烟叶中角鲨烯的检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及烟叶中成分的检测技术领域，更具体地，涉及一种基于高效液相色谱 检测烟叶中所含角鲨烯的方法。
【背景技术】
[0002] 角鲨烯最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene，其化学名称为 2，6,10,15,19,23-六甲基一2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，属开链三萜类化合物。角 鲨烯具有提高人体内超氧化物歧化酶(S0D)活性、增强机体抗氧化性和免疫能力、改善性功 能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的生物活 性物质。最近研究发现角鲨烯对人体还具有解毒作用，可移除组织中的脂溶性毒素。2014年 4月，国家烟草专卖局下发"关于"加快卷烟降焦减害技术成果推广应用的通知（国烟办综 [2014]218号），提出要加大卷烟减害技术重大专项研究成果的应用推广力度，要采取针对 性技术措施加快卷烟降焦减害步伐。
[0003] 本申请人在烟叶天然抗氧化剂角鲨烯的生态累积与减害的研究工作，发现角鲨烯 可以选择性地降低烟气中苯并芘、巴豆醛、NH3等有害成分，降低卷烟危害指数，同时角鲨烯 具有清除烟气中的气相和固相自由基功能由于角鲨烯具有独特生理功能，目前开发利用角 鲨烯已成为科技界研究的热点。
[0004] 但是，目前国内外还没有可参考的烟叶中角鲨烯定性和定量的检测方法，因此，在 烟草行业建立烤烟中角鲨烯定性和定量的检测方法具有前瞻性，也是十分必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是填补现有烟叶中角鲨烯的检测技术不足，提供一种烟 叶中角鲨烯的检测方法。
[0006] 本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
[0007] 本发明以甲醇和乙腈为流动相，采用填有粒径5μπι的高效固定相的柱色谱分离技 术，优化高效液相色谱检测条件，将经本发明方法前处理后的样品注入高效液相色谱仪进 行色谱分离，用紫外吸收检测器，检测角鲨烯的吸收值，采用外标法，根据吸收峰面积计算 其含量；
[0008] 具体地，提供一种烟叶中角鲨烯的检测方法，包括以下步骤：
[0009] S1.样品前处理得到样品液，在经过硅胶净化处理后得到样品待测液；
[001 0] S2.配制标准溶液，建立标准曲线；
[0011] S3.检测:吸取样品待测液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器 检测角鲨烯；
[0012] S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量；
[0013]其中，步骤S1所述样品前处理包括以下步骤：
[0014] S11.烟叶切丝，以三氯甲烷作为提取溶剂，经索氏提取得到提取液；
[0015] S12.将提取液经甲醇：水的体积比为70:30的萃取剂进行萃取，收集萃取液，进行 旋转蒸发至近干，再用乙腈溶解，过〇. 22μπι有机系膜，收集滤液得到样品液；
[0016] S13.将步骤S12所得样品液过小柱净化处理，采用湿法装柱，小柱材料为0.06gPSA (N-丙基乙二胺固相吸附剂)和适量无水硫酸钠；
[0017] 步骤S3所述检测的条件为：
[0018] Agi lentl 100高效液相色谱仪HPLC配紫外检测器；
[0019]色谱柱：C18,5ym，4.6X250mm;
[0020]柱温：30°C;
[0021] 流动相类型：甲醇：乙腈，体积比为75/25;
[0022] 流动相流速：lmL/min;
[0023] 检测波长为：210nm;
[0024] 进样量：10yL。
[0025] 优选地，步骤S2所述配制标准溶液的方法是准确称取O.lg角鲨烯标准品，精确至 O.OOOlg，用乙腈溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角藍稀标准溶液，充分振荡摇勾。
[0026] 优选地，步骤S2所述角鲨烯标准曲线的建立的方法是:采用系列稀释法，分别配制 成浓度为〇. 002、0.01、0.05、0.2、0.5mg/mL的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱进样检测；以 进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性 回归方程。
[0027] 优选地，步骤SI 1在加入三氯甲烷之前，先对烟丝进行涡旋处理，所述涡旋处理是 祸方定lmin，静止10min〇
[0028] 优选地，所述涡旋处理的条件为2000r/min。
[0029] 优选地，步骤SI 1所述三氯甲烷的用量按照与烟丝的比例为5.0g烟丝：200mL三氯 甲烷确定。
[0030] 优选地，步骤S11所述所述索氏提取的条件为40°C水浴，回流9个小时。
[0031 ]优选地，步骤S12所述萃取剂的用量按照其与提取液体积比为1:1确定。
[0032] 优选地，步骤S12所述萃取的次数为3次。
[0033] 本发明在净化剂中加入适量的无水硫酸钠可以很好地防止溶液冲洗硅胶，造成凹 凸不平。优选地，步骤S13所述无水硫酸钠为0.5g。
[0034]本发明具有以下有益效果：
[0035]现有研究表明，卷烟燃烧后的烟气中含有近5000种化合物，根据对烟叶的氯仿提 取物进行化学分析，测得其中有300多种成分，而角鲨烯的含量很低，要对其进行快速准确 的检测，需要建立科学系统的检测方法。本发明针对烟叶样品，建立了一种适用于烟叶中角 鲨烯检测高效液相色谱法，采用三氯甲烷作为提取溶剂，结合采用索氏提取法，保障了较高 的提取效率，在经过PSA柱的净化处理，在所述样品待测液的科学前处理技术条件下，进一 步优化了检测条件，针对性解决样品中杂质峰处理问题，有效发挥高效液相色谱法准确、快 速、高灵敏的优点，为检测烟叶中角鲨烯提供了一种色谱峰分离较好，准确、快速、高灵敏、 重现性好、回收率高的检测方法，不仅符合定性要求，而且符合定量要求。
【附图说明】
[0036] 图1角鲨烯标准曲线图。
[0037]图2角鲨烯标准样品色谱图。
[0038] 图3用氯仿提取的未添加目标物样品色谱图。
[0039] 图4用氯仿提取的添加目标物样品色谱图。
[0040] 图5角鲨烯(50mg/L)标准溶液色谱图。
[0041 ]图6本底样品色谱图。
[0042]图7本底添加样品色谱图。
[0043]图8角鲨烯标准溶液(5mg/L)色谱图。
[0044] 图9未经净化剂净化样品的色谱图。
[0045] 图10经PSA净化样品的色谱图。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示 例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常 规市购或商业途径获得的试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本 领域常规使用的方法和设备。为方便说明，本发明实施例中使用的仪器和试剂说明如下，但 并不因此限定本发明。
[0047] 仪器：
[0048] (1)高效液相色谱仪HPLC(AgilentllOO)，配备:脱气栗、四元栗、自动进样器、柱温 箱和紫外检测器(美国Agilent公司）
[0049] (2)摇床振荡器:SHZ-82AB型(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）
[0050] (3)台秤:T-10000型，d = 0.1g(美国双杰兄弟(集团）有限公司）
[0051] (4)电子天平:BSA224S型，d = 0.1mg(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司）
[0052] (5)旋转真空蒸发器:RE52-99型(上海亚荣生化仪器厂）
[0053] (6)真空抽滤栗:SHZ-Dm型(巩义市予华仪器有限公司）
[0054] (7)超声波清洗器:KQ-50型（昆山市超声仪器有限公司）
[0055] (8)涡旋仪:MS3BS25(IKA 公司）
[0056] (9)恒温水浴锅:501数显型(江苏省金坛市宏华仪器厂）
[0057] (10)各种实验室通用玻璃器皿
[0058]试剂：
[0059] (1)99.8%角鲨烯对照品（中国药检所）
[0060] (2)甲醇(色谱纯和分析纯）
[0061 ] (3)乙腈(色谱纯）
[0062] (4)正己烷(分析纯）
[0063] (5)三氯甲烷(氯仿，分析纯）
[0064] (6)石油醚(分析纯）
[0065] (7) 0 · 22μπι有机微孔滤膜(英国原产膜）
[0066] (8)丙酮(分析纯）
[0067] (9)净化剂:PSA，C18,硅胶(welchrom 公司）
[0068] (10)烟丝(广西中烟工业有限责任公司，随机抽取）
[0069] 实施例1
[0070] 本实施例提供一种烟叶中角鲨烯的检测方法，包括以下步骤：
[0071] S1.样品前处理得到样品待测液；
[0072] S2.配制标准溶液，建立标准曲线；
[0073] S3.检测:吸取样品待测液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器 检测角鲨烯；
[0074] S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。
[0075]其中，步骤S1所述样品前处理的方法为：
[0076] 样品前处理方法：取0.05mL、10000mg/L角鲨烯标样于10mL正己烷中得外标基础 液，烟叶切丝后，取烟丝5.0g(取0.05mL，10000mg/L角鲨烯标样于10mL正己烷中，然后将 5.0g烟丝至其中，于2000r/min的祸旋仪祸旋lmin，静止，自然蒸发至干(大约24h)，然后用 直径为15cm的滤纸包好)于索氏提取器中，用正己烷，三氯甲烷，丙酮200mL分别置于圆底烧 瓶，将索氏提取器放入40°C水浴锅中，回流9个小时，收集提取液，收集提取液，用10mL氯仿 冲洗烟丝，合并提取液，取合并后提取液过小柱后，旋转蒸发至近干，再用5mL色谱级乙腈进 行溶解，过〇.22μπι有机系膜，即得待测样品液;所述过小柱是采用湿法装柱，小柱材料为 0.06gPSA+适量无水硫酸钠；
[0077]所述检测的检测条件为：
[0078] 高效液相色谱仪HPLC(AgilentllOO)配紫外检测器；
[0079] 色谱柱：C18,5ym，4.6X250mm;
[0080] 柱温：30 Γ;
[0081]流动相类型：甲醇：