入酵母后经 验证片段无自主激活活性及毒性后，再进行下一步的双杂交实验。利用经高溫强光处理地 后的总RNA为模板，反转录得到单链cDNA，然后扩增得到双链cDNA。双链cDNA经纯化后，建立 花生高溫强光的蛋白质文库。我们从运个蛋白质库中筛选与诱巧蛋白互作的因子。即将 pG服T7-CaM质粒转入酵母菌种YsHGold，然后再与花生高溫强光蛋白质文库融合筛选26h。 随后在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/A/X-Gal板上筛选阳性克隆，对于长出的菌斑首先利用X- a-Gal验证（图3A)，然后提取变蓝的酵母菌的质粒，W质粒为模板扩增片段。挑选巧OObp的 片段转化DH5a(图3B)。经菌液PCR筛选出只含有一种片段的菌斑，然后测序。下表中为用花 生叶片中巧调素做诱巧蛋白筛选酵母双杂交文库部分克隆测序结果。
[0124]
[01巧]实施例2: AhSAMS和AhOiM的相互作用验证
[0126] 1、酵母双杂交系统验证
[0127] 根据筛选测序得到的序列，设计引物3 (5 ' -TCTAGAATGGCAGCAGAGACTTTCC-3 '）和引 物4(5'-6641'(：(：1'了466(：(：1'1'(：1'(：此4(：1'1'-3'）经过？〔巧广增得到4}15415基因全长。分别构建 pG服T7-AhSAMS和pGADT7-AhCaM W及空载体做对照，同时将AhSAMS和AhCaM共转化入酵母菌 株Y2HG0 Id，转化方法见实施例1中步骤3和4。吸取化L菌液分别点到SD-Leu/-Trp、SD-Ade/- His/-Leu/-Trp/X/A固体筛选培养基上，观察生长情况并作图。
[0128] 将重组质粒转化酵母细胞YsHGold，在相应的筛选培养基中观察细胞生长情况。如 图4所示，与对照菌株相比，我们发现pGADT7-AhQiM和pG服T7(BD)空载体的菌株可W在SD/- 化p/-Leu培养基中存活；同时，发现pG服T7-AhSAMS和PGADT7 (AD)空载体的菌株也可W在 SD/-Trp/-Leu培养基中存活，但无法在四缺培养基上正常生长。只有同时转入PGADT7- AhCaM和pG服T7-AhSAMS时，在四缺培养基上才可W生长并且可W诱导α半乳糖巧酶表达，使 菌体变蓝(见图4);相说明CaM和SAMS两种蛋白是可W相互作用的。
[0129] 2、巧光素酶方法验证巧调素与S-腺巧甲硫氨酸合成酶(SAMS)互作
[0130] (1)将SAMS和CaM基因分别与nLUC和cLUC载体连接，转化GV3101农杆菌。
[0131] (2)挑单克隆于5ml含有相应抗生素(卡纳和利福平)的LB中；同时摇携带病毒PTGS 抑制子P19(用于消除烟草对外源基因的抑制）的农杆菌，28度过夜。
[0132] (3)次日菌液Wl:100的比例转接10ml的LB(含相应抗生素 ，lOmM MES P册.7和40μ Μ乙酷下香酬），28度过夜培养。
[0133] (4)培养16小时W后，3200巧m离屯、lOmin，收集菌体。
[0134] (5)用lOmM MgCb重悬菌体(小于10ml)，使0D为1.5;另外，P19农杆菌悬浮液的浓 度调整为0D600为1.0。在重悬液中加入乙酷下香酬至浓度为200μΜ。重悬液室溫静置3小时。
[0135] (6)样品中，目的载体的悬浮液和Ρ19的悬浮液按体积比1:1混合；多样品同理（例 如两个载体共同注射时，按照A: Β: ρ19 = 1:1:1体积混合）。
[0136] (7)选择烟草植株上部生长状态良好的叶片，在背面(避开主脉和边缘的）中间位 置用1ml的注射器将悬浮液注射到叶片中（去掉针头，压进去就行）。
[0137] (8)3天后，在注射菌液的叶片上涂布LUC底物，于分子影像仪中观察巧光。
[0138] 分子影像仪中观察巧光结果见图5,可W看出只有当同时转入CaM和SAMS时才能观 察到巧光。进一步验证了运两个蛋白的互作。
[0139] 3、S-腺巧甲硫氨酸合成酶(SAMS)蛋白的序列分析
[0140] S-腺巧甲硫氨酸合成酶(SAMS)的核巧酸序列见序列表中序列1，蛋白质序列见序 列表中序列2。
[0141] 4、AhSAMS基因在花生植株中的表达分析
[0142] 1、不同胁迫处理下AhSAMS基因在花生叶片中的表达
[0143] 为了探讨AhSAMS是否响应逆境胁迫，我们用干旱（不诱水）、高盐（250mM化C1)、 ΑΒΑ(100μΜ)、高溫强光(40°C1200mmol nf2s^PFD)对野生型花生进行了不同时间的处理，进 行实时定量PCR实验，分析AhSAMS在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示，AhSAMS在运些 胁迫条件下都受到诱导表达。在干旱胁迫下，该基因的转录物在处理5天后积累最多；盐胁 迫后，AhSAMS的表达在处理1天后达到峰值，之后表达减少但仍高于未处理时的表达量;ΑΒΑ 处理后，AhSAMS的mRNA水平逐渐增加，在处理48小时后达到最高水平;高溫强光胁迫下，该 基因的转录物在处理2小时后积累最多（图6)。运些结果说明AhSAMS参与多种非生物胁迫响 应。
[0144] 2、施加不同浓度巧后AhSAMS基因在花生叶片中的表达
[0145] 不同浓度巧处理后，在正常生长条件下，AhSAMS表达量变化不明显，经过高溫强光 处理4h后，施巧植株（6mmol/L)中AhSAMS的转录物迅速积累，表达量明显高于未加巧 (Ommol/L)的植株。表明外源施巧可W提高花生叶片中SAMS基因的表达(图7)。
[0146] 五、游离多聚胺含量的测定
[0147] 用BamHI和Sail从PMD18-T Simple载体切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S 启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌LBA4404。转化烟草，从转基因烟草中筛选 出表达量较高的株系S-2和S-6进行总游离多聚胺含量的测定。实验结果如图8所示，结果表 明，高溫强光胁迫下，转基因植株中多聚胺含量显著高于野生型植株;同时选取转基因植株 S-2进行外源施巧一周后，发现游离多聚胺的生物合成在一定程度上有增加。表明AhSAMS基 因过量表达后多聚胺的生物合成在一定程度上有增加，并且巧可W增加其生物合成含量， 结果表明外源施巧可W促进SAMS基因的表达，有利于提高植物的抗逆性。
[0148] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 审IJ，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 花生s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS，其碱基序列如序列表中序列1所示。2. 含有权利要求1中花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的质粒或载体。3. 权利要求1所述的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS编码合成的花生S-腺苷甲 硫氨酸合成酶，其蛋白质序列如序列表中序列2所示。4. 一种权利要求1所述的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或权利要求3所述的 花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶在与钙调素蛋白互作中的应用。5. -种权利要求1所述的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或权利要求3所述的 花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶在花生抗干旱、抗高盐、抗ΑΒΑ和抗高温强光胁迫中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在干旱胁迫下，花生S-腺苷甲硫氨酸合成 酶基因 AhSAMS的转录物在处理5天后积累达到最大值。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:在盐胁迫后，花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶 基因 AhSAMS的表达在处理1天后达到峰值。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:在ΑΒΑ处理后，花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶 基因 AhSAMS的mRNA水平在处理48小时后达到最高水平。9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:在高温强光胁迫下，花生S-腺苷甲硫氨酸 合成酶基因 AhSAMS的转录物在处理2小时后积累达到最大值。10. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于外源施钙促进花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶 基因 AhSAMS的表达，提高植物的抗逆性。
【专利摘要】本发明提供了花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因<i>AhSAMS</i>及其蛋白与应用，基因序列见序列表中序列1。本发明通过筛选蛋白质文库筛选到与钙调素蛋白CaM互作的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶，并获得其基因序列和蛋白质序列，本发明还通过进一步的实验来确定所述花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶的功能，通过干旱、高盐、ABA、高温强光胁迫处理，获得了S-腺苷甲硫氨酸合成酶在上述逆境胁迫中的不同表达情况，为后续对S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的进一步利用提供了事实根据，便于进一步利用Ca2+和所述基因<i>AhSAMS</i>来提高花生对逆境的调控能力。
【IPC分类】C12N9/10, A01H5/00, C12N15/54
【公开号】CN105671062
【申请号】CN201610236380
【发明人】杨莎, 李新国, 万书波, 郭峰, 张佳蕾, 耿耘, 孟静静, 黄超
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月15日