一种基于gc-ms定量肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用气相色谱-质谱联用仪同时快速定量肠道内容物和粪便样本 中11种短链脂肪酸的检测方法，属于内源性物质检测技术方法。
【背景技术】
[0002] 短链脂肪酸主要由饮食中未消化吸收的碳水化合物经肠道菌群发酵产生的一类 物质，主要有乙酸、丙酸和丁酸。在生理状态下，短链脂肪酸能提供肠上皮细胞能量供其代 谢，并在肠粘膜细胞增殖、分化及维持结肠完整性和粘膜免疫应答过程中发挥重要作用。在 病理状态，如肠炎状态下，短链脂肪酸能促进肠粘膜细胞增殖，维持其正常形态，保护肠粘 膜机械屏障，减少促炎因子的生成，降低结肠炎症的发生。且最新研究发现，短链脂肪酸对 肿瘤细胞的增殖能起到抑制作用，并诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，降低癌变的机率。因其在 维持机体正常生理功能中具有重要作用，因此定量检测正常生理状态及病理状态下肠道及 粪便中该类物质的含量具有重要意义。
[0003] 目前已有许多方法用于定量生物样本中的短链脂肪酸，包括气相色谱、高效液相 色谱和毛细管电泳等方法，其中使用较多的测定方法是采用气相色谱测定，盐酸水溶液酸 化、乙醚萃取，后衍生化样本进行分析，或用乙醚直接萃取样本后FFAP极性柱直接分离样本 测定短链脂肪酸。专利CN105021726A采用蒸馏水直接稀释肠道内容物或粪便，后用GC-FID 的检测方法测定其中短链脂肪酸乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的含量，该方法具 有简单、快速和准确的特点。然而FID检测器相对MS检测器而言，定性需对照品，且准确度及 灵敏度均比MS低，不能给出分子量等信息，因此，采用GC-MS定量肠道内容物或粪便样本中 的短链脂肪酸准确度较高。专利CN104807933A采用酸化乳品，乙醇萃取后用GC-MS对乳品中 的短链脂肪酸进行检测，该方法采用DB-FFAP极性色谱柱对乙醇提取液进行分离，简单灵 敏、专属性强。然而该方法前处理过程中，由于引入酸的作用，所提取的短链脂肪酸可能会 与萃取试剂乙醇反应，导致定量短链脂肪酸结果不准确。
[0004] 本发明运用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化小鼠肠道内容物和粪便样本，稳定性 好的乙酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用GC-MS定量小鼠肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸。使用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸 化样本可以使萃取液中的含水量较低，保护色谱柱，且能在萃取过程中利于水酯分层。极性 较强的乙酸乙酯的使用可以提高小分子酸如甲酸、乙酸的萃取效率。因乙酸乙酯萃取过程 中会溶解少量水，故本方法进一步对乙酸乙酯进行干燥处理，使得存在于乙酸乙酯中的水 分进一步减少。该方法准确度、精密度高，检测限低，且定量检测短链脂肪酸种类达到11种， 能满足小鼠肠道内容物和粪便样本中主要短链脂肪酸测定的检测要求，有助于分析比较正 常和肠炎状态下短链脂肪酸的代谢处置规律，观察短链脂肪酸的变化能否表征肠炎的动 态，为发现肠炎状态下潜在的生物标志物提供重要依据。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是优化气相色谱-质谱联用仪定量小鼠肠道内容物和粪 便样本中11种短链脂肪酸的方法，提高短链脂肪酸的提取回收率及提取方法的安全性。该 方法准确度、精密度高，检测限低，且定量检测短链脂肪酸种类达到11种。因肠道内存在的 能产生己酸的己酸菌较少，且己酸在结肠内含量较低，故该方法能满足小鼠肠道内容物和 粪便样本中主要短链脂肪酸测定的检测要求，有助于分析比较正常和肠炎状态下主要短链 脂肪酸的代谢处置规律，为发现肠炎状态下潜在的生物标志物提供重要依据。
[0006] 本发明的技术方案，一种定量检测小鼠肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸 的方法，利用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用气相色谱-质谱联用仪定量检测小鼠肠道内容物和 粪便样本中11种短链脂肪酸，步骤为：
[0007] (1)样品预处理:收集肠道内容物和粪便样本冻干并将其研磨成粉，称取150mg冻 干粉，先加入150uL 1M的盐酸饱和氯化钠溶液，后加入含内标物质2-乙基丁酸的1.5mL乙酸 乙酯（内标浓度为5ug/mL)，将样本放于均质器上研磨混匀，经lOOOOrpm离心10min后，取 220uL上清经lOOmg硫酸镁干燥后，18000rpm离心10min，再取150uL上清用50mg硫酸镁干燥， 经18000rpm离心10min后，取72uL上清置于密封气相小瓶中，加入18uL衍生化试剂MTBSTFA， 旋紧瓶盖，混匀后置于80°C水浴中水浴20分钟，后将样本放于室温衍生化8h，待分析；
[0008] (2)GC_MS 分析：
[0009] 取步骤(1)所得样本进行GC-MS检测；
[001 0] GC条件:载气为纯He，流速1 · OmL/min，0 · 5uL分流进样，分流比为6:1;色谱柱:Rtx-5MS，尺寸为30m X 0.25mm X 0.25μπι;进样 口温度250°C ;升温程序：40 °C保持3min，以40 °C/ min升至60°C，后以 10°C/min升至 110°C，最后以40°C/min升至250°C，保持lmin;
[0011] MS条件：电子电离EI，电子能量70eV，离子源温度200 °C，接口温度220 °C，溶剂切除 时间为5min，同时切除7.0-7.6min之间的衍生化试剂出峰时间，Scan模式扫描范围为30-300,5頂模式监测为46,55,59,60,71，，74,85,87，116&11111 ;
[0012] (3)定性和定量分析:通过对比步骤(2)分析所得结果，与11种短链脂肪酸标准品 衍生化后的保留时间，以及NIST、WILY等谱库提供的质谱图对照，利用谱图匹配度、特征离 子及相应的化合物的保留时间对样本中化合物进行定性分析；
[0013] 用选择离子监测SIM模式对所需测定的短链脂肪酸特征离子峰进行积分，以11种 短链脂肪酸特征离子峰的峰面积与相应的内标特征离子峰m/z 116的峰面积之比为纵坐标 y，短链脂肪酸浓度为横坐标X绘制曲线，通过绘制所得的曲线即可得到小鼠生物样本中11 种短链脂肪酸定量检测的结果，图1即为GC-MS定量11种短链脂肪酸标准品的总离子图谱。
【附图说明】
[0014] 图1:11种短链脂肪酸标准品与MTBSTFA反应的衍生产物离子图谱。
[0015] 附加标记说明：FA:甲酸;AA:乙酸；PA:丙酸；iSO-ΒΑ:异丁酸；BA: 丁酸；iSO-VA:异 戊酸;VA:戊酸；15:2-乙基丁酸（内标）；丨8〇-撤:异己酸 ;撤:己酸;0-1^:乳酸和54:琥珀酸。
[0016]图2:A为正常小鼠盲肠内容物样本中短链脂肪酸的含量;B为正常小鼠粪便样本中 短链脂肪酸的含量。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1:测定小鼠盲肠内容物样本中短链脂肪酸的含量
[0018] (1)样品预处理:收集小鼠盲肠内容物，冻干成粉，称取150mg冻干粉，先加入150uL 1M的盐酸饱和氯化钠溶液，后加入1.5mL乙酸乙酯(含IS 5ug/mL)，将样本放于均质器上研 磨混勾，经lOOOOrpm离心10min后取220uL上清，经100mg硫酸镁干燥后，18000rpm离心10min 后再取150uL上清用50mg硫酸镁干燥，经18000rpm离心10min后，取72uL上清置于密封气相 小瓶中，加入18uL衍生化试剂MTBSTFA，旋紧瓶盖，混匀后置于80°C水浴中水浴20min，后将 样本放于室温衍生化8h，待分析；
[0019] ⑵GC-MS 分析：
[0020] 取步骤(1)所得样本进行GC-MS检测；
[0021] GC条件:载气为纯He(纯度99.99 % )，流速1. OmL/min，0.5uL分流进样，分流比为6: 1;色谱柱:Rtx-5MS，尺寸为30m X 0 · 25mm X 0 · 2