一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测技术领域。更具体地，涉及一种食品中核苷酸的高效液相色 谱检测法。
【背景技术】
[0002] 核苷酸是构成核酸的成分，是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接 而成。核苷酸在人体内广泛分布，具有多种生物学功能。核苷酸发挥生理功能离不开五碳糖 的重要结构也即核苷。由于牛乳和母乳中的核苷酸质量浓度差距较大，母乳中含有多种核 苷和核苷酸，而牛奶中一般不含有，所以目前在乳制品中添加核苷酸主要用于婴幼儿配方 奶粉中。在婴儿配方奶粉中添加的核苷酸种类主要有以下5种:胞嘧啶核苷酸（cytidine， CMP);尿嘧啶核苷酸（uridine，UMP);腺嘌呤核苷酸（adenosine，AMP);鸟嘌呤核苷酸 (ganosine，GMP);次黄噪呤核苷酸（inosine，IMP);其主要生理功能是广泛参与人体的能量 代谢、蛋白质合成，具有提高各种酶的活性、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫功能的 作用。它们可促进神经细胞的生长发育，是与"神经生长因子"有关或者可以作为神经生长 物质利用的营养成分。核苷酸是婴儿的条件必需营养素，对婴儿的生长发育有重要的作用。 另外，一些临床上的研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉可减少腹泻的发生及促进较小 胎儿的生长发育。
[0003] 但是，人体对核苷酸的需求是有一定限度的，并非越多越好。我国还没有关于婴幼 儿食品和乳品中核苷的相关国家标准。目前，许多企业特别是国外独资或合资，以及我国大 型乳品企业的标准中核苷酸都作为重要指标，所以对婴儿配方奶粉和米粉产品中核苷酸的 质量监控极为重要，这就需要相应的检测技术支持。
[0004] 但是，目前我国对于婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定方法并未制定国家标准。 虽然目前有关核苷酸检测的报道较多，可检索到大量分析的报道，但食品分析集中在味精 和肉等方面，有些方法的前处理尚不成熟。而婴儿配方奶粉是婴儿食用辅食前的唯一食物， 对于其健康生长关系很大。目前报道的检测方法主要有比色法、离子交换色谱法、毛细管电 泳法、液相色谱法、液相色谱质谱联用法等。比色法应用较早，但需要排除干扰、操作烦琐。 离子交换色谱法、毛细管电泳法测定结果重现性不佳。液相色谱质谱联用法存在仪器价格 昂贵，基质干扰大、检测成本高的缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术中婴幼儿乳基制品和淀粉基制品中核 苷酸检测技术的缺陷和不足，提供一种检测奶粉和米粉中核苷酸的方法，该方法优化了前 处理方法，去除大量的杂质后，应用水相C-18柱，摸索采用最佳的流动相，有效将杂质与目 标化合物分开，使得婴幼儿配方奶粉中核苷酸检测的难题得以解决。
[0006] 本发明的目的是提供一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法。
[0007] 本发明另一目的是上述方法在检测食品(尤其是婴幼儿奶粉，如奶粉和米粉）中核 苷酸方面的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0009] -种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法，包括如下步骤：
[0010] S1.样品前处理：称取待测样品，加入水，调节pH至4~5，涡旋5~lOmin后，加入乙 醇溶液，蜗旋5~lOmin后8000~12000r/min离心5~15min，用乙醇溶液洗涤，55~70°C旋 干，用水定容，取〇. 5~2mL过0.22μηι滤膜于进样瓶中，供上机分析；
[0011] S2.进行高效液相色谱检测。
[0012] 优选地，步骤S1所述样品前处理是称取0.5g待测样品于50mL聚四氟乙烯离心管 中，加入10mL水溶液，用冰醋酸调节pH在4~5之间，涡旋5min后，加入40mL的乙醇溶液，蜗旋 5min后10000r/min离心10min，用乙醇溶液洗涤，60°C旋干，用5~10mL水定容，取lmL过0 · 22 Ml滤膜于进样瓶中，供上机分析。
[0013] 更优选地，60°C旋干后用5mL7K定容。
[0014] 优选地，步骤S1所述调节pH为用乙酸调节pH在4~5之间。更优选地，所述乙酸为冰 醋酸。
[0015] 优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测的色谱柱为SB-AQ柱。
[0016] 优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测的流动相为四丁基硫酸氢铵。
[0017] 优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测波长为254nm。
[0018] 优选地，所述高效液相色谱检测的柱温在60~70°C之间。
[0019] 优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测的样品上机时间为样品制备好之后的60~ 240小时，上机前样品需要冷藏保存。
[0020] 优选地，所述高效液相色谱检测的流动相的pH为2.75 ± 0.3。
[0021] 优选地，所述流动相在22±4°C下。
[0022]优选地，所述流动相的浓度为1.5mmol。
[0023] 优选地，所述食品为奶粉、米粉和/或奶米粉。
[0024] 本发明优化了前处理步骤，去除了大部分杂质干扰后，通过选择合适的柱子，优化 离子对试剂的浓度和pH后，获得了满意的除杂和回收率保持效果。该方法适用于奶粉和米 粉中核苷酸的检测。
[0025]本发明具有以下有益效果：
[0026] (1)本发明利用乙酸与乙醇作为共沉淀剂，应用SB-AQ柱和四丁基硫酸氢铵分离和 检测核苷酸，提出了一种新的婴幼儿食品尤其是奶粉和米粉中核苷酸的检测方法，该方法 可同时检测奶粉、米粉和奶米粉中的核苷酸，适合多种产品，适用范围广。
[0027] (2)本发明结果表明，5种核苷酸在10~1000mg/L范围内线性关系好，相关系数在 0.9999以上，平均回收率为82.44%~98.92%，方法的相对标准偏差为0.60%~2.27%，能 够满足日常检测需要。
[0028] (3)本方法有效消除了杂质对CMP的影响，获得了 CMP异构化的证据，解决了其它方 法无法准确测量CMP的难题。
【附图说明】
[0029]图1为直接应用乙酸沉淀后定容进行测试的结果。
[0030] 图2为乙酸与乙醇共沉淀处理后定容进行测试的结果。
[0031] 图3为应用甲醇作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0032] 图4为应用乙醇作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0033] 图5为应用乙醇作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0034] 图6为应用乙腈作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0035] 图7为应用3:1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0036] 图8为应用4:1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0037] 图9为应用5:1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0038]图10为应用6:1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
[0039] 图11为应用草酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
[0040] 图12为应用盐酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
[0041] 图13为应用甲酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
[0042 ]图14为应用乙酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
[0043]图15为流动相pH为2.5时的谱图。
[0044]图16为流动相pH为2.8时的谱图。
[0045] 图17为流动相pH为3.0时的谱图。
[0046] 图18为流动相pH为3.6时的谱图。
[0047]图19为液相中1 Ommo 1四丁基硫酸氢胺的米粉空白的谱图。
[0048]图20为液相中1.5mmol四丁基硫酸氢胺的米粉空白的谱图。
[0049] 图21为液相中lOmmol四丁基硫酸氢胺的奶粉空白的谱图。
[0050] 图22为液相中1.5_〇1四丁基硫酸氢胺的奶粉空白的谱图。
[0051] 图23为胞