5μπι;进样口温度250 °C ;升温程序：40 °C保持 3min，以40°C/min升至60°C，后以 10°C/min升至 110°C，最后以40°C/min升至250°C，保持 lmin；
[0022] MS条件：电子电离EI，电子能量70eV，离子源温度200°C，接口温度220°C，溶剂切除 时间为5min，同时切除7.0-7.6min之间的衍生化试剂出峰时间，Scan模式扫描范围为30-300,5頂模式监测为46,55,59,60,71，，74,85,87，116&11111 ;
[0023] (3)定性和定量分析:通过对比步骤(2)分析所得结果，与11种短链脂肪酸标准品 衍生化后的保留时间，以及NIST、WILY等谱库提供的质谱图对照，利用谱图匹配度、特征离 子及相应的化合物的保留时间对样本中化合物进行定性分析；
[0024] 用选择离子监测SIM模式对所需测定的短链脂肪酸特征离子峰进行积分，以11种 短链脂肪酸特征离子峰的峰面积与相应的内标特征离子峰m/z 116的峰面积之比为纵坐标 y，短链脂肪酸浓度为横坐标X绘制曲线，通过绘制所得的曲线即可得到小鼠盲肠样本中11 种短链脂肪酸定量检测结果。如图2-A.
[0025] 检测实施例1中短链脂肪酸的线性范围，准确度，精密度，提取回收率和检测限。
[0026] (1)肠道内容物基质预处理:收集小鼠肠道内容物样本冻干成粉混匀，称取150mg 冻干粉各15份，先加入150uL 1M的盐酸饱和氯化钠溶液，后加入1.5mL乙酸乙酯，将样本放 于均质器上研磨混匀，经lOOOOrpm离心10min后取220uL上清，真空浓缩挥去溶剂，后用 220uL含IS 5ug/mL、含浓度梯度的待测定的11种短链脂肪酸的标准储备液的乙酸乙酯溶液 复溶，将样本放于振荡器上混勾5min，后经lOOmg硫酸镁干燥后，18000rpm离心10min后再取 150uL上清用50mg硫酸镁干燥，经18000rpm离心10min后，取72uL上清置于密封气相小瓶中， 加入18uL衍生化试剂MTBSTFA，旋紧瓶盖，混匀后置于80 °C水浴中水浴20min，后将样本放于 室温衍生化8h，待分析；
[0027] (2)线性范围及检测限的测定:用选择离子监控(SHO模式对11种短链脂肪酸衍生 物进行积分。选取信噪比为3时的标准品质量浓度为检测限。以11种短链脂肪酸特征离子峰 的峰面积与相应的内标特征离子峰m/z 116的峰面积之比为纵坐标y，短链脂肪酸浓度为横 坐标X绘制曲线，得检测的短链脂肪酸的线性范围(表1)
[0028]表1小鼠肠内容物样本中11种短链脂肪酸线性回归方程及相关参数 [00?<?!
[0030] (3)准确度、精密度及提取回收率的测定：
[0031]同步骤（1)的处理方式一样，制备三个不同浓度的（0.2，5，200ug/mL)的样本作为 质控样本(n = 5)，与相应浓度的短链脂肪酸纯品衍生化后进样，比较方法的准确度和精密 度，而提取回收率的测定则是质控样本得到的定量结果与粪便基质经前处理后配制成相应 浓度(0.2,5,200ug/mL)的短链脂肪酸衍生物的定量结果的比值，所得结果如表2所示。 [0032]表2肠内容物样本中11种短链脂肪酸的准确度、精密度及提取回收率(n = 5)
[0<
[or-
[0035] 从表1和表2可以发现，利用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化，安全的试剂乙酸乙 酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用气相色谱-质谱 联用仪定量检测小鼠肠内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法准确度、精密度、提取 回收率高，检测限较低，能满足肠内容物和粪便样本中主要短链脂肪酸的检测要求，有助于 分析疾病状态下小鼠肠内容物和粪便中短链脂肪酸的变化规律。
[0036] 实施例2:测定小鼠粪便样本中短链脂肪酸的含量
[0037] (1)样品预处理:收集小鼠粪便样本，冻干成粉，其余处理步骤及GC-MS分析步骤同 实施例1.所测得的空白小鼠中短链脂肪酸含量如图2-B。
[0038]由于肠道内异己酸及己酸含量较低，本方法测定小鼠肠道内容物和粪便样本中未 测到异己酸和己酸。但所建立的可测定肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法可 推及至测定其他异己酸和己酸含量高的组织或液体，如己酸菌发酵液，并对测定方法进行 验证，故该方法的建立仍具有意义。
【主权项】
1. 一种基于GC-MS的小鼠肠道内容物及粪便中11种短链脂肪酸的定量方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1) 生物样本提取方法:收集小鼠肠道内容物或粪便，将样本冻干成粉，称取150mg冻干 粉，加入饱和氯化钠溶液配置的1摩尔盐酸酸化样本，后加入含内标乙酸乙酯萃取，将样本 放于均质器上研磨混匀，经离心后，取适量上清经硫酸镁干燥两次后，取72uL上清置于密封 气相小瓶中，加入18uL衍生化试剂MTBSTFA，旋紧瓶盖，混匀后置于80°C水浴中水浴20分钟， 后将样本放于室温衍生化8h，待分析； (2) GC-MS 分析： 取步骤(1)所得样本进行GC-MS检测； GC条件:载气为纯He，流速1. OmL/min，分流进样;色谱柱:Rtx_5MS，尺寸为30m X 0.25_ Χ0.25μπι;进样口温度250°C;升温程序：40°C保持3min，以40°C/min升至60°C，后以10°C/ min升至 110°C，最后以40°C/min升至250°C，保持lmin; MS条件：电子电离El，电子能量70eV，离子源温度200°C，接口温度220°C，溶剂切除时间 为5min，同时切除7.0-7.6min之间的样品出峰时间，Scan模式扫描范围为30-300，S頂模式 监测为46,55,59,60,71，，74,85,87，116&11111 ; (3) 定性和定量分析:通过对比步骤(2)分析所得结果，与11种短链脂肪酸标准品衍生 化后的保留时间，以及NIST、WILY等谱库提供的质谱图对照，利用谱图匹配度、特征离子及 相应的化合物的保留时间对样本中化合物进行定性分析； 用选择离子监测SIM模式对所需测定的短链脂肪酸特征离子峰进行积分，以11种短链 脂肪酸特征离子峰的峰面积与相应的内标特征离子峰m/zll6的峰面积之比为纵坐标y，短 链脂肪酸浓度为横坐标X绘制曲线，通过绘制所得的曲线即可得到小鼠生物样本中11种短 链脂肪酸定量检测的结果。2. 根据权利要求1所述的一种小鼠肠道内容物及粪便中11种短链脂肪酸的定量方法， 其特征在于，所述的11种短链脂肪酸具体为：甲酸；乙酸;丙酸;异丁酸;丁酸;异戊酸;戊酸； 异己酸;己酸;乳酸和琥珀酸。3. 根据权利要求1所述的一种小鼠肠道内容物及粪便中11种短链脂肪酸的定量方法， 其特征在于，所述加入的酸化剂为1M盐酸饱和氯化钠溶液。4. 根据权利要求1所述的一种小鼠肠道内容物及粪便中11种短链脂肪酸的定量方法， 其特征在于，所述加入的萃取试剂为乙酸乙酯溶液。
【专利摘要】本发明是一种定量检测小鼠肠内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法，属于内源性物质检测技术领域。本发明采用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化，稳定性好的乙酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用气相色谱-质谱联用仪定量小鼠肠内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸。该方法准确度、精密度高，检测限低，且定量检测短链脂肪酸种类达到11种，能满足小鼠肠内容物和粪便样本中主要短链脂肪酸测定的检测要求，有助于分析比较正常和肠炎状态下短链脂肪酸的代谢处置规律，观察短链脂肪酸的变化能否表征肠炎的动态，为发现肠炎状态下潜在的生物标志物提供重要依据。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105651908
【申请号】
【发明人】郝海平, 曹丽娟, 邓珊珊, 王广基
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月2日