行50化体系双酶切，如下表4 所示：
[0107] 表4双酶切体系（50μυ [010 引
[0109]
[0110] 在37°C水浴中酶切5小时后，双酶切后的产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，回收纯 化双酶切后的目的片段(酶切后的祀T-32a( + )线性质粒载体、plnE和plnF)。
[0111] 载体质粒祀Τ-3^ι的酶切产物用AxyPr邱公司的DNA凝胶回收试剂盒
[0112] 进行琼脂糖凝胶割胶回收，步骤如下：
[0113] 1)称取0.2g琼脂糖溶解于20mLl X TAE缓冲液，煮沸，加化L染料，制胶，插11孔梳 子;混合样品和loading buffer，加样，进行120V恒压琼脂糖凝胶电泳30min。
[0114] 2)在紫外灯下切割出含有目的基因条带的琼脂糖凝胶，尽量切除不含目的基因的 琼脂糖凝胶。将切下的琼脂糖凝胶块称重，切碎，放入1.5mL的离屯、管中。
[0115] 3)将琼脂糖凝胶重量换算为凝胶体积（100yg=l(K)化体积）。加入3个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后75°C加热，间断混匀，直至胶块完全烙化。
[0116] 4)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer-DE-B，混合均匀。
[0117] 5)将上步骤的溶液转移到试剂盒提供的2mL DNA制备管，置于2血离屯、管上，12000 X g离屯、Imin，弃滤液。
[011引 6)将制备管重新放回2mL离屯、管，加500μΙ Buffer W112000Xg离屯、30s，弃滤液。
[0119] 7)将制备管重新放回2mL离屯、管，加700化Buffer W2，12000Xg离屯、30s，弃滤液。
[0120] 8)重复步骤7，将制备管重新放回2mL离屯、管，12000 X g离屯、Imin。
[0121] 9)制备管放到1.5mL离屯、管，在金属浴上30°C，300巧m放置5min;制备膜中央加入 2扣L Elution Buffer,室溫静置5min。室溫12000Xg离屯、Imin，洗脱DNAJ%琼脂糖凝胶检 验，-20°C保存。
[0122] 使用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒除去pi址和plnF双酶切后反应液中少 量的限制性内切酶，方法同本章2.2.3.3。
[0123] 2.6载体和目的片段的连接
[0124] 利用T4连接酶将酶切纯化后的祀T-32a( + )线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收 产物pi址和plnF片段进行连接，连接体系如下表5:
[0125] 表5 DNA连接体系
[0126]
[0127]
[012引连接后得到重组质粒祀T-32a( + )-pl址和祀T-32a( + )-plnF，16°C连接过夜。
[01巧]2.7连接产物的转化
[0130] 2.7.1大肠杆菌E.coli D册α感受态的制备
[0131] 根据《分子克隆实验指南》中化C12法制备E.coli D册α感受态。步骤如下：
[0132] 1)配制0.05Μ CaCl2溶液和0.05Μ含15%甘油的CaCl2,在12TC条件下，灭菌15min。
[0133] 2)取-20°C冰箱保存的E.coli DH5a菌株保藏管，在LB固体培养基上划线接种，37 °C培养过夜。待菌落长成，挑选一个单菌落接种至5mL的LB液体培养基，37 °C摇床2(K)rpm过 夜。
[0134] 3)接种2mL菌液至100血LB液体培养基的Ξ角瓶中，接种量为2%，37°C摇床培养1- 2小时，待0D600达到0.3-0.4，将80mL菌液转移进灭过菌的lOOmL离屯、管，置于冰上预冷 30min〇
[0135] 4)离屯、12min，条件是4r，4000rpm。弃上清，加入4mL预冷的0.05M CaCh，用枪头 小屯、吹散，冰上放置30min。
[0136] 5)4000巧m，4°C，离屯、12min，弃上清，加入4mL预冷的0.05M含15%甘油的CaCl2,吹 打均匀，用灭过菌的离屯、管分装为1〇化17管，-80°C保藏。
[0137] 2.7.2热击法转化E.coli D册α感受态
[013引 1)从-80°C冰箱取出E.coli D册α感受态，冰上化冻。
[0139] 2)各加入lOyL连接产物祀T-32a-pl址和祀T-32a-plnF，混匀，冰浴30min。
[0140] 3)移入42 °C水浴锅，水浴90s，立即取出至冰浴3min。
[0141] 4)加入500μΙ LB液体培养基，放置摇床，37°C，200巧m培养90min。
[0142] 5)菌液离屯、3000rpm离屯、5min，除去30化L上清，剩余部分用移液器吹打混匀，取50 化菌悬液，涂布于含有50mg/ml氨节抗生素的LB固体培养基。
[0143] 6)放入37 Γ培养箱，待培养基上的液体被吸收，倒置培养。
[0144] 2.8阳性转化子的筛选及鉴定
[0145] 转化涂布后12-16小时内，挑选长得粗壮的菌落接种至含有50mg/ml氨节抗生素的 LB液体培养基培养，接着进行菌液PCR。将PCR鉴定为阳性的菌种送至生工测序。
[0146] 生工测序正确的菌株进行活化，并且依次命名为D册a-pET-32a-pl址和D册α-祀T- 32a-plnF，提取祀T-32a-pl址和祀T-32a-plnF重组质粒。
[0147] 将提取的重组质粒祀T-32a-pl址、pET-32a-plnFW及祀Τ-3^ι空质粒，用热击法转 化至大肠杆菌E.coli BL2UDE3)感受态细胞，在含50mg/mL氨节抗生素的LB固体培养基涂 布50化。转化涂布后12-16小时内，挑选长得粗壮的菌落接种至50mg/血氨节抗生素的LB液 体培养基培养，10%甘油保存菌种两份，一份送至生工测序。测序结果正确的菌株命名为 化 21-pET-32a-pl 址和化 21-pET-32a-plnF，空白对照为化 21-pET-32a，在-80°C 冰箱保存。 [014引 2.9工程菌的诱导表达
[0149] 2.9.1化21菌种活化
[01加]取化21-pET-32a-pl址和化21-pET-32a-plnF菌株保藏管，在含50mg/mL氨节抗生 素的LB固体培养基上划线接种，37°C培养过夜。待菌落长成，挑选一个单菌落接种至5mL含 50mg/mL氨节抗生素的LB液体培养基，37°C，200巧m培养过夜。
[0151] 2.9.2工程菌的诱导表达
[0152] 接种2%的过夜培养菌液至50mL液体培养基，37°C，200rpm摇床培养。培养2-3小时 左右，待菌液OD600到达0.6-0.8，取出ImL菌液作为诱导前全菌体总蛋白样品。接着，加入1M 的IPTG溶液50化，继续37 °C培养5小时，取出ImL菌液作为诱导后全菌体总蛋白样品。将诱导 前和诱导后全菌体样品SOOOrpm离屯、lOmin，去上清，添加1(Κ)化缓冲液和2 X上样缓冲液100 yL，混匀后，水浴沸腾1 Omin。
[0153] 2.9.3SDS-PAGE检验目的蛋白
[0154] SDS-PAGE的原理是在加热情况下蛋白与SDS结合变成带负电的物质，聚丙締酷胺 具有与分子筛类似的作用，跑电泳时，所有蛋白向阳极移动，分子量小的蛋白移动速率快， 反之，分子量大的的蛋白移动速率慢。与标准蛋白比较迁移位置，可得到目的蛋白的分子量 大小。由于重组蛋白上游含有一个组氨酸标签，即6个连续氨基酸，运六个组氨酸带有较强 的正电荷，与SDS结合后负电荷弱，导致蛋白移动速率变慢，在胶上的表观分子量变大，但与 实际不会相差太大。
[01巧]操作方法如下：
[0156] 1)安装好长短玻璃和面条，将分离胶注入玻璃板中，大约3ml，加水至短玻璃板的 高度去除气泡;带分离胶凝结，倒掉上层水，滤纸吸干;加入积层胶，大约1ml，加水至短玻璃 板去除气泡;待积层胶凝结，倒掉上层水，滤纸吸干;加入浓缩胶至短玻璃板高度，插入相应 的梳子，等待凝结。
[0157] 2)浓缩胶凝结，拔起梳子，将玻璃板连同胶安装至电泳槽架子上，槽内加阴极缓冲 液至长短玻璃板之间。
[0158] 3)加样，每个孔加入15ul，蛋白marker加 3ul。
[0159] 4)槽外加阳极缓冲液，开始电泳，80V恒压半小时，换电压至llOV跑至玻璃板底部。
[0160] 5)跑好后，胶剥下，加入100ml染色液染色2小时。回收染色液，加入洗脱液脱色至 条带清晰。
[0161] 表6 SDS-PAGE配方
[0162] Table 6 Component of SDS-PAGE
[0163]
[0164]
[01化]3结果与讨论
[0166] 3.1pl 址和 plnF 的 PCR 扩增
[0167] PUC57质粒是基因克隆中比较常用的一种载体，PUC57DNA的全长为2710bp。经过生 工合成的基因片段保存在质粒载体PTC57上，plnE和plnF的大小分别为99bp和10化P，加上 肠激酶15bp，所WpUC57-pl址和pUC57-plnF的大小分别为2824bp和2827bp。用于构建重组 质粒的目的片段可W从两个方面获得，其一，通过提取菌株pU巧7-pl址和pTC57-plnF的质 粒，直接对质粒进行双酶切，跑1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下割胶回收目的片段，但是运 种方法对质粒的浓度要求很高，步骤比较复杂。其二，通过设计特异性引物进行PCR扩增获 得目的片段。pUC57-pl址和pU巧7-plnF质粒提取，如图1所示，泳道1、2分别为pU巧7-pl址和 pUC57-plnF质粒，由于质粒是环状结构，所W在跑琼脂糖凝胶电泳时比实际大小低一些。 [016引本试验采用第二种方法W质粒pU巧7-pl址和pTC57-plnF为模板，用设计好的引物 分别进行pi址和plnF片段的PCR扩增，结果如图2所示，阴性对照没有出现特异性片段，且1、 3号泳道特异性片段大小均在100-200bp之间，大小符合plnE碱基数99bp，plnF碱基数 10化P，初步断定1、3泳道的片段分别为pi址和plnF。
[0169] 3.2重组质粒的构建
[0170] 使用DNAMA