一种水产品中生物胺的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种水产品中生物胺的快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 生物胺是一类具有生物活性的低分子含氮有机物，普遍存在于各类食品如发酵制 品、乳制品、酒类、水产品及其制品中，尤其在水产品最为突出。生物胺的存在不仅降低食物 品质，而且对人体的健康产生较大危害。常见的中毒现象有恶心、头晕、呼吸困难、脑出血 等，严重的甚至会危及生命。各种生物胺中毒性最大的是组胺，其次是酪胺。腐胺和尸胺虽 然本身毒性不大，但是可通过协同作用增强组胺毒性，危及人体健康。一些蛋白含量较高的 中上层鱼类如鲐鱼、鲭鱼、秋刀鱼等，若在其死后不加以合理控制，极易产生这些有毒的生 物胺，国内外报道的生物胺中毒事件多发生在此类鱼中。因此，为确保水产食品食用安全， 更好地检测水产品中生物胺的含量，亟需一种简单快速、绿色环保的检测方法。
[0003] 目前，水产品中生物胺的检测方法主要包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、酶联 免疫法以及薄层色谱法等。这些方法均有一定的应用，优缺点各异。目前应用最广的就是高 效液相色谱法，一般认为其分析准确、灵敏度高、可以进行定量分析，但其缺点在于一般都 需要大量有机溶剂进行洗脱，前处理过程比较繁琐，浪费大量人力物力;毛细管电泳法具有 高效快速、灵敏度高、仪器简单等优点，但相对而言难以分离中性物质，且检测限相对偏高； 酶联免疫法灵敏度高，方法简单，但其缺点也比较明显，如不能同时分析多种生物胺，在检 测过程中对结构类似的化合物容易发生交叉反应等;薄层色谱法费用低廉，但是精度不够， 操作麻烦。
[0004] 因此在食品加工和流通环节需要一种操作简单快速且绿色环保的检测方法，可以 对生物胺进行快速检测，以保障食品安全。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种水产品中生物胺的快速检测方法。 该方法采用固相微萃取技术结合气相质谱检测技术直接对水产品中的生物胺进行定量分 析。该方法首先将萃取头进行衍生化处理，而后对复杂水产品中的生物胺进行直接萃取，这 样不仅减少了有机溶剂的使用，同时简化了步骤。
[0006] 为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案： 一种水产品中生物胺的快速检测方法，具体包括以下步骤： (1) 从水产品中萃取生物胺，并将其制备成生物胺稀溶液； (2) 在固相微萃取萃取头上浸涂一层衍生化试剂； (3) 用步骤(2)处理后的萃取头直接衍生/萃取步骤（1)得到的生物胺稀溶液中的生物 胺，得到生物胺衍生物； (4) 将步骤(3)得到的生物胺衍生物利用气相质谱进行分析； (5) 根据内标化合物校正峰面积后，建立生物胺含量与生物胺衍生物峰面积定量关系 的标准曲线； (6)按照上述步骤(1)-(4)获得待测样品中生物胺衍生物的峰面积，根据步骤(5)生物 胺含量与生物胺衍生物峰面积的定量关系，计算得到水产品中生物胺的含量。
[0007] 由于生物胺的沸点通常较高，一般都要先采用衍生化的方法才能进行分析。但是 传统的衍生化过程要消耗大量有机溶剂，同时反应时间较长，还要辅以氮吹等一系列繁琐 的过程，耗时耗力。本实验仅需将萃取头浸在衍生试剂里lmin即可直接萃取生物胺，既节省 了衍生的反应时间又大大提高了检测的灵敏度。
[0008] 优选的，所述步骤(1)将萃取液得到的生物胺采用盐酸溶解，并将该溶液调节pH为 9-11〇
[0009] 优选的，所述步骤(1)的具体步骤为： a将水产品匀浆后称取5-20g，用5wt%三氯乙酸提取生物胺，将提取液用5wt%的三氯乙 酸稀释后滤纸过滤； b采用正己烷对滤液进行除脂； c向萃取液中加入重量百分比为10%以上的氯化钠，调节pH为11-12，并用1:1的正丁醇- 三氯甲烷溶液萃取； d将萃取液烘干后的残留物即生物胺用0.1M的盐酸溶解，每g水产品的盐酸使用量为1- 4ml; e将盐酸溶液加入质量百分比5%以上的氯化钠，并调节pH为9-11。
[0010] 优选的，所述步骤(2)中使用的衍生化试剂为氯甲酸异丁酯。
[0011]优选的，所述衍生化试剂还加入异辛烷，氯甲酸异丁酯与异辛烷的重量比为0.2-1:13〇
[0012] 优选的，所述衍生试剂中还加入N，N-二乙基乙胺，N，N-二乙基乙胺与衍生化试剂 的比为0.5-1:1。
[0013]优选的，所述步骤(3)将萃取头浸入生物胺稀溶液中进行同步衍生/萃取生物胺 时，在500-900rpm下搅拌30-60min;在将萃取头操作结束之后，去除萃取头上的水分。
[0014]优选的，所述步骤(4)的具体条件是：气相色谱分析条件：岛津气相色谱仪；色谱 柱:Rxi-5ms(30m X 0.25mm X 0.25μπι);进样口温度270°C，不分流模式进样；质谱接口温度 280°C，离子源温度230°C ;色谱柱柱温：100°C，保持1.2min;然后以10°C /min的速度升温至 160°C，再以25°C /min的速度升温至280°C，保留5min。
[0015] 优选的，所述步骤(5)中使用的内标化合物为1，7-二氨基庚烷;标准曲线的建立采 用内标法，具体为:首先，在样品中加入不同浓度的生物胺标准品和定量的内标化合物1，7-二氨基庚烷，然后，采用步骤(4)测出一系列不同浓度的生物胺标准品对应的峰面积，最后， 根据内标化合物校正峰面积后，确定生物胺的含量与生物胺衍生物峰面积的定量关系，建 立标准曲线。
[0016] 优选的，所述步骤(3)中操作前首先在生物胺稀溶液还加入3-8%的枸橼酸钠。
[0017] 枸缘酸钠可以减少生物胺稀溶液中的生物胺的溶解度。在萃取头进行衍生/萃取 生物胺时，由于生物胺的萃取，生物胺稀溶液中的浓度降低，导致不利于反应的进行，但是 在枸缘酸钠的作用下，生物胺的溶解度降低，生物胺更容易析出从而利于衍生/萃取的进 行，提尚该反应的效率。
[0018] 由于衍生化试剂遇水易分解，因此避免将其直接加到水溶液里跟生物胺反应，本 发明采用保护剂将其包裹在萃取头上，从而使得衍生化反应能够顺利进行。萃取头外面的 纤维存在孔隙，可以固定住有机溶剂包裹的衍生化试剂的小颗粒。当衍生化后的萃取头直 接伸到水溶液里萃取生物胺时，因为有保护剂的保护，所以衍生化试剂不会分解。
[0019] 本发明中的衍生化试剂为氯甲酸异丁酯或异辛烷与氯甲酸异丁酯的混合液。
[0020] 当选取为异辛烷与氯甲酸异丁酯的混合液的混合液时，异辛烷是作为保护剂存在 的。
[0021 ]当把衍生化后的萃取头直接伸到水溶液里萃取生物胺时，因为有异辛烷的保护， 所以氯甲酸异丁酯不会分解，同时，异辛烷对生物胺有很好的萃取效果。氯甲酸异丁酯在异 辛烷的保护下完成生物胺衍生化。
[0022] 本发明与现有技术相比，有益效果是:前处理操作步骤简单，检测快速简便;有机 溶剂使用较少，绿色环保;检测对象种类多样;检测精度较高。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。
[0024]如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施 例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
[0025] -种水产品中生物胺的快速检测方法，具体包括以下步骤： (1)从水产品中萃取生物胺，并将其制备成生物胺稀溶液;该稀溶液是将萃取液得到的 生物胺采用盐酸溶解，并将该溶液调节pH为9-11; 具体步骤为： a将水产品匀浆后称取5-20g，用5wt%三氯乙酸提取生物胺，将提取液用5wt%的三氯乙 酸稀释至50mL，滤纸过滤； b采用正己烷对滤液进行除脂； c向萃取液中加入20wt%以上的氯化钠，调节pH为11 -12，并用1:1的正丁醇-三氯甲烷溶 液萃取； d将萃取液烘干后的残留物即生物胺用0.1M的盐酸溶解，每g水产品的盐酸使用量为1- 4ml; e将盐酸溶液加入质量百分比5%以上的氯化钠，并调节pH为9-11。
[0026] (2)在固相微萃取萃取头上浸涂一层衍生化试剂;衍生化试剂为氯甲酸异丁酯，为 了提高衍生化的效果，同时在衍生化试剂中加入异辛烷，氯甲酸异丁酯与异辛烷的重量比 为0.2-1:13;同时为了进一步提高衍生化的效果，还在衍生试剂中加入N，N-二乙基乙胺，N， N-二乙基乙胺与衍生化试剂的比为0.5-1: 1。
[0027] (3)用步骤(2)处理后的萃取头直接衍生/萃取步骤（1)得到的生物胺稀溶液中的 生物胺，得到生物胺衍生物;将萃取头浸入生物胺稀溶液中进行同步衍生/萃取生物胺时， 在500-900rpm下搅拌30-60min;在将萃取头操作结束之后，去除萃取头上的水分；另外，为 了提高萃取效率，操作前首先在生物胺稀溶液还加入3-8%的枸橼酸钠； (4)将步骤(3)得到的生物胺衍生物利用气相质谱进行分析； 气相色谱分析条件：岛津气相色谱仪;色谱柱:Rxi-5ms(30mX0.25mmX0.25μηι);进样 口温度270°C，不分流模式进样；质谱接口温度280°C，离子源温度230°C ;色谱柱柱温：100 °C，保持1.2min;然后以10°C /min的速度升温至160°C，再以25°C /min的速度升温至280 °C，保留5min; (5)根据内标化合物校正峰面积后，建立生物胺含量与生物胺衍生物峰面积定量关系 的标准曲线； 内标化合物为1，7_二氨基庚烷;标准曲线的建立采用内标法，具体为:首先，在样品中 加入不同浓度的生物胺标准品和定量的内标化合物1，7_二氨基庚烷，然后，采用步骤(4)测 出一系列不同浓度的生物胺标准品对应的峰面积，最后，根据内标化合物校正峰面积后，确 定生物胺的含量与生物胺衍生物峰面积的定量关系，建立标准曲线。
[0028] (6)按照上述步骤（1)-(4)获得待测样品中生物胺衍生物的峰面积，根据步骤(5) 生物胺含量与生物胺衍生物峰面积的定量关系，计算得到水产品中生物胺的含量。
[0029] 本发明的萃取头选择的是PDMS/DVB，另外也可以选择其他类型萃取头，如PDMS、PA 等。
[0030] 实施例1: 一种水产品中生物胺的快速检测方法，具体包括以下步骤： (1)从水产品中萃取生物胺，并将其制备成生物胺稀溶液;该稀溶液是将萃取液得到的 生物胺采用盐酸溶解，并将该溶液调节pH为9; a将水产品匀浆后称取20g，用5wt%三氯乙酸提取生物胺，将提取液用5wt%的三氯乙酸 稀释至50mL，滤纸过滤； b采用正己烷对滤液进行除脂； c向萃取液中加入重量百分比为10%以上的氯化钠，调节pH为11，并用1:1的正丁醇-三 氯甲烷溶液萃取； d