嘧啶核苷线性标准回归曲线。
[0052]图24为尿嘧啶核苷线性标准回归曲线。
[0053]图25为次黄嘌呤核苷线性标准回归曲线。
[0054]图26为鸟嘌呤核苷线性标准回归曲线。
[0055] 图27为腺嘌呤核苷线性标准回归曲线。
[0056] 图28为010\通？、610\舰？、003这5种核苷酸标准物质的液相色谱图。
[0057]图29为奶粉样品空白测定5种核苷酸的液相的色谱图。
[0058]图30为奶粉样品共加标50mg/kg核苷酸的液相的色谱图（共加标50mg/kg，每种核 苷酸加标l〇mg/kg)。
[0059]图31为奶粉样品共加标100mg/kg核苷酸的液相的色谱图（共加标100mg/kg，每种 核苷酸加标20mg/kg)。
[0060] 图32为奶粉样品共加标300mg/kg核苷酸的液相的色谱图（共加标300mg/kg，每种 核苷酸加标60mg/kg)。
[0061] 图33为米粉样品空白测定5种核苷酸的液相的色谱图。
[0062]图34为米粉样品共加标50mg/kg核苷酸的液相的色谱图（共加标50mg/kg，每种核 苷酸加标l〇mg/kg)。
[0063]图35为米粉样品共加标100mg/kg核苷酸的液相的色谱图（共加标100mg/kg，每种 核苷酸加标20mg/kg)。
[0064]图36为米粉样品共加标300mg/kg核苷酸的液相的色谱图（共加标300mg/kg，每种 核苷酸加标60mg/kg)。
[0065] 图37为不同柱温时AMP的出峰顺序。
[0066]图38为样品随上机前放置时间的变化。
【具体实施方式】
[0067]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0068]实施例1检测方法 [0069] 1、样品前处理
[0070] 称取0.5g样品于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL水溶液，用冰醋酸调节pH在4 ~5之间，祸旋5min后，加入40mL的乙醇溶液，蜗旋5min后10000r/min离心10min，用乙醇溶 液洗涤，60 °C旋干，用5~1 OmL水定容，取lmL过0.22μηι滤膜于进样瓶中，供上机分析。
[0071] 2、进行高效液相色谱检测
[0072] (1)色谱柱:SB_AQ 柱。
[0073] (2)流动相：四丁基硫酸氢铵。
[0074] (3)液相色谱检测波长为254nm〇
[0075] (4)柱温在60~70°C之间。
[0076] (5)样品上机时间为样品制备好之后的60~240小时，上机前样品需要冷藏保存。 [0077]另外，流动相应用在SB-AQ柱时较佳pH为2.75±0.3，流动相浓度为1.5mmol。
[0078]实施例2样品前处理方法的选择及优化
[0079] 具体前处理方法影响因子的选择及优化研究如下：
[0080] 1、沉淀酸的选择
[0081] 将不同的酸作为蛋白沉淀剂进行比较，发现不同酸沉淀后，出现的杂质不相同（如 附图11~14所示）。草酸在CMP的出峰位置有较强的干扰，盐酸次之，甲酸和乙酸的杂质的出 峰时间基本一致，但是甲酸在CMP附近的杂质较多。说明应用乙酸作为沉淀剂较好。
[0082] 2、乙醇和乙酸(醋酸)共沉淀的影响
[0083]如附图1和2所示，将直接应用乙酸沉淀后定容以及乙酸与乙醇共沉淀处理定容后 做比较，发现前者的杂质峰面积更大，尤其是CMP附近的杂质更多，掩盖了 CMP的峰并无法定 量。而应用乙酸乙醇共沉淀后所有的杂质风险降低3倍以上，CMP附近的干扰峰几乎完全去 除，五种核苷酸的峰面积几近完全保留，而且该沉淀剂可同时沉淀蛋白和淀粉纤维素。 [0084]因此，本发明选择乙醇和乙酸(醋酸)作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂。
[0085] 3、有机沉淀剂的选择
[0086]分别将异丙醇、乙醇、甲醇和乙腈作为有机沉淀剂进行比较，结果如附图3~6所 示，结果显示，异丙醇、乙醇和乙腈都能较好的去除保留时间（rt)为2.4min的杂质，而甲醇 不能；同时乙醇的回收率高于异丙醇和乙腈。
[0087]因此，本发明选择乙醇和醋酸作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂。
[0088]实施例3测定条件的优化
[0089] 1、色谱柱的选择:研究比较了384〇、1'(^08、了3、&1^(16等(：18色谱柱之后，发现38-AQ对于核苷酸的分离以及稳定性更好，因而选用SB-AQ柱进行测定。
[0090] 2、流动相的选择
[0091] 在流动相中加入离子对试剂四丁基硫酸氢铵，能更好地分离5种核苷酸和杂质。不 同浓度的离子对试剂对UMP、AMP和頂P的保留时间的影响在±2min以内，而对CMP和AMP的保 留时间的影响在± lmin以内，因而通过调整离子对试剂浓度或者其它条件进行可以有效分 离五种核苷酸以及杂质。当四丁基硫酸氢铵浓度为0.6g/L的时候，5种核苷酸分离度最好， 且MP与后面的杂质分离度也很好。
[0092] 因此，经过大量的比较研究，最终选择四丁基硫酸氢铵作为流动相，以下研究进一 步对流动相的使用性质进行研究。
[0093] 3、流动相pH的选择
[0094] 将lOmmol的离子对试剂调节不同的pH，发现pH对五种核苷酸的分离效果存在巨大 差异(如附图15~18所示）。流动相温度在20 ± 5 °C下，在pH为2.5和3.6时，GMP和MP两个物 质无法实现分离。当pH= 3.0时GMP和IMP两个物质勉强实现分离。当pH=2.75 ± 0.03时五种 核苷酸分离较好，说明应用SB-AQ柱时的较佳pH为2.75 ± 0.03。
[0095] 4、离子对试剂浓度的选择
[0096] 分别采用pH为2.75，浓度为1.5臟〇1和10臟〇1的离子对试剂作为流动相，发现离子 对试剂对杂质都有较好的分离，杂质峰基本在CMP之前、CMP至UMP、以及最后出现，对目标化 合物的干扰较少(如附图19~2 2所示）。
[0097 ] 但是，1.5mmo 1的离子对试剂对CMP的杂质分离效果更加，在该条件下，把10mmol/L 浓度下无法分离的杂质完全分为两个峰，更好的实现杂质分离的目的。因而，本实验选取浓 度为1.5mmol的离子对试剂作为流动相。
[0098] 5、液相色谱检测波长的选择
[0099]首先测试不同的流动相条件和最佳检测波长，确定目标峰以后根据其液相色谱图 选择液相目标峰最佳出峰情况液相条件方法的建立，选择最优的流动相条件和最佳检测波 长，可有效去除杂质干扰。CPM的最佳吸收波长为275 ±5nm，UMP的最佳吸收波长为261 土 5nm，頂P的最佳吸收波长为249 ± 5nm，GMP的最佳吸收波长在254 ± 5nm和275 ± 5nm，AMP的最 佳吸收波长在257 ± 5nm，综合考虑各种核苷酸的吸收波长，可选取254nm作为共同的吸收波 长。
[0100] 6、柱温的选择
[0101]柱温的变化对5种核苷酸的影响跟离子对试剂浓度的变化相类似，在柱温40~80 °C之间，每隔5°C分离一次核苷酸标准品，发现AMP的峰在40 °C时与GMP的峰重合，如图37所 示，在80 °C时与頂P的峰重合，即AMP的峰随着温度的升高从GMP的位置偏移至頂P的位置上， 其中柱温在60~70 °C之间分离较好。
[0102] 7、样品上机时间的选择
[0103] 如果样品过0.45μηι滤膜过滤后马上上机，CMP出峰处会有两个非常高的杂质峰(最 大吸收波长为243nm)，但随着放置时间的延长杂质会逐渐消除。实验证明样品保持在4°C冷 藏的条件下，50小时之后已经检测不到243nm的杂质。样品在冷藏条件下保存