花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因AhSAMS及蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因技术领域，特别设及花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶蛋白，还设及花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS 及花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶蛋白的应用。
【背景技术】
[0002] 花生是世界范围内广泛种植的油料和经济作物，是全球最重要的油料作物之一。 中国是世界上最大的花生生产和出口大国，花生种植面积在我国农作物中排在第屯位，农 业产值排在第五位，年总产已达1500多万吨，占世界花生总产的43%，出口量占世界的40% W上。然而，我国的油料作物生产虽然发展较快，但仍跟不上人民生活水平的不断提高。目 前，我国年需植物油的自给率不足35%，供需矛盾突出。高溫强光是花生生长过程中必须面 临的非生物胁迫之一，特别是每年的屯、八月份，高溫强光严重的影响了花生的产量。
[0003] 1952年Cantoni发现S-腺巧甲硫氨酸（S-adenosylA-methionine ,SAM)。它参与多 种生化反应，是生物体内重要的代谢产物。SAM具有转甲基、转氨丙基和转硫等多种生理作 用，运些反应对细胞结构和功能影响都至关重要。研究表明：SAM是生物合成乙締 W及多胺 的前体。众所周知乙締是植物生长调节剂参与调控植物的多种生理生化反应，而多胺是生 物体代谢过程中产生的一类次生物质，在调节植物生长发育、控制形态建成、提高植物抗逆 性、延缓衰老等方面具有重要作用。S-腺巧甲硫氨酸合成酶（S-adenosyl-kmethionine synthetase,SAMS)调节着SAM的合成速率，有些SAMS基因是组成型表达的，而有些却是受发 育时期或者一些环境因子所调节的，比如盐胁迫、干旱胁迫、渗透胁迫等。最近研究表明，花 生中SAMS可能和植物抗逆性有关，但该基因国内外尚无报道，它在植物逆境生理和衰老生 理过程中的调节作用尚不清楚。
【发明内容】
[0004] 为了解决W上现有技术中未有花生SAMS基因及其在植物逆境生理和衰老生理过 程中的调节作用的报道的问题，本申请提供了花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS。
[0005] 本发明还提供了花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶蛋白。
[0006] 本发明还提供了花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS及蛋白的应用。
[0007] 本发明是通过W下步骤得到的：
[000引花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS,其碱基序列如序列表中序列1所示。
[0009] 含有花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的质粒或载体。
[0010] 所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS编码合成的花生S-腺巧甲硫氨酸 合成酶，其蛋白质序列如序列表中序列2所示。
[0011] 所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合 成酶在与巧调素蛋白互作中的应用。
[0012] 所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合 成酶在花生抗干旱、抗高盐、抗ΑΒΑ和抗高溫强光胁迫中的应用。
[0013] 所述的应用，在干旱胁迫下，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的转录物在 处理5天后积累达到最大值。
[0014] 所述的应用，在盐胁迫后，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的表达在处理1 天后达到峰值。
[0015] 所述的应用，在ΑΒΑ处理后，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的mRNA水平在 处理48小时后达到最高水平。
[0016] 所述的应用，在高溫强光胁迫下，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的转录 物在处理2小时后积累达到最大值。
[0017] 所述的应用，外源施巧促进花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的表达，提高 植物的抗逆性。
[0018] 巧素是植物生长发育必须的营养元素之一，它参与了植物从发芽到生长分化开花 结果的全过程，在植物体内巧离子的主要作用是：（1)营养物质，促进微管的形成。（2)细胞 壁的结构组织和膜的流动性。（3)减轻盐胁迫的毒害作用。（4)促进花粉管的生长和伸长。花 生是需巧较多的作物，对巧元素的需求数量仅次于氮，高于憐，与钟相当。花生缺巧时，种子 发育受阻，果壳组织疏松，空果、釉果及烂果增加，产量明显下降。研究化对花生逆境生理 的调控机制对明确花生生长发育的巧素利用规律、保证花生高产具有非常重要的意义。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1)首次披露花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的碱基序列及表达蛋白，对研 究花生逆境生理调控机制、提高花生产量具有非常重要的战略意义；
[0021] 2)首次掲示化27CaM信号途径与花生多胺合成途径之间的相互作用关系，阐明花 生多胺合成的巧离子信号调控机制。
[0022] 3)根据该理论基础可指导明确花生的巧元素吸收与利用规律，挖掘调控±壤有效 巧供给能力。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明花生CaM基因的分离及pGBKT7(BD)载体的构建，其中A:AhCaM全长 cDNA的PCR扩增鉴定结果;B: pG服T7-CaM酶切鉴定结果，
[0024] 图2是本发明蛋白质文库的建立图谱实验结果，其中A:RNA提取;B:mRNA的分离;C: 合成二链;D:二链的纯化，
[0025] 图3是本发明利用酵母双杂交筛选与CaM互作蛋白的实验结果，其中A:经X-gluc检 测克隆;B:与CaM互作蛋白的酵母质粒PCR筛选，
[00%]图4是CaM和SAMS在酵母中的互作验证实验结果，
[0027]图5是巧光素酶方法验证CaM和SAMS互作的实验结果，
[002引图6是不同逆境胁迫下AhSAMS的表达实验结果，
[00巧]图7是不同巧浓度处理后AhSAMS基因的表达实验结果，
[0030]图8是外源施巧提高转基因株系中游离多聚胺含量实验结果。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0032] 实施例1
[0033] 本发明通过W下实验方法获得本发明所述的花生AhSAMS基因。
[0034] -、酵母双杂交
[0035] 1、实验所用试剂
[0036] 酵母双杂交实验所用试剂盒：BD Matchmake;rTM LibraiT Constructionfe Screening Κi ts购自C1 ontech公司。该实验中所用试剂参照产品说明书。
[0037] 2、构建pG服T7 (BD)表达载体pG服T7-CaM
[003引提取花生叶片RNA后经过反转录得到cDNA，分别用含有Ndel位点的5'引物1(5/- CATATGATGGCGGATCCGCTCACC-3')和带有 PstI 酶切位点的3' 引 物2(5'- CTGCAGCTAGGCCATCATG ACCTTG-3')，从花生cDNA中扩增出花生叶片中巧调素基因 AhCaM全 长(Accession number :AY517930)，并通过测序验证扩增片段的正确性。通过酶切、连接，构 建pG服T7-CaM载体。
[0039] (1) WOiM全长cDNA为模板，进行PCR扩增，体系如下：
[0044] 将PCR扩增所得片段AhCaM连入克隆载体pMD 18-T Simple得到pMD Simple-CaM， 酶切鉴定进行序列测定；
[0045] (2)用限制性内切酶NdeI、PstI双酶切质粒pMD Simple-OiM和pG服T7(BD)载体；
[0046] (3)回收:进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有化Μ片段和pGBKT7(BD)载体片段的凝胶；
[0047] (4)连接:将酶切得到的化Μ片段和pG服T7(BD)载体片段用连接酶进行连接，得到 pG服T7-CaM，连接体系为：
[004引
[0049] 加出0至总体积化yL，混匀后4-16 °C连接过夜；
[00加](5)转化:取化L连接产物(pGBKT7-CaM)转化E. coli D册α感受态细胞，菌液涂布于 含卡那霉素的固体培养基平板上；
[0051 ] (6)重组子的筛选:对长出的菌落进行菌落PCR，并进行质粒(pG服T7-CaM)的Ndel、 PstI双酶切鉴定。
[00对上述操作用Nde巧日PstI将pMD Simple-CaM质粒和pG服T7(BD)载体分别进行双酶 切，回收后将含有AhCaM基因编码区的全长cDNA插入表达载体pGBKT7(BD)，构成表达载体 pGBKT7-CaM。将构建好的表达载体，分别用Ndel和PstI双酶切鉴定（如图1所示）和测序，结 果证明pG服T7-CaM表达载体已构建成功。
[0053] 3、乙酸裡法制备并转化酵母感受态细胞
[0054] ^4(3法制备酵母感受态细胞(￥2服〇1(1和￥187):首先从-80°(：冰箱取出冰存的酵母 菌株，取一小部分涂在YPDA固体培养基上，放入3(TC培养箱中直至菌落长出（大约3天）。
[0055] (1)挑单菌落(直径约为2-3mm)于含3mL YP