性，并根据饲料添加剂样品中各成分组成的性质，选择C 18柱作为固 定相，并通过创造性的研究得出适用于本发明饲料添加剂分离的色谱条件，使得各成分在 该色谱条件下能充分分离开，在检测波长210nm条件下纽甜能够稳定出峰，相较于现有技术 更短时间内即可出峰，出峰不会拖尾、重叠，不会有干扰峰出现，进而使本发明检测结果精 确，可靠性高。
[0013] 2、本发明先对不同浓度的纽甜标准溶液进行检测，避免了单点计算带来的误差， 进而使检测结果更加准确、可靠，制得的标准曲线相关系数更高，为后续样品的检测奠定了 可靠的定量基础。
[0014] 3、本发明无需进行复杂的样品前处理，只需采用纯水并结合超声处理对饲料添加 剂中纽甜进行提取即可，前处理过程更加简单，本发明还研究出提取过程中最佳料液比和 超声时间，在此条件下纽甜提取最完全，能够保证良好的提取效果，进而使检测结果更加准 确。
[0015] 4、本发明检测方法使用的设备和试剂均为通用设备，适用于饲料厂、饲料添加剂 厂进行大批量自检，具有良好的应用推广前景。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明检测方法纽甜标准曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以 本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，来说明本发明 具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
[0018] 本实施例主要设备有分析天平、高效液相色谱和一些常见实验室玻璃仪器;所用 的试剂有色谱纯级乙腈、色谱纯级庚烷磺酸钠、色谱纯级三乙胺、磷酸和纽甜标准品，所用 水为纯水。
[0019] -、一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，包括如下步骤：
[0020] 1)以水作为溶剂，配制梯度浓度的纽甜标准溶液；
[0021] 2)采用液相色谱法对步骤1)配制的纽甜标准溶液进行检测，计算得到纽甜出峰的 峰面积，以纽甜标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线;其中，色谱条件 为采用C 18液相色谱柱，检测波长210nm，流动相为pH 3.5~4.0的庚烷磺酸钠、三乙胺和乙腈 的混合水溶液，庚烷磺酸钠、三乙胺、乙腈和水的质量体积比为2.6~3.4g:3~4.5mL:300~ 450mL：500-650mL；
[0022] 3)将饲料添加剂加入水中，并进行超声处理，得到样品处理液；
[0023] 4)将步骤3)得到的样品处理液在与步骤2)相同的液相色谱条件下进行检测，计算 得到纽甜出峰的峰面积，根据步骤2)建立的标准曲线计算出样品处理液中纽甜的浓度，并 结合所述样品处理液的体积和样品重量，计算出所述饲料添加剂中纽甜的含量。
[0024] 上述步骤1)中为配制浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL的纽甜标准溶液。 这样，得到的标准曲线线性相关性更好，使得后续检测样品的计算结果更加准确。
[0025] 上述C18液相色谱柱规格为250mm长X 4.6mm内径，填料粒度为5μπι。
[0026] 上述步骤2)所述流动相配制过程中先将庚烷磺酸钠溶于水中，再加入三乙胺混合 均匀，用磷酸调节溶液的pH为3.0~3.5后，加入乙腈并用磷酸调节溶液pH至3.5~4.0，过滤 后备用。采用这种方法配制的流动相，溶液的均一性更好，性质更加稳定。
[0027] 上述液相色谱检测过程中控制柱温为室温，流动相流速为0.8~1.5mL/miη，进样 量为20~30yL。
[0028]上述步骤3)将饲料添加剂与水按照3~5g: 100mL的质量体积比混合，并进行超声 处理20~60min，得到样品处理液。这样的提取条件下，待测样品中的纽甜提取的更加完全， 检测结果更加真实可靠。
[0029] 上述混合型饲料添加剂为以二氧化硅和/或蛭石为载体的混合型饲料添加剂，特 别是指甜味剂。
[0030] 上述得到的样品处理液如果经过本发明液相色谱方法检测，检测的210nm处吸光 度值最大大于〇. 8，则对样品处理液进行一定的浓度稀释后再重新进行检测，这样检测结