角齿藓△6－乙炔酶和△6－脱饱和酶的制作方法

专利名称：角齿藓△6－乙炔酶和△6－脱饱和酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备不饱和脂肪酸的方法，以及制备具有较高不饱和脂肪酸含量的甘油三酯的方法。本发明还涉及用编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶或Δ6-脱饱和酶的DNA序列生产转基因生物，优选转基因植物或转基因微生物，该转基因生物具有较高含量的具有Δ6三键和/或Δ6双键的脂肪酸、油类或脂类。
本发明还涉及分离的核酸序列；涉及含有一种核酸序列的表达框，含有一种核酸序列或表达框的载体和生物。本发明还涉及具有较高含量不饱和脂肪酸的不饱和脂肪酸和甘油三酯及其用途。
脂肪酸和甘油三酯在食品业、动物营养、化妆品和制药行业有着多种用途。它们适合于多种用途，这要取决于它是游离饱和或不饱和脂肪酸或具有较高含量饱和或不饱和脂肪酸的甘油三酯；因此，例如，可将多不饱和脂肪酸添加到婴儿食品中，以便提高其营养价值。各种脂肪酸和甘油三酯主要是从诸如被胞霉属的微生物或诸如大豆、油用油菜、向日葵等的产油植物中获得的，通常得到的是它的甘油三酯形式。不过，也可以从诸如鱼的动物物种中获得。游离脂肪酸优选是通过皂化作用制备的。
根据其用途，优选具有饱和或不饱和脂肪酸的油；因此，例如，具有不饱和脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸的脂类是人类营养品所优选的，因为它对血液胆甾醇含量具有有利影响，并因此对发生心脏病的可能性具有有利影响。它们被用于各种人类饮食或药品中。
由于它的有利特征，在过去一直不缺乏利用现有的与脂肪酸和甘油三酯合成相关的基因在各种生物中生产具有改变了的不饱和脂肪酸含量的油类的方法。因此，WO91/13972及其在美国的等同的专利申请披露了Δ9-脱饱和酶。WO93/11245要求保护一种Δ15-脱饱和酶，WO94/11516要求保护Δ12-脱饱和酶。Δ6-脱饱和酶披露于WO93/06712、US5614393、WO96/21022和WO99/27111中。例如，其他脱饱和酶披露于以下文献中EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP-A-0794250、Stukey等，生物化学杂志256，199020144-20149；Wada等，自然347，1990200-253或Huang，脂类34，1999649-659。WO96/13591披露并且要求保护Δ6-棕榈酰-ACP-脱饱和酶。不过，到目前为止对各种脱饱和酶的生化鉴定还不充分。因为要分离和鉴定作为膜结合蛋白的这种酶难度很多(MaKeon，酶学方法，198112141-12147，Wang等，植物生理学生物化学，26，1988777-792)。
WO97/37033披露了Δ12-乙炔酶。这种酶可用于制备三键的不饱和C18-脂肪酸。这种类型的脂肪酸除了可用于人类食品之外，由于其反应性还可用于制备聚合物。Sperling等在一次会议上(South LakeTahoe，加拿大，1999年6月9-13日)报导了一种酶的克隆，这种酶有可能将三键导入脂肪酸，但这种酶的底物与Δ12-乙炔酶底物不同，并且这种酶将三键引入不同的脂肪酸的不同位置。
在酵母中可以证实脂肪酸谱向不饱和脂肪酸的偏移和其产量的提高(参见Huang等，脂类34，1999649-659，Napier等，生物化学杂志，330卷，1998，611-614)。不过，各种不饱和酶在转基因植物中的表达没有表现出所需要的结果。它有可能表现出脂肪酸谱向不饱和脂肪酸的偏移，但与此同时也会发生这种转基因植物的合成性能的显著降低，就是说，与原始植物相比只能分离到少量的油类。
迫切需要编码与不饱和脂肪酸生物合成相关的酶的新型基因并可以利用它以工业化规模生产不饱和脂肪酸。
本发明的一个目的是提供合成不饱和键合脂肪酸(ungesttigterkonjugierter Fettsuren)的其他酶。
我们业已发现这一目的是通过选自下列一组的编码具有Δ6-乙炔酶和/或Δ6-脱饱和酶活性的多肽的分离的核酸序列实现的a)具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列的核酸序列，b)由于遗传密码的简并性而由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列衍生的核酸序列，c)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列的衍生物，它编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少75％的同源性，这种多肽的酶促活性不具明显的降低。
例如，衍生物表示由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所编码的酶或其酶促活性的功能同系物，就是说，能催化与SEQ IDNO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所编码的酶相同的酶促反应的酶。所述基因有可能用于制备在Δ6号位置上具有三键和/或双键的不饱和脂肪酸。在下文中，不饱和脂肪酸表示具有一个或多个不饱和度并具有三键和/或双键的脂肪酸。所述三键和/或双键可以是共轭的或非共轭的。SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列编码具有乙炔酶和/或Δ6-脱饱和酶活性的新型酶。
所述新型酶Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶优选将顺式双键导入甘油酯脂肪酸残基的C6-C7位置和/或将业已存在的C6-C7位置上的双键转化成三键(参见SEQ ID NO1或SEQ ID NO3)。另外，具有Δ6-脱饱和酶活性的酶优选只能在甘油酯的脂肪酸残基的C6-C7位置上引入顺式双键。具有SEQ ID NO11所示序列的酶也具有这种活性，并且是单一功能的Δ6-脱饱和酶。
所述新型核酸序列(对本申请来说，单数形式可以包括复数形式，反之亦然)或其片段可优选用于通过同源性筛选分离其他基因组序列。
例如，上述衍生物可以从其他生物中分离，例如，真核生物，如植物，特别是苔藓、双鞭甲藻(Dinoflagellaten)或真菌。
另外，举例来说，SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列的衍生物或功能性衍生物表示等位变体，它在衍生的氨基酸水平具有至少70％的同源性，优选至少75％的同源性，优选至少80％的同源性，特别优选85％的同源性，非常特别的优选90％的同源性。所述同源性是基于完整氨基酸片段计算的。使用程序PileUp、BESTFIT、GAP，TRANSLATE或BACKTRANSLATE(＝UWGC程序包的部分，Wisconsin包，10.0版-UNIS，1999年1月，遗传学计算机组公司，Deareux等，核酸研究(Nucleic.Acid Res.)，12，1984387-395)(分子进化杂志(J.Mol.Evolution.)25，351-360，1987，Hizzins，CABIOS，5，1989151-153)。由所述核酸序列衍生的氨基酸序列示于SEQ IDNO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO12中。同源性表示同一性，就是说氨基酸序列至少70％相同。所述新型序列在核酸水平上具有至少65％的同源性，优选至少70％，特别优选至少75％，非常特别优选至少80％。
等位变体特别包括功能性变体，它可以通过核苷酸的缺失、插入或取代由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列获得，同时保留了衍生合成蛋白的酶促活性。
所述DNA序列可以以SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示DNA序列或这些序列的部分为原始材料分别得到，例如，使用常规杂交方法或PCR技术已从诸如上述真核生物的其他真核生物中获得。所述DNA序列在标准条件下与上述序列杂交。优选使用杂交短寡核苷酸，例如其保守区，该保守区可以用本领域技术人员所公知的方法通过与其他乙炔酶和/或脱饱和酶进行比较而确定。优选使用组氨酸框序列，不过，还可将所述新型核酸的较长的片段或其全长序列用于杂交。所述标准条件根据所使用的核酸而有所不同根据所使用的是哪一种类型的核酸(DNA或RNA)将寡核苷酸、较长片段或全长序列用于杂交。因此，例如，DNADNA杂合体的解链温度比相同长度的DNARNA杂合体的解链温度低大约10℃。
例如，标准条件表示，根据核酸的类型，在浓度为0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH7.2)的含水缓冲液中的温度为42-58℃，或者另外存在50％的甲酰胺，例如，42℃在5×SSC，50％的甲酰胺中。DNADNA杂合体的杂交条件优选为0.1×SSC，温度为大约20-45℃，优选大约30-45℃。DNARNA杂合体的杂交条件优选为0.1×SSC，温度为大约30-55℃，优选大约45-55℃。上述杂交温度是解链温度，是通过在没有甲酰胺的条件下用长度为大约100个核苷酸并且G+C含量为55％的核酸计算的。DNA杂交的实验条件披露于相关遗传学教科书中，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室，1989，并且，可以通过本领域技术人员所公知的公式计算，例如，根据核酸的长度，杂合体的性质或G+C含量计算。本领域技术人员可以在以下教科书中找到杂交的进一步的信息Ausubel等著，1985，当代分子生物学方法，John Wiley&Sons，纽约，Hames和Higgins(著)，1985，核酸杂交实践方法，牛津大学出版社IRL出版社，牛津；Brown(著)，1991，基础分子生物学实践方法，牛津大学出版社IRL出版社，牛津。
衍生物还表示SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11的序列的同系物，例如，真核同系物、截短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA，或编码和非编码DNA序列的RNA。
另外，SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11的同系物表示衍生物，如启动子变体。所述变体可以通过一个或多个核苷酸的交换，通过插入和/或缺失而进行修饰，不过，这种修饰不会损害启动子的功能和效力。另外，所述启动子可以通过修饰其序列而增强其效力，或者用甚至是来自异源生物的更有效的启动子来完全取代它。
衍生物还可以优选表示这样的变体，其核苷酸序列在起始密码子上游的-1至-2000的片段上进行过修饰，以便改变基因表达和/或蛋白表达，优选增强基因表达。衍生物还表示在3’末端修饰过的变体。
衍生物还表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反义DNA。所述反义DNA属于本发明的无功能衍生物。如不具有酶促活性的衍生物。本领域技术人员所公知的生产无功能衍生物的其他方法有所谓的共抑制，核糖酶和内含子的使用。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够裂解与它具有互补性的单链核酸，如mRNA。这样就可以利用所述核糖酶催化裂解mRNA(Haselhoff和Gerlach，自然，334，1988585-591，从而抑制该mRNA的翻译。这种类型的核糖酶可以就其目的特异性地添加或切割(hin zugeschnitten)(US4987071；US5116942和Bartel等，科学261，1993，1411-1418)。因此，可以利用反义DNA制备较高含量饱和脂肪酸的脂肪酸、脂类或油。
编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶的新型核酸序列可以通过合成制备或者从天然来源分离或者包括合成的和天然DNA成分的混合物，并且包括来自各种生物的异源Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因片段。一般，合成核苷酸序列是用合适的宿主生物，例如植物所优选的密码子生产的。这通常会导致异源基因的最佳表达。所述植物优选的密码子是从具有最大蛋白频率的密码子中确定的，所述蛋白能在大多数感兴趣的植物物种中表达。谷氨酸棒杆菌的一种例子披露于以下文献Wada等(1992)核酸研究20，2111-2118。这种类型的实验可以用本领域技术人员所公知的标准方法进行。
编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的功能性等同序列是这种新型序列的这样的衍生物，尽管它具有不同的核苷酸序列，但仍然具有所需功能，就是说具有这种蛋白的酶促活性。因此，功能性等同物包括上述序列的天然变体，和人工核苷酸序列，例如，通过化学合成获得并适应植物的密码子使用。
另外，人工DNA序列是合适的，只要它能如上文所述赋予所需特性，例如通过在作物中超量表达Δ6-乙炔酶/Δ 6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因提高植物中脂肪酸、油或脂类的Δ6三键或Δ6双键的含量。所述人工DNA序列可以通过具有Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶活性的构建蛋白的分子模拟反翻译或通过提外筛选建立。用于修饰或改进DNA序列的DNA体外进化的可能技术披露于以下文献中Patten，P.A.等，生物技术当代观点(Current Opinion inBiotechnology)8，724-733(1997)，或Moore，J.C.分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)272，336-347(1997)。通过遵守宿主植物所特有的密码子使用的多肽序列的反翻译所获得的编码DNA序列是特别合适的。熟悉植物遗传学方法的技术人员通过对要转化的植物中的其他已知基因进行计算机分析可以很容易确定其特定的密码子使用。
还要提到的其他合适的等同核酸序列是编码融合蛋白的序列，其中，Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶多肽或其功能性等同部分是该融合蛋白的组成成分。该融合蛋白的第二部分可以是，例如，具有酶促活性的另一种多肽或一种抗原性多肽序列，借助于该序列可以检测Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶表达(例如，myc标记或his标记)。不过，它优选是调控蛋白序列，例如，ER的信号序列它能将Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶蛋白引导至需要的作用位点。
优选将所述新型过程中的Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶或Δ6-脱饱和酶基因与脂肪酸生物合成的其他基因融合。所述基因的例子有乙酰转移酶、其他脱饱和酶或延伸酶。对于体内，特别是体外合成来说，优选与诸如NADH细胞色素B5还原酶组合，这种酶能够吸收或释放还原等同物。
新型氨基酸序列表示含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ IDNO12所示序列的氨基酸序列或者多个氨基酸残基的取代、倒转、插入或缺失可以从所述序列获得的序列的蛋白，SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO12所示蛋白的酶促活性得到了保留或仅有微不足道的减弱。微不足道的减弱表示所有的酶仍然具有原始酶的酶促活性的至少10％，优选20％，更优选30％。另外，还可以，例如，用具有相似物理化学特性(胀量、碱性、疏水性等)的氨基酸取代特定的氨基酸。例如，用赖氨酸取代精氨酸残基；用异亮氨酸取代缬氨酸残基；或用谷氨酸取代天冬氨酸残基。不过，还可以有一个或多个氨基酸在其序列上发生转座、添加或缺失，或者将上述若干措施组合在一起。
衍生物还表示功能等同物，具体地讲，它还包括天然或编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶的原始分离序列的人工突变，它还具有所需要的功能，就是说其酶促活性只有微不足道的减弱。突变包括一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、转座或插入。因此，举例来说，本发明还包括通过修饰Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶的核苷酸序列而获得的核苷酸序列。例如，所述修饰的目的可以是进一步定位它所包含的编码序列，或者，例如，还可以插入其他限制酶裂解位点。
功能等同物还可以是这样的变体，其功能与原始基因或基因片段相比减弱(＝微不足道的减弱)或增强(＝酶促活性大于原始酶的酶促活性，就是说该活性超过100％，优选超过110％，特别优选超过130％)。
例如，所述核酸序列还可以优选是DNA或cDNA序列。例如，适合于插入新型表达框上的编码序列有具有上述序列的编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶的编码序列，并且能赋予宿主超量产生在6号位置上具有三键和/或双键的脂肪酸、油或脂类的能力。所述序列可以是同源或异源来源的。
所述新型表达框(＝核酸结构或片段)表示SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或SEQ ID NO11所示序列，并且它是由遗传密码和/或其功能性或非功能性衍生物产生的，该序列优选与一种或多种调控信号功能性连接，以便增强基因表达，并且能操纵该编码序列在宿主细胞中的表达。所述调控序列的用途是使得所述基因能够特异表达并使得蛋白能够表达。例如，这可能意味着，根据宿主生物，所述基因是只能在诱导之后表达和/或超量表达，或者立即表达和/或超量表达。例如，所述调控序列是那些结合诱导剂或抑制剂的序列，并因此调控核酸的表达。除了所述新型调控序列之外或者作为所述序列的替代，在实际结合基因的前面可能还存在该序列的天然调控，如果必要，可以进行遗传学修饰，以便关闭所述天然调控，并增强所述基因的表达。不过，所述基因还可以具有简单结构，就是说在该核酸序列或其衍生物前面没有其他调控信号，并且天然启动子及其调控没有缺失。取而代之的是，对天然调控序列进行诱变，以便该调控不再发生和/或基因表达得到增强。所述修饰启动子也可以部分序列形式(＝具有新型核酸序列部分的启动子)单独存在于天然基因前面，以便增强其活性。另外，基因结构可优选包括一个或多个与启动子功能性连接的所谓增强子序列，它可以使得核酸序列表达加强。还可以DNA序列的3’末端插入其他有利的序列，如其他的调控因子或终止子。Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶可以一个或多个拷贝形式存在于表达框(＝基因结构)中。
另外，如上文所述，所述调控序列或因子优选对插入基因的表达具有有利影响，并因此增强其表达。因此，通过使用诸如启动子和/或“增强子”的强转录信号，可以在转录水平上实现调控因子的有利的增强。不过，例如，通过改善mRNA的稳定性也可以增强翻译。
原则上讲，所述表达框中的合适启动子是能够在生物中，优选在植物或真菌中控制外源基因表达的所有启动子。优选使用特殊的植物启动子或源于植物病毒的启动子。例如，用于所述新方法的优选调控序列存在于以下启动子中(cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、λ-PR-或存在于λ-PL启动子中，这些序列优选用于革兰氏阴性细菌中。其他优选的调控序列存在于，例如，革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，存在于酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或存在于植物启动子中，如CaMV/35S[Franck等，细胞(cell)21，1980，285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos(＝研制氨酸合成酶启动子)或存在于遍在蛋白启动子中。所述表达框还可以包括一个化学诱导型启动子，通过该启动子可以在特定时间控制外源Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因在生物，优选在植物中的表达。所述优选植物启动子的例子有PRP1启动子[Ward等，植物分子生物学22，1993，361-366]，苯磺酰胺诱导型(EP388186)、四环素诱导型(Gatz等，1992，植物杂志，2，397-404)、水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、脱落酸诱导型(EP335528)或乙醇或环己酮诱导型(WO93/21334)启动子。有源于马铃薯的细胞质FBP酶启动子、源于马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO杂志8，1989，2445-245)、源于大豆的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶(参见Genbank保藏号U87999)或披露于EP249676中的节专一性启动子。特别优选的植物启动子是这样的启动子它能确保在发生脂肪酸或其前体生物合成的组织或植物部分/器官中表达，例如，在胚乳或在发育中的胚胎中表达。优选的启动子特别要提到能确保种子专一性表达的启动子，例如USP启动子或其衍生物，LEB4启动子，菜豆蛋白启动子或napin启动子。特别优选的USP启动子或其衍生物能在种子发育的极早期阶段介导基因表达(Baeumlein等，分子基因遗传学，1991，225(3459-67)。可用于单子叶植物和双子叶植物的其他优选种子专一性启动子有适用于双子叶植物的启动子，如源于油用油菜的napin基因启动子(US5608152)、源于拟南芥属的油质蛋白启动子(WO98/45461)、源于(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子(US5504200)、源于芸薹属(Brassica)的Bce4启动子(WO91/13980)或Leguminosen B4启动子(LeB4、Baeumlein等，植物杂志，2，2，1992233-239)或适合于单子叶植物的启动子，如源于大麦的lpt2或lpt1基因的启动子(WO95/15389和WO95/23230)或大麦醇溶蛋白基因启动子、水稻谷蛋白基因启动子、水稻米谷蛋白(Oryzin)基因启动子、水稻谷醇溶蛋白基因启动子、小麦麦醇溶蛋白基因启动子、小麦谷蛋白基因启动子、玉米醇溶蛋白基因启动子、燕麦谷蛋白基因启动子、高粱kasirin基因启动子或黑麦secalin基因启动子，这些启动子披露于WO99/16890中。
其他特别优选的启动子是那些能够确保在脂肪酸、油类和脂类或其前体生物合成发生的组织或植物部分中表达的启动子。特别要提到的是能确保种子专一性表达的启动子。应当提到的是有源于油用油菜的napin基因启动子(US5608152)、源于蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(USP＝未知种子蛋白，Baeumlein等，分子基因遗传学，1991，225(3)459-69)、源于拟南芥属的油质蛋白基因启动子(WO98/45461)、菜豆蛋白启动子(US5504200)或豆球蛋白B4基因启动子(LeB4、Baeumlein等，植物杂志，2，2，1992233-239)。还应当提到的有诸如源于大麦的lpt2或lpt1基因的启动子(WO95/15389和WO95/23230)，该启动子能在单子叶植物中进行种子专一性表达。
如上文所述，表达框(＝基因结构，核酸结构)可以包括需要导入生物的其他基因。这些基因可以分别受到调控或者受相同区的调控，如Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因。所述基因的例子还有生物合成基因，优选脂肪酸生物合成基因，它能实现表达的增强。可以提到的例子有编码Δ15-、Δ12-、Δ9-、Δ6-、和Δ5-脱饱和酶、各种羟化酶Δ12-乙炔酶、酰基ACP硫酯酶、β-酮脂酰ACP合成酶或β-酮脂酰ACP还原酶的基因。优选将脱饱和酶基因用于核酸结构中。
如下文所述，原则上讲，可以将所有天然启动子连同它的调控序列，如上文所提到的启动子用于所述新型表达框和新的方法中。另外，还可以并且优选适用合成启动子。
为了制备表达框，可以对各种DNA片段进行操作，以便获得能方便地按正确方向阅读并且具有正确读框的核苷酸序列。为了将这些DNA片段(＝新型核酸)连接在一起，可以在所述片段上连接接头。
在启动子和终止子区沿转录方向提供接头或多接头是可行的和方便的，这些接头含有一个或多个用于插入该序列的限制位点。所述接头一般具有1-10、通常1-8个、优选2-6个限制位点。所述调控区内的接头的大小一般小于100bp，通常小于60bp，但至少为50bp。所述启动子与宿主生物，例如宿主植物的关系可以是天然的或同源的以及外源的或异源的。所述表达框沿转录的5’-3’方向包括启动子、编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的DNA序列，和转录终止区。根据需要，各种终止区可以相互取代。
其他的可能性是采用能够提供合适的限制裂解位点或消除多余的DNA或限制裂解位点的操作。当涉及到插入、缺失或取代时，如转换和颠换时，可以使用体外诱变、启动子修复、限制或连接。可以通过合适的操作，例如限制、回粘(-chewing-back-)或补平突出端形成平端来提供所述片段的互补末端用于连接。
对于优选的高水平表达来说，特殊的ER固位信号SEKDEL的连接可能是特别重要的(Schouten，A.等，植物分子生物学30，1996，781-792)，这可以使表达的平均水平翻三番或翻四番。还可以采用植物和动物蛋白天然存在的其他固位信号来构建表达框，这些信号位于ER中。
优选的聚腺苷酸化信号是植物聚腺苷酸化信号，优选基本上相当于来自根癌农杆菌的T-DNA聚腺苷酸化信号的信号，特别是Ti质粒pTiACH5的T-DNA的基因3(章鱼氨酸合成酶)(Gielen等，EMBO杂志3，1984，835ff)或相应的功能性等同物。
表达框是通过诸如披露于下列文献中的常规重组和克隆技术将合适的启动子与合适的Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶DNA序列融合并与聚腺苷酸化信号融合而制备的T.Maniatis，E.S.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，S.M.等，当代分子生物学方法，Greene出版协会，和Wiley-Interscience(1987)。
为了制备表达框，可以对各种DNA片段进行操作，以便获得便于沿正确方向阅读并且具有正确读框的核苷酸序列。为了将DNA片段连接在一起，可以在这些片段上连接接头。
沿转录方向为启动子和终止子区提供接头或多接头是可行的和方便的，这些接头含有一个或多个限制位点以便插入该序列。所述接头一般具有1-10、通常1-8个、优选2-6个限制位点。所述调控区内的接头的大小一般小于100bp，通常小于60bp，但至少为5bp。所述启动子与宿主植物的关系可以是天然的或同源的以及外源的或异源的。所述表达框沿转录的5’-3’方向包括启动子、编码Δ6-乙炔酶/脱饱和酶基因的DNA序列和转录终止区。根据需要，各种终止区可以相互取代。
为了制备表达框，可以对各种DNA片段进行操作，以便获得便于沿正确方向阅读并且具有正确读框的核苷酸序列。为了将DNA片段连接在一起，可以在这些片段上连接接受体或接头。
沿转录方向为启动子和终止子区提供接头或多接头是可行的和方便的，这些接头含有一个或多个限制位点以便插入该序列。所述接头一般具有1-10、通常1-8个、优选2-6个限制位点。所述调控区内的接头的大小一般小于100bp，通常小于60bp，但至少为5bp。所述启动子与宿主植物的关系可以是天然的或同源的以及外源的或异源的。所述表达框沿转录的5’-3’方向包括启动子、编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶或Δ6-脱饱和酶基因的DNA序列和转录终止区。根据需要，各种终止区可以相互取代。
源于角齿藓(Ceratodon purpureus)的编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶的DNA序列包括实现脂肪酸、脂类或油类生物合成位点正确定位所必需的所有序列特征。因此，不需要其他引导序列本身。不过，所述定位可能是需要的和有利的，并因此进行人工修饰或增强，以便所述融合结构同样也是本发明的优选的和有利的实施方案。
特别优选的序列是能确保在质体中定向的序列。在某些场合下，还可以需要在其他区室中的定向(披露于Kermode，Crit.Rev.BlantSci.15，4，1996，285-423)，例如，在液泡、线粒体、内质网(ER)、过氧化物酶体、脂质体中，或者通过缺失相应操纵序列(operativerSequenzen)保留在生产区室、细胞质中。
优选将所述基因型核酸序列与至少一个报导基因一起克隆到表达框上，通过载体将该表达框导入生物，或直接导入基因组。该报导基因应当可以通过生长、荧光、化学或生物发光或抗性测定或通过光学测定方便地检测。可以提到的报导基因的例子有抗生素或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因，如Ura3基因、Ilv2基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖醛酸酶、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因或BASTA(＝草甘膦抗性基因)。通过这些基因可以方便地测定并量化转录活性，并因此测定并量化基因的表达。因此，可以确定基因组中在产量方便表现出差异的位点。
在一种优选实施方案中，在表达框上游，即位于编码序列的5’末端包括一个启动子，和下游，即位于其3’末端一个聚腺苷酸化信号，以及，如果需要的话还包括可操作地与编码序列连接的调控因子，该因子位于Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因DNA序列之间。可操作地连接表示启动子、编码序列、终止子以及如果必要的话还有调控因子按顺序的排列，其排列方式使得每一个调控因子能够在编码序列的表达中实现其预定功能。用于可操作连接的优选序列是引导序列，用于确保在质体中的亚细胞定位。不过，如果需要的话还可以使用确保在线粒体中、内质网中、细胞核中、油质体或其他区室中亚细胞定位的引导序列，以及翻译增强子，如源于烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等，核酸研究15，1987，8693-8711)。
例如，表达框可以包括组成型启动子(优选USP或napin启动子)、要表达的基因和ER固位信号(Retentionssignal)。优选使用的ER固位信号的氨基酸序列为KDEL(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)。
为了表达，将所述表达框插入原核或真核宿主生物中，例如，插入微生物中，如真菌或植物，优选插入载体中，例如，质粒、噬菌体或其他DNA，所述其他DNA能够优化所述基因在宿主生物中的表达。合适质粒的例子有存在于大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列，如pBR322、pUC系列，如pUC18或pUC19，M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pLBM24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，存在于链霉属中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，存在于芽孢杆菌属中的pUB110、pC194或pBD214，存在于棒杆菌中的pSA77或pAJ667，存在于真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，其他优选的真菌载体披露于以下文献中Romanos，M.A.等[1992，“酵母中的外源基因表达，综述”酵母8423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等[1991，“丝状真菌的异源基因表达”]和真菌中的多基因操纵[J.W.Bennet&L.L.Lasure著，396-428页学术出版社SanDiego]，以及“用于丝状真菌的基因转移系统和载体开发”[van denHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.，1991，真菌的应用分子遗传学，Peberdy，J.F.等著，1-28页，剑桥大学出版社，剑桥]。优选酵母启动子的例子有2μM、pAG-1、YeP6、YeP13和pEMBLYe23。藻类或植物启动子的例子有pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH和pDH51(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.1988)。上述载体或上述载体的衍生物只代表了少数可选自使用的质粒。其他质粒为本领域技术人员所公知，并且可以参考以下教科书，例如克隆载体(Pouwels P.H.等Elsevier著，阿姆斯特丹-纽约-牛津，1985，ISBN0444904018)。合适的植物载体特别披露于植物分子生物学和生物工程方法(CRC出版社)，6/7章，71-119页。优选载体是能够在大肠杆菌和农杆菌属复制的穿梭载体和二元载体。
除了质粒之外，载体还可以表示本领域技术人员所公知的所有其他载体，例如噬菌体、病毒，如SV40、CMV、杆病毒、腺病毒、转座子、IS因子、噬粒、粘粒、线性或环状DNA。这些载体在宿主生物中可以自主复制或进行染色体复制；优选染色体复制。
在载体的其他实施方案中，所述新型表达框还可以优选以线性DNA形式导入所述生物，并通过异源或同源重组进入该宿主生物的基因组。该线性DNA可以包括线性化的质粒，或者仅包括作为载体的表达框或新型核酸序列。
在其他优选实施方案中，所述新型核酸序列还可以单独导入生物中。
除了所述新型核酸序列之外，如果还要将其他基因导入所述生物，可以将存在于同一个载体上的所有基因连同报导基因一起导入生物，或者将存在于一个载体上的每一个基因连同报导基因分别导入生物，在后一种情况下，所述各种载体可以同时导入或顺序导入。
所述载体优选包括至少一个拷贝的新型核酸序列和/或新型表达框。
例如，可以将植物表达框整合到烟草转化载体pBinAR中。


图1表示具有35S启动子的烟草转化载体pBinAR(C)和具有USP启动子的pBin-USP(D)。原始载体如
图1(A)和
图1(B)所示。另一种可能性是重组载体(＝表达载体)进行体外转录和翻译，例如通过使用T7和T7RNA聚合酶。
用于原核生物的表达载体通常使用有或没有融合蛋白或融合寡肽的诱导型系统，所述融合可以发生在N-末端和C-末端或其他结构域上，这些结构域可用于蛋白中。这种类型的融合载体通常用于i)提高RNA表达速度，ii)提高可以得到的蛋白合成速度，iii)提高蛋白的溶解度，或iv)通过一种可用于亲和层析的结合序列简化其纯化。通常还通过融合蛋白导入蛋白裂解位点，无论融合蛋白部分如何裂解都能完成纯化过程。蛋白酶可识别的序列如因子Xa、凝血酶和肠激酶。
典型的优选融合和表达载体由pGEX[Pharmacia生物技术公司；Smith，D.B.和Johnson，K.S.1988基因6731-40]pMAL(新英格兰生物实验室，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白V。
大肠杆菌表达载体的其他例子有pTrc[Amann等，1988基因69301-315]和pET载体[Studier等，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，San Diego，Caiifornia，1990，60-89；Stratagene，阿姆斯特丹，荷兰]。
用于酵母的其他优选载体包括pYepSecl(Baldari等，1987，EMBO杂志6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，细胞30933-943)、pJRY88(Schultz等，1987，基因54113-123)，和pYES衍生物(Invitrogen公司，San Diego，CA)。用于丝状真菌中的载体披露于以下文献中van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.1991“用于丝状真菌基因转移系统和载体开发”，真菌的应用分子遗传学，J.F.Peberdy等著，1-28页，剑桥大学出版社，剑桥。
其他的并且是优选的可能性是使用昆虫细胞表达载体，例如，用于在Sf9细胞中表达的载体。其例子有pAc系列的载体(Smith等1983分子细胞生物学32156-2165)和pyal系列的载体(Lucklow和Summers1989病毒学17031-39)。
同样可能和优选的是将植物细胞或藻类细胞用于基因表达。植物表达载体的例子可以参见D.等1992“具有位于靠近左臂的选择标记的新型植物二元载体”，植物分子生物学201195-1197，或者参见Bevan，M.W.1984“植物转化的二元农杆菌属载体”，核酸研究128711-8721。
所述新型核酸序列还可以在哺乳动物细胞中表达。合适表达载体的例子有pCDM8和pMT2PC，披露于Seed，B.1987自然329840或Kaufman等1987EMBO杂志187-195。在上述情况下，优选使用的启动子是来源于病毒的启动子，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨噬细胞病毒或猿病毒40的启动子。其他原核和真核表达系统披露于Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1989的第16和17章。
原则上讲，将新型核酸、表达框或载体导入生物，例如植物，可以通过本领域技术人员所公知的所有方法进行。
在以下教科书中技术人员可以找到适用于微生物的方法Sambrook，J.等1989，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，F.M.Ausubel等，1994当代分子生物学方法，John Wiley和Sons，D.M.Glover等，DNA克隆，1卷，1995，IRL出版社(ISBN019-963476-9)，Kaiser等，1994，酵母遗传学方法，冷泉港实验室出版社，或Guthrie等，酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法，1994，学术出版社。
外源基因向植物基因组中的转移被称为转化。在这种情况下，使用所披露的用于瞬时或稳定转化的从植物组织或植物细胞转化和再生的方法。合适的方法包括通过聚乙二醇诱导的DNA摄取的原生质体转化，使用基因枪的轰击方法-所谓的粒子轰击方法，电穿孔，在含有DNA的溶液中培养干燥胚胎，显微注射和农杆菌属介导的基因转移。例如，上述方法披露于以下文献中B.Jenes等，基因转移技术，转基因植物，1卷，工程和应用，S.D.Kung和R.Wu著，学术出版社(1993)128-143和Potrykus植物生理学植物分子生物学年度综述42(1991)205-225。优选将要表达的结构克隆到适合转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等，核酸研究12，1984，8711)。用所述载体转化过的农杆菌随后可以已知方式用于转化植物，特别是作物类植物，例如，烟草植物，例如，通过将受伤的叶片或叶子碎片浸泡在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养。例如，用根癌农杆菌转化植物的方法披露于Hofgen和Willmitzer，核酸研究(1988)16，9877，或者特别披露于F.F.White，用于高等植物基因转移的载体；转基因植物，1卷，工程和应用，S.D.Kung和R.Wu著，学术出版社，1993，15-38页。
用新型表达载体转化过的农杆菌同样可以已知方式用于转化植物，如试验植物，如拟南芥属或作物类植物，如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、辣椒、油用油菜、木薯、木薯、葛、万寿菊、苜蓿、莴苣和各种树木、坚果和藤本植物，特别是产油的作物类植物，如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油用油菜、椰子、油用棕榈、红花或可可豆，例如，通过将受伤的叶片或叶子碎片浸泡在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养。
遗传学修饰过的植物细胞可以通过技术人员所公知的任何方法再生。合适的方法可以在上述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Fofgen和Willmitzer的文献中找到。
原则上讲，所述新型核酸、表达框或载体的适合的和优选的生物或宿主生物是能够合成脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸或适合表达重组基因的所有生物。可以提到的例子有植物，如拟南芥属、紫菀属，如金盏花属或作物类植物，如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油用油菜、椰子、油棕榈、红花或可可豆，微生物，如真菌，例如，被胞霉属、水霉属或腐霉属，细菌，如埃希氏菌属，酵母，如酵母属、兰细菌属、纤毛虫、藻类或原生动物，如双鞭甲藻，如crypthecodinium。优选能够以较大的产量天然合成油类的生物，如真菌，如高山被胞霉、Pythium insidiosum或植物，如大豆、油用油菜、椰子、油棕榈、红花、蓖麻、金盏花属、花生、可可豆或向日葵或酵母，如酿酒酵母，特别优选的是大豆、油用油菜、向日葵、金盏花属或酿酒酵母。原则上讲，转基因动物也适合用作宿主生物，例如，C.elegans。
可以使用的宿主细胞还披露于以下文献中Goeddel，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，San Diego，CA(1990)。
可以使用的表达菌株，例如，具有较低蛋白酶活性的菌株披露于以下文献中Gottesman，S.基因表达技术酶学方法185，学术出版社，San Diego，CA(1990)119-128。
本发明还涉及用含有编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的DNA序列或能与该序列杂交的DNA序列的表达框转化植物细胞或组织或部分。该用途的目的是为了提高在6号位置上具有较高含量的三键和双键的脂肪酸、油类或脂类的含量。
另外，根据启动子的选择，可以让Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的表达专一性地在植物的叶片、种子、块茎或其他部分进行。本发明的其他方面有能超量产生所述具有Δ6三键或Δ6双键的脂肪酸、油类或脂类的转基因植物、及繁殖材料及其植物细胞、组织或部分。本发明优选涉及含有新型功能性或非功能性(＝反义DNA或酶促活性失活的酶)核酸序列或功能性或非功能性表达框的转基因植物。
含有Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因序列的表达框或新型核酸序列可用于转化上述生物，例如细菌、兰细菌、酵母、丝状真菌、纤毛虫和藻类，其目的是提高具有Δ6三键或Δ6双键的脂肪酸、油类或脂类的含量。
例如，对于本发明来说，提高具有Δ6三键或Δ6双键的脂肪酸、油类或脂类的含量意味着人工获得的通过在新型生物，优选新型转基因植物中功能性超量表达Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因人工获得的较高的生物合成能力，这种提高是相对没进行过遗传修饰的原始植物而言的，这种提高至少能持续一个植物世代。
例如，脂肪酸、油类或脂类的生物合成部位一般是种子或种子的细胞层，因此Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的种子专一性表达是有效的。不过，很显然，脂肪酸、油类或脂类的生物合成不一定局限于种子组织，而且还可以组织专一性形式在植物的所有其他部分进行，例如，在上皮细胞或在块茎中进行。
另外，优选外源Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的组成型表达。不过，另一方面，诱导型表达也是需要的。
可以测定转基因Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的表达效果，例如，在体外通过芽分生组织繁殖测定(Spro Bmeristemvermehrung)。另外，可以在温室实验中用试验植物测定Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因的性质改变和表达水平，及其对脂肪酸、油类或脂类生物合成活性的影响。
本发明还涉及用含有Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶基因序列或能与这些序列杂交的DNA序列的表达框转化过的转基因植物，并且涉及所述植物的转基因细胞、组织、部分和繁殖材料。在这一方面，特别优选的是转基因作物类植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、油用油菜和canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、辣椒、木薯淀粉(Tapioka)、木薯、葛、苜蓿、莴苣和各种树木、坚果和藤本植物。
用于本发明的植物有单子叶植物和双子叶植物或藻类。
另一种新的实施方案包括上文所述的转基因植物，该转基因植物包括功能性的或非功能性的新型核酸序列或功能性的或非功能性的新型表达框。非功能性表示不再有具有酶促活性的蛋白合成。另外，非功能性核酸或核酸结构还表示所谓反义DNA，它会导致转基因植物表现出酶促活性的降低或无酶促活性。反义技术，特别是当新型核酸序列与反义DNA上的其他脂肪酸合成基因组合时可用于合成具有较高饱和脂肪酸含量的甘油三酯或合成饱和脂肪酸。转基因植物表示单个的植物细胞及其在固体培养基上的培养物或液体培养物，植物的部分和全植株。
本发明还涉及-一种转化植物的方法，该方法包括将含有Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶的基因序列或能与该序列杂交的DNA序列的表达框导入植物细胞、愈伤组织、全植株或原生质体。
-将Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和/或Δ6-脱饱和酶DNA基因序列或能与该序列杂交的DNA用于通过在植物中表达该Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶DNA生产具有较高含量的具有三键或Δ6双键的脂肪酸、油类或脂类。
-一种含有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白。
-一种含有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白。
-将具有SEQ ID NO8和SEQ ID NO10所示序列的蛋白用于生产不饱和脂肪酸。
本发明还涉及一种生产不饱和脂肪酸的方法，该方法包括将至少一种上述新型核酸序列或至少一种新型核酸结构导入优选的产油生物中，培养该生物，并分离该生物所含的油，并释放所述油中所含的脂肪酸。所述不饱和脂肪酸优选含有Δ6三键和/或Δ6双键。例如，所述脂肪酸可以通过碱性水解，例如用氢氧化钠或氢氧化钾水解从油类或脂类中释放。
本发明还涉及一种制备具有较高不饱和脂肪酸含量的甘油三酯的方法，该方法包括将至少一个上述新型核酸序列或至少一个新型表达框导入产油生物中，培养该生物，并分离该生物所含的油。
本发明还涉及一种制备具有较高不饱和脂肪酸含量的甘油三酯的方法，该方法是这样实现的，将具有饱和或不饱和或饱和和不饱和脂肪酸的甘油三酯与由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、或SEQ ID NO11的序列之一所编码的至少一种蛋白一起培养。该方法优选是在有能够摄取或释放还原性等同物的化合物存在的条件下进行的。然后，可以从甘油三酯中释放出脂肪酸。
如权利要求16或17所述的方法，其中，脂肪酸是从甘油三酯中释放的。
上述方法优选可以合成具有较高含量的具有Δ6三键和/或Δ6双键的脂肪酸的脂肪酸或甘油三酯。
还可将所谓的反义技术用于制备具有较高含量饱和脂肪酸或甘油三酯的方法中。
所述方法可以使用的生物的例子有植物，如拟南芥属、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、油用油菜和canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、辣椒、木薯淀粉、木薯、葛、苜蓿、花生、蓖麻、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆、微生物，如真菌被胞霉属、水霉属或腐霉属，细菌，如埃希氏菌属、兰细菌，酵母，如酵母属、藻类或原生动物，如双鞭甲藻，如crypthecodinium。优选能够以较大产量天然合成油类的生物，如微生物，如真菌，如高山被胞霉(Mortierella alpina)、Pythiuminsidiosum或植物，如大豆、油用油菜、椰子、油棕榈、红花、蓖麻、金盏花属、花生、可可豆或向日葵或酵母，如酿酒酵母；特别优选的是大豆、油用油菜、向日葵、金盏花属或酿酒酵母。
在所述方法中，根据宿主生物，用本领域技术人员所公知的方法生长或培养生物。微生物通常是在0-100℃，优选10-60℃，同时通氧气的条件下在液体培养基中的培养的，培养基中含有碳源，通常是蔗糖形式的，氮源，通常是有机氮形式的，如酵母提取物或盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、锰、镁盐，如果需要的话还可以有维生素。在此期间营养液的pH可以保持在固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以批量形式、半批量形式或连续形式进行。养分可以在发酵开始时引入或者随后半连续或连续地供给。
在转化之后，首先按上述方法再生植物，然后按常规方法培养或生长。
在培养之后，用常规方法从生物中分离脂类。为此，在收获之后可以首先将生物粉碎或直接使用。优选用合适的溶剂提取脂类，如非极性溶剂，如己烷或乙醇，异丙醇或混合物，如己烷/异丙醇，苯酚/氯仿/异戊醇，温度为0-80℃，优选20-50℃。通常用过量的溶剂提取生物物质，例如相对生物物质为1∶4的过量的溶剂。然后除去溶剂，例如，通过蒸馏除去。所述提取还可以用超临界二氧化碳进行。可以除去提取之后所残留的生物物质，例如通过过滤除去。
用这种方法所获得的粗制油随后可做进一步的纯化，例如，通过添加诸如丙酮或氯仿的极性溶剂除去浊度，随后过滤或离心。还可以在柱上做进一步的纯化。
为了从甘油三酯中分离游离脂肪酸，可以常规方法水解甘油三酯。
本发明还涉及用上述方法制备的具有较高不饱和脂肪酸含量的不饱和脂肪酸和甘油三酯，并且涉及将其用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品的用途。为此，以常规用量将其添加到人类食品、动物饲料、化妆品或药品中。
通过以下实施例对本发明做详细说明
用存在于根癌农杆菌C58C1pGV2260或大肠杆菌中的二元载体生产转基因油用油菜植物(Deblaere等，1984，核酸研究13，4777-4788)。用存在于含有3％蔗糖的MS培养基(Murashige和Skoog1962，植物生理学15，473)(3MS培养基)中的有效转化过的农杆菌属菌落的过夜培养物的1∶50的稀释液转化油用油菜植物(品种为Drakkar，NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht，Hohenlieth，德国)。在培养皿中用农杆菌的1∶50的稀释液培养从新发芽的无菌油用油菜植物上获得的叶柄或下胚轴(分别为大约1平方厘米)5-10分钟。然后在25℃下在含有0.8％细菌用琼脂的3MS培养基中在黑暗中培养3天，然后以16小时光照/8小时黑暗的光照周期在含有500毫克/升头孢氨噻，50毫克/升卡那霉素、20微摩尔苄基氨基嘌呤(BAP)和1.6克/升葡萄糖的MS培养基中的继续培养1周。将生长中的芽转移到含有2％蔗糖、250克/升头孢氨噻和0.8％细菌用琼脂的MS培养基上。如果3周之后还没有根形式的话，将生长激素2-吲哚丁酸添加到该培养基中诱导长根。例4转基因拟南芥植物的生产通过Bechtold，N.，Ellis，J.和Pelletier，G.所披露的花浸润方法(参见植物，通过浸润层联拟南芥植物由农杆菌介导的基因转移，C.R.Acad.Sci.Paris，生命科学316，1993，1194-119[有遗漏])或者通过根转化方法转化拟南芥哥伦比亚Col0变种(Lehle种子，Round Rock，Texas，美国)。例5用Pareddy，D.，Petolino，J.，Skokut，T.，Hopkins，N.，Miller，M.，Welter，M.，Smith，K.，Clayton，D.，Pescitelli，S.，Gould，A.，所披露的方法转化玉米植物(通过氦轰击进行的玉米转化，Maydica42(2)143-154，1997)。例6从角齿藓中分离并克隆Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和Δ6-脱饱和酶为了从角齿藓中分离编码Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和Δ6-脱饱和酶的DNA序列，用编码Δ5-(EMBL保藏号Z81122)和Δ6-脂肪酸脱饱和酶(U79010，AJ222980，AF031477)的DNA序列制备各种简并寡核苷酸引物引物A5’-TGG TGG AA(A/G)TGG A(A/C)I CA(C/T)AA-3’，由氨基酸序列WWKW(N/T/K)H(N/K)推测的正向引物引物B5’-(T/G)GI TGG AA(A/G)(T/G)(G/A)I(A/C)AI CA(C/T)AA-3’由氨基酸序列(G/W)WK(E/D/W)(N/Q/K)H(N/K)推测的正向引物引物C5’-AT(A/T/G/C)T(T/G) (A/T/G/C)GG (A/G)AA(A/T/G/C)A(A/G) (A/G)TG(A/G)TG-3’，由氨基酸序列(I/M)(H/Q/N)PF(L/F)HH推测的反向引物通过聚合酶链式反应(PCR)，用引物A和引物C扩增单链角齿藓cDNA，两个长度为557bp(Cer3)和575bp(Cer16)的cDNA片段，并用引物B和引物C扩增长度为560bp的DNA片段(Cer1)。扩增时使用以下程序94℃10分钟，暂停，在72℃下热启动，然后94℃20秒共进行32轮，45℃1分钟(退火温度Tm)，和72℃1分钟，72℃10分钟进行1轮，并在4℃下结束。扩增时使用Taq DNA聚合酶(GibcoBRL)。
将来自上述两个PCR扩增的双链DNA片段连接到pGM-T载体(Promega)上，转入大肠杆菌XL1blue MRF’Kan(Stratagene)中，并用ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction试剂盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt)测序。Cer1和Cer3DNA亚序列具有70％的同一性。对于Cer1来说，上述DNA亚序列编码具有173个氨基酸的开放读框(SEQ ID NO5＝Cer1的没有引物的部分核苷酸序列，而SEQ ID NO6＝Cer1的部分推测的氨基酸序列)，对于Cer3来说，具有172个氨基酸(SEQ ID NO7＝Cer3的没有引物的部分核苷酸序列，而SEQ ID NO8＝Cer3的部分推测的氨基酸序列)，而对于Cer16来说，具有178个氨基酸(SEQ ID NO9＝Cer16的没有引物的部分核苷酸序列，而SEQ ID NO10＝Cer16的部分推测的氨基酸序列)。Cer1的衍生蛋白序列与Cer3具有64％的氨基酸同一性，而与Cer16的衍生蛋白序列与Cer3具有28％的氨基酸同一性；而Cer3和Cer16具有27％的氨基酸同一性。
Cer1和Cer3蛋白表现出与展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)Δ6-酰基脂脱饱和酶具有最大的相似性(Girke等，植物杂志15，1998，39-48)，而Cer16表现出与来自高等植物的Δ6-酰基脂脱饱和酶和Δ8-鞘脂脱饱和酶具有最大的相似性。
慕尼黑大学植物学系的Fritz Thummler提供了直接的角齿藓(Ceratodon purpureus)λZAP cDNA文库(Pasentsis等，植物杂志，13，1，199851-61)。对该角齿藓文库进行PCR测试，其中，特定的引物来自上述DNA亚序列Cer1、Cer3和Cer16具有的正向和反向引物是Cer15’CGAATGAGTGCGACGAAC-3’+5’-AATAACCTGGGCTCTCAC-3’
Cer35’-ATGAGGATATTGATACTCTC-3’+5’-GCAATCTGGGCATTCACG-3’Cer165’-GACATCAAAGCTCTTCTC-3’+5’-GGCGATGAGAAGTGGTTC-3’对通过PCR由所述cDNA文库获得的扩增产物进行的限制分析(HindIII和EcorV)证实，在三种情况下都具有与来自ss-cDNA的PCR扩增产物具有相同的限制图谱，即角齿藓cDNA文库含有三种克隆Cer1、Cer3和Cer16。例7cDNA文库和全长克隆的测序将由ss-cDNA(参见例6)扩增的三个大约570bp的PCR片段Cer1、Cer3、Cer16的在pGEM-T中的DNA微量制备物交给M.Lee和S.Stymne，对来自角齿藓λZAP cDNA文库的完整长度的克隆做进一步的筛选。该DNA文库筛选同样得到了具有大约2.2kb插入片段的两种完整长度Cer1和Cer3克隆，将其以EcoRI/KpnI片段形式由λZAP载体克隆到pUC19载体的EcoRI/KpnI裂解位点上(新英格兰实验室)，并转入大肠杆菌JM105。
用Cer1和Cer3作为低严格杂交探针对该cDNA文库进行进一步的筛选发现，至少含有一个克隆存在Cer1同源性，它可能编码Δ5-脱饱和酶。
对两种大肠杆菌克隆Cer1-50和Cer3-50进行全面测序。Cer1-50的长度为2003bp(SEQ ID NO1＝源于角齿藓的Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶的核苷酸序列，具有5’和3’非翻译区和polyA)，并且编码具有483个氨基酸的开放读框(SEQ ID NO2＝源于角齿藓的Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶的推测的氨基酸序列)。Cer3-50的长度为2142bp(SEQ ID NO11＝源于角齿藓的Δ6-脱饱和酶的核苷酸序列[2142bp]，具有5’和3’非翻译区)，编码具有520个氨基酸的开放读框(SEQ ID NO12＝源于角齿藓的Δ6脱饱和酶的推测的氨基酸序列)。这两种蛋白在N-末端都具有来自细胞色素b5的高度保守的HPGG基序(Lederer F.，生物化学76，1994674-692)，以及在C-末端具有脱饱和酶所特有的三个组氨酸框(Shanklin等，生物化学，33，199412787-12794)。因此，它们是不断增长的细胞色素B5融合蛋白家族的新的成员(Napier等，植物科学趋势，4，1，19992-4)。所述三个框的第一个组氨酸被替换成谷氨酰胺，这是Δ5-和Δ6-酰基脂脱饱和酶和Δ8-鞘脂脱饱和酶的另一种特征。例8通过PCR克隆具有完整功能活性的Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶和Δ6-脱饱和酶序列，将该序列克隆到载体，并在酵母中进行功能性表达。
由角齿藓制备编码具有Δ6-乙炔酶/Δ6-脱饱和酶活性的酶的cDNA。以类似于本文所披露的实施例的形式克隆Δ6-脱饱和酶(参见SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO12)。
这一目的是这样实现的，首先根据源于角齿藓的编码Δ6-乙炔酶/脱饱和酶的Cer1cDNA制备用于聚合酶链式反应(PCR)的寡核苷酸。Cer1 5′-CC GGTACC ATG GCC CTC GTT ACC GAC-3′ +5′-CC GAATTC TTA GTG AGC GTG AAG CCG-3′Cer3 5′-CC GGTACC ATG GTG TCC CAG GGC GGC-3′+5′-CC GAATTC TCA ACT CGC AGC AAG CTG-3′源于Cer1的以下引物适用于在酵母中表达5’引物5′-AAAAGGATCCAAAATGGCCCTCGTTACCGAC-3′3’引物5′-AAAAGTCGACTTAGTGAGCGTGAAGCC-3′在PCR中将源于角齿藓的Δ6-乙炔酶/脱饱和酶cDNA用做模板。通过引物在Δ6-乙炔酶/脱饱和酶cDNA的起始密码子的前面引入一个BamHI限制裂解位点。为了进行直接克隆，在终止密码子后面引入一个SalI限制裂解位点。在Perkin Elmer PCR仪中培养含有大约1纳克/微升模板DNA、0.5微摩尔寡核苷酸和200微摩尔脱氧核苷酸(Pharmacia)、50mM氯化钾、10mMTris-HCl(pH8.3，25℃，1.5mM氯化镁)和0.02U/微升Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)的反应混合物，采用以下温度方案退火温度50℃52秒变性温度95℃52秒延伸温度72℃90秒循环次数30
将所得到的1467bp的片段连接到用EcoRV裂解过的载体pBluescript SK-(Stratagene)上。通过对照裂解pBS-Cer1鉴定到一个克隆，可以用BamHI/SalI切除它的完整的插入片段(1452bp+15个核苷酸的限制裂解位点)，并且具有以下序列(在起始和终止密码子下面划线，裂解位点用斜体字表示)。同样可以使用克隆Cer50的cDNA序列。它是一种单功能的Δ6-脱饱和酶(参见SEQ ID NO3)。由它衍生的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
为了检验所编码的酶在微生物中的功能，将来自pBS-Cer1的1467bp的BamHI/SalI片段连接到用BamHI/XhoI裂解过的表达载体pYES2(Invitrogen，Groningen，荷兰)上，并按照标准方法用新产生的质粒pYES2-Cer1转化酵母(参见Invitrogen转化方法，Groningen，荷兰)。在含有棉籽糖的培养基上培养所得到的菌落，并用半乳糖诱导Δ6-乙炔酶/脱饱和酶的基因表达(见下文)。例9转化酵母的脂类分析酵母不仅能将内源脂肪酸(160、161、180和181)而且能将外源脂肪酸整合到它的膜脂中。为了测定所表达的特定脱饱和酶的底物专一性，在培养之前将1％Targitol NP-40(w/v，Sigma)补充到CM-2％棉籽糖培养基中，以便溶解外源脂肪酸和相关的0.003％脂肪酸(母液0.3％或3％脂肪酸，溶解在5％Targitol NP-40，w/v)。预培养是这样进行的将转基因酵母菌落与3毫升CM-2％棉籽糖培养基/1％Targitol NP-40一起培养，然后在30℃下在滚动装置中培养该培养物2天，使其在600nm下的光学密度(OD600)达到4.0-4.3。对于主培养来说，用1等份的预培养物(200倍的稀释液)接种10毫升CM-2％棉籽糖/1％Targitol NP-40培养基±0.003％脂肪酸，使其OD600为0.02，并在30℃下，在摇床上以250rpm的速度摇动培养24小时。在对数生长阶段(OD600为0.5-0.6)，通过添加半乳糖至1.8％的浓度诱导试验培养物。让诱导过的细胞在30℃下再有氧生长24小时，然后在OD600为4.0-4.3时收获。
通过以2000g的速度离心10分钟收获诱导过的酵母细胞，重新悬浮在3毫升蒸馏水中，在100℃下煮沸10分钟，然后在冰上冷却，再次沉降。在90℃下用1N甲磺酸和2％二甲氧基丙烷水解细胞沉淀1小时。用石油醚提取所得到的脂肪酸甲酯(FAMEs)。通过液相层析分析提取的FAMEs，使用毛细管柱(Chrompack，WCOT融合的硅，CP-Wax-52CB，25m，0.32mm)，在170-240℃的温度梯度下20分钟，在240℃下5分钟。通过与合适的FAME标准物(Sigma)比较证实单烯酸、二烯酸、三烯酸和四烯酸甲酯的性质。没有triynoic和tetraynoic酸的参考物质。通过对FAME混合物进行合适的化学衍生，例如形成4，4-二甲氧基噁唑啉衍生物，通过GC-MS分析其性质和三键的位置(Christie，1998)。在表1中示出了来自用空白载体pYES2、用pYES2-Cer1(Δ6-乙炔酶)转化过的转基因酵母的脂肪酸甲酯的GC分析。在没有外源脂肪酸的条件下，或者在添加亚油酸(182)、γ-亚麻酸(γ-183)、α-亚麻酸(α-183)或ω-3-十八碳四烯酸(184)。
表1表示来自用空白载体pYES2、Δ6-乙炔酶(Cer1/pYES2)和Δ6-脱饱和酶(Cer3/pYES2)转化过的转基因酵母的脂肪酸甲酯进行的GC分析。在没有外源脂肪酸的条件下(-)或者在添加亚油酸(182)、γ-亚麻酸(γ-183)、α-亚麻酸(α-183)或ω-3-十八碳四烯酸(184)之后分析转基因酵母细胞。示出饲喂添加脂肪酸(粗体、黑色)，脱饱和产物(红色)以及总的脱饱和产物(最后一行)的个体总的脂肪酸组成[摩尔％]。例10制备能超量表达具有Δ6-乙炔酶/脱饱和酶活性的酶的转基因植物。
为了转化植物，制备一种通过将来自pBS-Cer1的BamHI/SalI片段连接到用BamHI/SalI裂解过的载体pBin-USP或连接到pBinAR上制备转化载体。pBin-USP和pBinAR是质粒pBin19的衍生物。PBinAR是通过将35S CaMV启动子以EcoRI-KpI片段形式(相当于花椰菜花叶病毒的6909-7437号核苷酸)(Franck等，1980，细胞，21，285)插入pBin19(Bevan等，1980，核酸研究12，8711)中而由pBin19产生的。以PvuII-HindIII片段形式分离Ti质粒的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信号(Gielen等，1984，EMBO杂志3，835)，11749-11939号核苷酸，在PuvII裂解位点上添加SphI接头，然后克隆到该载体的SphI-HindIII裂解位点，由此得到了质粒pBinAR(Hofgen和Willmitzer，1990，植物科学66，221-230)，由于从pBluescript进行了再次克隆，在启动子和终止子之间有若干可供利用的限制裂解位点。USP启动子相当于1-684号核苷酸(Genbank保藏号X56240)，在该启动子上存在USP基因的部分非编码区。用标准方法通过PCR扩增大小为684bp的启动子片段，使用商业化的T7标准引物(Stratagene)，并使用合成的引物(引物SEQ ID NO5′-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3′)。然后用EcoRI/SalI裂解该PCR片段，并插入载体pBinAR。所得到的质粒被pBinUSP。
用该结构转化拟南芥和油用油菜植物。
在含有卡那霉素和头孢氨噻的2MS培养基上获得了再生芽，并在长根之后转移到土壤中，在空气调节箱或温室中培养2周之后诱导开花，收获成熟的种子，并通过脂类分析研究Δ6-乙炔酶/脱饱和酶表达。鉴定具有较高含量乙炔类脂肪酸或在Δ6位置上具有双键的品系。在能功能性表达转基因的稳定的转化转基因品系中发现了与未转化的对照植物相比具有较高含量的乙炔脂肪酸和位于Δ6位置上的双键。例11从种子中提取脂类以类似分析酵母脂类的方法分析来自植物种子的脂类。不过，首先用研钵对植物材料进行机械匀浆，以便能够对它进行提取。
表1
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>源于角齿藓(Ceratodon purpureus)的Δ6-乙炔酶和Δ6-脱饱和酶<130>99 1388<140><141><150>19925718.3<151>1999.06.07<160>12<170>Patentln Vers.2.0<210>1<211>2040<212>DNA<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<220><221>CDS<222>(176)..(1627)<400>1ctcaggcagg tctcagttga tgagacgctg agttctgaat cctttgagct gtgtcaggct 60cggcacttgt gggatggtga aggagtgatc gatcaggagt gcaggagctg cattagtttc 120tcagggtcga tcaggttatt ctgaaaaagg ctgcgtctgt gagcagtttg caaaa atg 178Met1gcc ctc gtt acc gac ttt ctg aac ttt ctg ggc acg aca tgg agc aag 226Ala Leu Val Thr Asp Phe Leu Asn Phe Leu Gly Thr Thr Trp Ser Lys5 10 15tac agc gtg tac acc cat agc tat gct gga aac tat ggg cct acd ttg 274Tyr Ser Val Tyr Thr His Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Gly Pro Thr Leu20 2530aag cac gcc aaa aag gtt tct gct caa ggt aaa act gcg gga cag aca 322Lys His Ala Lys Lys Val Ser Ala Gln Gly Lys Thr Ala Gly Gln Thr35 4045ctg aga cag aga tcg gtg cag gac aaa aag cca ggc act tac tct ctg 370Leu Arg Gln Arg Ser Val Gln Asp Lys Lys Pro Gly Thr Tyr Ser Leu50 5560 65gcc gat gtt gct tct cac gac agg cct gga gac tgc tgg atg atc gtc 418Ala Asp Val Ala Ser His Asp Arg Pro Gly Asp Cys Trp Met Ile Val707580aaa gag aag gtg tat gat att agc cgt ttt gcg gac gac cac cct gga 466Lys Glu Lys Val Tyr Asp Ile Ser Arg Phe Ala Asp Asp His Pro Gly85 9095ggg acg gta att agc acc tac ttt ggg cgg gat ggc acg gac gtt ttc 514Gly Thr Val Ile Ser Thr Tyr Phe Gly Arg Asp Gly Thr Asp Val Phe100 105 110gca aca ttc cat cca cct gcc gca tgg aag caa ctc aat gac tac tac 562Ala Thr Phe His Pro Pro Ala Ala Trp Lys Gln Leu Asn Asp Tyr Tyr115 120 125att gga gac ctt gct agg gaa gag ccc ctt gat gaa ttg ctt aaa gac 610Ile Gly Asp Leu Ala Arg Glu Glu Pro Leu Asp Glu Leu Leu Lys Asp130 135 140 145tac aga gat atg aga gcc gag ttt gtt aga gaa ggg ctt ttc aag agt 658Tyr Arg Asp Met Arg Ala Glu Phe Val Arg Glu Gly Leu Phe Lys Ser150 155160tcc aag gcc tgg ttc ctg ctt cag act ctg att aat gca gct ctc ttt 706Ser Lys Ala Trp Phe Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asn Ala Ala Leu Phe165 170 175gct gcg agc att gcg act atc tgt tac gac aag agt tac tgg gct att 754Ala Ala Ser Ile Ala Thr Ile Cys Tyr Asp Lys Ser Tyr Trp Ala Ile180 185 190gtg ctg tca gcc agt ttg atg ggt ctc ttc gtc caa cag tgt gga tgg 802Val Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe Val Gln Gln Cys Gly Trp195 200 205ctt gcc cat gat ttc ctt cat caa cag gtc ttt gag aac cgt acc gcg 850Leu Ala His Asp Phe Leu His Gln Gln Val Phe Glu Asn Arg Thr Ala210 215 220 225aac tcc ttc ttt ggc tat ttg ttc ggc aat tgc gtg ctt ggc ttt agt 898Asn Ser Phe Phe Gly Tyr Leu Phe Gly Asn Cys Val Leu Gly Phe Ser230 235240gta tca tgg tgg agg acg aag cac aac att cat cat act gct ccg aat 946Val Ser Trp Trp Arg Thr Lys His Asn Ile His His Thr Ala Pro Asn
245 250 255gag tgc gac gaa cag tac aca cct cta gac gaa gac att gat act ctc 994Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu Asp Glu Asp Ile Asp Thr Leu260 265 270ccc atc att gcc tgg agc aag gaa att ttg gcc acc gtt gag agc aag 1042Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Glu Ile Leu Ala Thr Val Glu Ser Lys275 280 285aga att ttg cga gtg ctt caa tat cag cac tac atg att ctg cct cta 1090Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Tyr Met Ile Leu Pro Leu290 295 300 305ttg ttc atg gcc cgg tac agt tgg act ttt gga agt ttg ctc ttc aca 1138Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Ser Leu Leu Phe Thr310 315 320ttc aat cct gat ttg agc acg acc aag gga ttg ata gag aag gga aca 1186Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys Gly Leu Ile Glu Lys Gly Thr325 330 335gtt gct ttt cac tac gcc tgg ttc agt tgg gct gcg ttc cat att ttg 1234Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser Trp Ala Ala Phe His Ile Leu340345 350ccg ggt gtc gct aag cct ctt gcg tgg atg gta gca act gag ctt gtg 1282Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Ala Trp Met Val Ala Thr Glu Leu Val355360 365gcc ggt ttg ttg ttg gga ttc gtg ttt acg ttg agt cac aat gga aag 1330Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Ser His Asn Gly Lys370 375 380 385gag gtt tac aat gaa tcg aag gac ttc gtg aga gcc cag gtt att acc 1378Glu Val Tyr Asn Glu Ser Lys Asp Phe Val Arg Ala Gln Val Ile Thr390 395 400acc cgt aac acc aag cga ggc tgg ttc aac gat tgg ttc act ggg gga 1426Thr Arg Asn Thr Lys Arg Gly Trp Phe Asn Asp Trp Phe Thr Gly Gly405 410 415ctc gac acc cag att gag cat cac ctg ttt cca aca atg ccc agg cac 1474Leu Asp Thr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His420 425430aac tac ccc aag atc gca cct cag gtc gag gct ctt tgc aag aag cac 1522Asn Tyr Pro Lys Ile Ala Pro Gln Val Glu Ala Leu Cys Lys Lys His435440 445ggc ctc gag tac gat aat gtc tcc gtc gtt ggt gcc tct gtc gcg gtt 1570Gly Leu Glu Tyr Asp Asn Val Ser Val Val Gly Ala Ser Val Ala Val450 455 460465gtg aag gcg ctc aag gaa att gct gat gaa gcg tca att cgg ctt cac 1618Val Lys Ala Leu Lys Glu Ile Ala Asp Glu Ala Ser Ile Arg Leu His470475 480gct cac taa gaaatcgtcg aactttgact attcattttt ttcgcctggc 1667Ala Histacctcaaat gttcgggagc aggtgcttgg cagtgtgttc aaccggagcg cactgaaaat 1727gtgcagaatc catttccaga aattaccatt cctagctaaa tcttcttttt accaggtcgg 1787atatatgaaa cttttttgat gcaacaagta gcattcaatt gaagacattg ttcgagatat 1847aattcgcagt gtttctattc agcgggcata cgtactagtc catatcggcg gttgccgaga 1907gtttacatta ttagttggca caacgagtag atctagtgta aatttctatt tccgcatgta 1967atattactct gaatatatac cgttatctat tttcctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2027aaaaaaaaaa aaa 2040<210>2<211>483<212>PRT<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>2Met Ala Leu Val Thr Asp Phe Leu Asn Phe Leu Gly Thr Thr Trp Ser15 10 15Lys Tyr Ser Val Tyr Thr His Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Gly Pro Thr20 2530Leu Lys His Ala Lys Lys Val Ser Ala Gln Gly Lys Thr Ala Gly Gln3540 45Thr Leu Arg Gln Arg Ser Val Gln Asp Lys Lys Pro Gly Thr Tyr Ser505560Leu Ala Asp Val Ala Ser His Asp Arg Pro Gly Asp Cys Trp Met Ile65 70 75 80Val Lys Glu Lys Val Tyr Asp Ile Ser Arg Phe Ala Asp Asp His Pro
85 9095Gly Gly Thr Val Ile Ser Thr Tyr Phe Gly Arg Asp Gly Thr Asp Val100105 110Phe Ala Thr Phe His Pro Pro Ala Ala Trp Lys Gln Leu Asn Asp Tyr115 120 125Tyr Ile Gly Asp Leu Ala Arg Glu Glu Pro Leu Asp Glu Leu Leu Lys130 135 140Asp Tyr Arg Asp Met Arg Ala Glu Phe Val Arg Glu Gly Leu Phe Lys145 150 155 160Ser Ser Lys Ala Trp Phe Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asn Ala Ala Leu165 170 175Phe Ala Ala Ser Ile Ala Thr Ile Cys Tyr Asp Lys Ser Tyr Trp Ala180 185190Ile Val Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe Val Gln Gln Cys Gly195 200 205Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His Gln Gln Val Phe Glu Ash Arg Thr210 215 220Ala Asn Ser Phe Phe Gly Tyr Leu Phe Gly Asn Cys Val Leu Gly Phe225 230 235 240Ser Val Ser Trp Trp Arg Thr Lys His Asn Ile His His Thr Ala Pro245250255Asn Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu Asp Glu Asp Ile Asp Thr260 265 270Leu Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Glu Ile Leu Ala Thr Val Glu Ser275280 285Lys Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Tyr Met Ile Leu Pro290295 300Leu Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Ser Leu Leu Phe305 310 315 320Thr Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys Gly Leu Ile Glu Lys Gly325 330 335Thr Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser Trp Ala Ala Phe His Ile340 345 350Leu Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Ala Trp Met Val Ala Thr Glu Leu355 360 365Val Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Ser His Asn Gly370 375 380Lys Glu Val Tyr Asn Glu Ser Lys Asp Phe Val Arg Ala Gln Val Ile385 390 395400Thr Thr Arg Asn Thr Lys Arg Gly Trp Phe Asn Asp Trp Phe Thr Gly405 410 415Gly Leu Asp Thr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg420 425 430His Asn Tyr Pro Lys Ile Ala Pro Gln Val Glu Ala Leu Cys Lys Lys435440 445His Gly Leu Glu Tyr Asp Asn Val Ser Val Val Gly Ala Ser Val Ala450 455460Val Val Lys Ala Leu Lys Glu Ile Ala Asp Glu Ala Ser Ile Arg Leu465 470 475 480His Ala His<210>3<211>1467<212>DNA<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<220><221>CDS<222>(10)..(1461)<400>3ggatccaaa atg gcc ctc gtt acc gac ttt ctg aac ttt ctg ggc acg aca51Met Ala Leu Val Thr Asp Phe Leu Asn Phe Leu Gly Thr Thr15 10tgg agc aag tac agc gtg tac acc cat cgc tat gct gga aac tat ggg 99Trp Ser Lys Tyr Ser Val Tyr Thr His Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Gly15 202530cct act ttg aag cac gcc aaa aag gtt tct gct caa ggt aaa act gcg 147Pro Thr Leu Lys His Ala Lys Lys Val Ser Ala Gln Gly Lys Thr Ala3540 45gga cag aca ctg aga cag aga tcg gtg cag gac aaa aag cca ggc act195Gly Gln Thr Leu Arg Gln Arg Ser Val Gln Asp Lys Lys Pro Gly Thr50 55 60tac tct ctg gcc gat gtt gct tct cac gac agg cct gga gac tgc tgg 243Tyr Ser Leu Ala Asp Val Ala Ser His Asp Arg Pro Gly Asp Cys Trp65 7075atg atc gtc aaa gag aag gtg tat gat att agc cgt ttt gcg gac gac 291Met Ile Val Lys Glu Lys Val Tyr Asp Ile Ser Arg Phe Ala Asp Asp808590cac cct gga ggg acg gta att agc acc tac ttt ggg cgg gat ggc aca 339His Pro Gly Gly Thr Val Ile Ser Thr Tyr Phe Gly Arg Asp Gly Thr95 100 105 110gac gtt ttc gca aca ttc cat cca cct gcc gca tgg aag caa ctc aat 387Asp Val Phe Ala Thr Phe His Pro Pro Ala Ala Trp Lys Gln Leu Asn115 120 125gac tac tac att gga gac ctt gct agg gaa gag ccc ctt gat gaa ttg 435Asp Tyr Tyr Ile Gly Asp Leu Ala Arg Glu Glu Pro Leu Asp Glu Leu130 135 140ctt aaa gac tac aga gat atg aga gcc gag ttt gtt aga gaa ggg ctt 483Leu Lys Asp Tyr Arg Asp Met Arg Ala Glu Phe Val Arg Glu Gly Leu145 150 155ttc aag agt tcc aag gcc tgg ttc ctg ctt cag act ctg att aat gca 531Phe Lys Ser Ser Lys Ala Trp Phe Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asn Ala160 165 170gct ctc ttt gct gcg agc att gcg act atc tgt tac gac aag agt tac 579Ala Leu Phe Ala Ala Ser Ile Ala Thr Ile Cys Tyr Asp Lys Ser Tyr175 180185190tgg gct att gtg ctg tca gcc agt ttg atg ggt ctc ttc gtc caa cag 627Trp Ala Ile Val Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe Vcl Gln Gln195 200 205tgt gga tgg ctt gcc cat gat ttc ctt cat caa cag gtc ttt gag aac 675Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His Gln Gln Val Phe Glu Asn210 215 220cgt acc gcg aac tcc ttc ttt ggc tat ttg ttc ggc aat tgc gtg ctt 723Arg Thr Ala Asn Ser Phe Phe Gly Tyr Leu Phe Gly Asn Cys Val Leu225 230 235ggc ttt agt gta tca tgg tgg agg acg aag cac aac att cat cat act 771Gly Phe Ser Val Ser Trp Trp Arg Thr Lys His Asn Ile His His Thr240 245250gct ccg aat gag tgc gac gaa cag tac aca cct cta gac gaa gac att 819Ala Pro Asn Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu Asp Glu Asp Ile255 260 265 270gat act ctc ccc atc att gcc tgg agc aag gaa att ttg gcc acc gtt 867Asp Thr Leu Pro Ile Ile Ala Trp Sar Lys Glu Ile Leu Ala Thr Val275 280285gag agc aag aga att ttg cga gtg ctt caa tat cag cac tac atg att 915Glu Ser Lys Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Tyr Met Ile290 295 300ctg cct cta ttg ttc atg gcc cgg tac agt tgg act ttt gga agt ttg 963Leu Pro Leu Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Ser Leu305 310 315ctc ttc aca ttc aat cct gat ttg agc acg acc aag gga ttg ata gag 1011Leu Phe Thr Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys Gly Leu Ile Glu320 325 330aag gga aca gtt gct ttt cac tac gcc tgg ttc agt tgg gct gcg ttc 1059Lys Gly Thr Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser Trp Ala Ala Phe335 340 345 350cat att ttg ccg ggt gtc gct aag cct ctt gcg tgg atg gta gca act 1107His Ile Leu Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Ala Trp Met Val Ala Thr355 360 365gag ctt gtg gcc ggt ttg ttg ttg gga ttc gtg ttt acg ttg agt cac 1155Glu Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Ser His370 375 380aat gga aag gag gtt tac aat goa tcg aag gac ttc gtg aga gcc cag 1203Asn Gly Lys Glu Val Tyr Asn Glu Ser Lys Asp Phe Val Arg Ala Gln385390 395gtt att acc acc cgt aac acc aag cga ggc tgg ttc aac gat tgg ttc 1251Val Ile Thr Thr Arg Asn Thr Lys Arg Gly Trp Phe Asn Asp Trp Phe400 405 410act ggg gga ctc gac acc cag att gag cat cac ctg ttt cca aca atg 1299Thr Gly Gly Leu Asp Thr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met415 420 425 430ccc agg cac aac tac ccc aag atc gca cct cag gtc gag gct ctt tgc 1347Pro Arg His Asn Tyr Pro Lys Ile Ala Pro Gln Val Glu Ala Leu Cys435 440 445aag aag cac ggc ctc gag tac gat aat gtc tcc gtc gtt ggt gcc tct 1595Lys Lys His Gly Leu Glu Tyr Asp Asn Val Ser Val Val Gly Ala Ser450 455460gtc gcg gtt gtg aag gcg ctc aag gaa att gct gat gaa gcg tca att 1443Val Ala Val Val Lys Ala Leu Lys Glu Ile Ala Asp Glu Ala Ser Ile465 470 475cgg ctt cac gct cac taa gtcgac1467Arg Leu His Ala His480<210>4<211>483<212>PRT<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>4Met Ala Leu Val Thr Asp Phe Leu Asn Phe Leu Gly Thr Thr Trp Ser15 1015Lys Tyr Ser Val Tyr Thr His Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Gly Pro Thr20 25 30Leu Lys His Ala Lys Lys Val Ser Ala Gln Gly Lys Thr Ala Gly Gln3540 45Thr Leu Arg Gln Arg Ser Val Gln Asp Lys Lys Pro Gly Thr Tyr Ser505560Leu Ala Asp Val Ala Ser His Asp Arg Pro Gly Asp Cys Trp Met Ile65 70 7580Val Lys Gtu Lys Val Tyr Asp Ile Ser Arg Phe Ala Asp Asp His Pro8590 95Gly Gly Thr Val Ile Ser Thr Tyr Phe Gly Arg Asp Gly Thr Asp Val100 105 110Phe Ala Thr Phe His Pro Pro Ala Ala Trp Lys Gln Leu Asn Asp Tyr115 120 125Tyr Ile Gly Asp Leu Ala Arg Glu Glu Pro Leu Asp Glu Leu Leu Lys130 135 140Asp Tyr Arg Asp Met Arg Ala Glu Phe Val Arg Glu Gly Leu Phe Lys145 150 155160Ser Ser Lys Ala Trp Phe Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asn Ala Ala Leu165 170 175Phe Ala Ala Ser Ile Ala Thr Ile Cys Tyr Asp Lys Ser Tyr Trp Ala180185 190Ile Val Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe Val Gln Gln Cys Gly195 200 205Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His Gln Gln Val Phe Glu Asn Arg Thr210 215 220Ala Asn Ser Phe Phe Gly Tyr Leu Phe Gly Asn Cys Val Leu Gly Phe225 230 235 240Ser Val Ser Trp Trp Arg Thr Lys His Asn Ile His His Thr Ala Pro245250 255Asn Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu Asp Glu Asp Ile Asp Thr260 265 270Leu Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Glu Ile Leu Ala Thr Val Glu Ser275280 285Lys Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Tyr Met Ile Leu Pro290295 300Leu Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Ser Leu Leu Phe305 310 315 320Thr Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys Gly Leu Ile Glu Lys Gly325 330335Thr Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser Trp Ala Ala Phe His Ile340 345350Leu Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Ala Trp Met Val Ala Thr Glu Leu355 360 365Val Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Ser His Asn Gly370 375 380Lys Glu Val Tyr Asn Glu Ser Lys Asp Phe Val Arg Ala Gln Val Ile385 390 395400Thr Thr Arg Asn Thr Lys Arg Gly Trp Phe Asn Asp Trp Phe Thr Gly
405 410 415Gly Leu Asp Thr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg420 425 430His Asn Tyr Pro Lys Ile Ala Pro Gln Val Glu Ala Leu Cys Lys Lys435440 445His Gly Leu Glu Tyr Asp Asn Val Ser Va1 Val Gly Ala Ser Val Ala450 455460Val Val Lys Ala Leu Lys Glu Ile Ala Asp Glu Ala Ser Ile Arg Leu465 470475 480His Ala His<210>5<211>520<212>DNA<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>5cattcatcat actgctccga atgagtgcga cgaacagtac acacctctag acgaagacat 60tgatactctc cccatcattg cctggagcaa ggaaattttg gccaccgttg agagcaagag 120aattttgcga gtgcttcgat atcagcacta catgattctg cctctattgt tcatggcccg 180gtacagttgg acttttggaa gtttgctctt cacattcaat cctgatttga gcacgaccaa 240gggattgata gagaagggaa cagttgcttt tcactacgcc tggttcagtt gggctgcgtt 300ccatattttg ccgggtgtcg ctaagcctct tgcgtggatg gtagcaactg agcttgtggc 360cggtttgttg ttgggattcg tgtttacgtt gagtcacaat ggaaaggagg tttacaatga 420atcgaaggac ttcgtgagag cccaggttat taccacccgt aacaccaagc gaggctggtt 480caacgattgg ttcactgggg gactcgacac ccagattgag 520<210>6<211>173<212>PRT<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>6Ile His His Thr Ala Pro Asn Glu Cys Asp Glu Gln Tyr Thr Pro Leu1 510 15Asp Glu Asp Ile Asp Thr Leu Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Glu Ile20 25 30Leu Ala Thr Val Glu Ser Lys Arg Ile Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln35 40 45His Tyr Met Ile Leu Pro Leu Leu Phe Met Ala Arg Tyr Ser Trp Thr50 5560Phe Gly Ser Leu Leu Phe Thr Phe Asn Pro Asp Leu Ser Thr Thr Lys65 70 75 80Gly Leu Ile Glu Lys Gly Thr Val Ala Phe His Tyr Ala Trp Phe Ser859095Trp Ala Ala Phe His Ile Leu Pro Gly Val Ala Lys Pro Leu Ala Trp100105110Met Val Ala Thr Glu Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Val Phe115 120 125Thr Leu Ser His Asn Gly Lys Glu Val Tyr Asn Glu Ser Lys Asp Phe130 135 140Val Arg Ala Gln Val Ile Thr Thr Arg Asn Thr Lys Arg Gly Trp Phe145 150 155 160Asn Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asp Thr Gln Ile Glu165170<210>7<211>514<212>DNA<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>7cctgcatcat gctgctccga atgaatgcga ccaaaagtac acgccgattg atgaggatat 60tgatactctc cccatcattg cttggagtaa agatctcttg gccactgttg agagcaagac 120catgttgcga gttcttcagt accagcacct attctttttg gttcttttga cgtttgcccg 180ggcgagttgg ctattttgga gcgcggcctt cactctcagg cccgagttga cccttggcga 240gaagcttttg gagaggggaa cgatggcttt gcactacatt tggtttaata gtgttgcgtt 300ttatctgctc cccggatgga aaccagttgt atggatggtg gtcagcgagc tcatgtctgg 360tttcctgctg ggatacgtat ttgtactcag tcacaatgga atggaggtgt acaatacgtc 420aaaggacttc gtgaatgccc agattgcatc gactcgcgac atcaaagcag gggtgtttaa 480tgattggttc accggaggtc tcaacagaca gatt 514<210>8<211>172<212>PRT<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>8Leu His His Ala Ala Pro Asn Glu Cys Asp Gln Lys Tyr Thr Pro Ile15 10 15Asp Glu Asp Ile Asp Thr Leu Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu20 25 30Leu Ala Thr Val Glu Ser Lys Thr Met Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln35 4045His Leu Phe Phe Leu Val Leu Leu Thr Phe Ala Arg Ala Ser Trp Leu50 55 60Phe Trp Ser Ala Ala Phe Thr Leu Arg Pro Glu Leu Thr Leu Gly Glu6570 75 80Lys Leu Leu Glu Arg Gly Thr Met Ala Leu His Tyr Ile Trp Phe Asn85 90 95Ser Val Ala Phe Tyr Leu Leu Pro Gly Trp Lys Pro Val Val Trp Met100 105 110Val Val Ser Glu Leu Met Ser Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Phe Val115 120 125Leu Ser His Asn Gly Met Glu Val Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Phe Val130 135 140Asn Ala Gln Ile Ala Ser Thr Arg Asp Ile Lys Ala Gly Val Phe Asn145 150 155 160Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gln Ile Glu165170<210>9<211>535<212>DNA<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>9tgctcatcac atcgcctgta atagtataga atatgatcca gacctacagt acatccccct 60ttttgcagtg acatcaaagc tcttctctaa cctctactcc tacttctatg aaagggttat 120gccattcgat ggcgtagcac gctctctgat tgcctaccag cactggacgt tttatccaat 180aatggctgtt gctcgggtga acctctttgc ccaatccctt ctagtactga cctcgaagaa 240gcatgtgcca gacaggtggc ttgagctcgg tgctatcggt ttcttctacc tgtggttctt 300caccctcttg tcgtacctgc ccactgcacc ggagaggctt gctttcgtcc ttgtcagttt 360tgcagtgaca gggatccagc atgtacagtt ttgcctgaac cacttctcat cgccggttta 420tctaggacag ccgaagagca aggcttgggt tgaatctcaa gcacggggca ctctcaatct 480ctctacaccg gcttacatgg attggtttca cgggggtctt cagttccaga tcgag 535<210>10<211>178<212>PRT<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>10Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Ile Glu Tyr Asp Pro Asp Leu Gln1510 15Tyr Ile Pro Leu Phe Ala Val Thr Ser Lys Leu Phe Ser Asn Leu Tyr202530Ser Tyr Phe Tyr Glu Arg Val Met Pro Phe Asp Gly Val Ala Arg Ser3540 45Leu Ile Ala Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro Ile Met Ala Val Ala5055 60Arg Val Asn Leu Phe Ala Gln Ser Leu Leu Val Leu Thr Ser Lys Lys6570 75 80His Val Pro Asp Arg Trp Leu Glu Leu Gly Ala Ile Gly Phe Phe Tyr85 90 95Leu Trp Phe Phe Thr Leu Leu Ser Tyr Leu Pro Thr Ala Pro Glu Arg100 105 110Leu Ala Phe Val Leu Val Ser Phe Ala Val Thr Gly Ile Gln His Val115 120 125Gln Phe Cys Leu Asn His Phe Ser Ser Pro Val Tyr Leu Gly Gln Pro130 135 140Lys Ser Lys Ala Trp Val Glu Ser Gln Ala Arg Gly Thr Leu Asn Leu145 150 155 160Ser Thr Pro Ala Tyr Met Asp Trp Phe His Gly Gly Leu Gln Phe Gln165 170175Ile Glu<210>11<211>2160<212>DNA<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<220><221>CDS<222>(159)..(1721)<400>11cggaggtctc ttgtcgttct tggagtctgt gtcgagcttg gaatgcggta ggcgcggccg 60tttcgtggtt ttggcgttgg cattgcgcga gggcggacag tgggagtgcg ggaggtctgt 120ttgtgcatga cgaggtggtt gtaatcttcg ccggcaga atg gtg tcc cag ggc ggc 176Met Val Ser Gln Gly Gly1 5ggt ctc tcg cag ggt tcc att gaa gaa aac att gac gtt gag cac ttg 224Gly Leu Ser Gln Gly Ser Ile Glu Glu Asn Ile Asp Val Glu His Leu10 15 20gca acg atg ccc ctc gtc agt gac ttc cta aat gtc ctg gga acg act 272Ala Thr Met Pro Leu Val Ser Asp Phe Leu Asn Val Leu Gly Thr Thr25 3035ttg ggc cag tgg agt ctt tcc act aca ttc gct ttc aag agg ctc acg 320Leu Gly Gln Trp Ser Leu Ser Thr Thr Phe Ala Phe Lys Arg Leu Thr4045 50act aag aaa cac agt tcg gac atc tcg gtg gag gca caa aaa gaa tcg 368Thr Lys Lys His Ser Ser Asp Ile Ser Val Glu Ala Gln Lys Glu Ser55 60 6570gtt gcg cgg ggg cca gtt gag aat att tct caa tcg gtt gcg cag ccc 416Val Ala Arg Gly Pro Val Glu Asn Ile Ser Gln Ser Val Ala Gln Pro758085atc agg cgg agg tgg gtg cag gat aaa aag ccg gtt act tac agc ctg 464Ile Arg Arg Arg Trp Val Gln Asp Lys Lys Pro Val Thr Tyr Ser Leu90 95 100aag gat gta gct tcg cac gat atg ccc cag gac tgc tgg att ata atc 512Lys Asp Val Ala Ser His Asp Met Pro Gln Asp Cys Trp Ile Ile Ile105 110 115aaa gag aag gtg tat gat gtg agc acc ttc gct gag cag cac cct gga 560Lys Glu Lys Val Tyr Asp Val Ser Thr Phe Ala Glu Gln His Pro Gly120 125 130ggc acg gtt atc aac acc tac ttc gga cga gac gcc aca gat gtt ttc 608Gly Thr Val Ile Asn Thr Tyr Phe Gly Arg Asp Ala Thr Asp Val Phe135140 145 150tct act ttc cac gca tcc acc tca tgg aag att ctt cag aat ttc tac 656Ser Thr Phe His Ala Ser Thr Ser Trp Lys Ile Leu Gln Asn Phe Tyr155160 165atc ggg aac ctt gtt agg gag gag ccg act ttg gag ctg ctg aag gag704Ile Gly Asn Leu Val Arg Glu Glu Pro Thr Leu Glu Leu Leu Lys Glu170 175 180tac aga gag ttg aga gcc ctt ttc ttg aga gaa cag ctt ttc aag agt 752Tyr Arg Glu Leu Arg Ala Leu Phe Leu Arg Glu Gln Leu Phe Lys Ser185 190 195tcc aaa tcc tac tac ctt ttc aag act ctc ata aat gtt tcc att gtt 800Ser Lys Ser Tyr Tyr Leu Phe Lys Thr Leu Ile Asn Val Ser Ile Val200 205210gcc aca agc att gcg ata atc agt ctg tac aag tct tac cgg gcg gtt 848Ala Thr Ser Ile Ala Ile Ile Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Arg Ala Val215 220 225 230ctg tta tca gcc agt ttg atg ggc ttg ttt att caa cag tgc gga tgg 896Leu Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe Ile Gln Gln Cys Gly Trp235 240245tta tct cac gat ttt cta cac cat cag gta ttt gag aca cgc tgg ctc 944Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gln Val Phe Glu Thr Arg Trp Leu250 255 260aat gac gtt gtt ggc tat gtg gtc ggc aac gtt gtt ctg gga ttc agt 992Asn Asp Val Val Gly Tyr Val Val Gly Asn Val Val Leu Gly Phe Ser265270 275gtc tcg tgg tgg aag acc aag cac aac ctg cat cat gct gct ccg aat1040Val Ser Trp Trp Lys Thr Lys His Asn Leu His His Ala Ala Pro Asn280 285 290gaa tgc gac caa aag tac aca ccg att gat gag gat att gat act ctc 1088Glu Cys Asp Gln Lys Tyr Thr Pro Ile Asp Glu Asp Ile Asp Thr Leu295 300 305 310ccc atc att gct tgg agt aaa gat ctc ttg gcc act gtt gag agc aag 1136Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Leu Ala Thr Val Glu Ser Lys315 320325acc atg ttg cga gtt ctt cag tac cag cac cta ttc ttt ttg gtt ctt 1184Thr Met Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His Leu Phe Phe Leu Val Leu330 335 340ttg acg ttt gcc cgg gcg agt tgg cta ttt tgg agc gcg gcc ttc act 1232Leu Thr Phe Ala Arg Ala Ser Trp Leu Phe Trp Ser Ala Ala Phe Thr345 350 355ctc agg ccc gag ttg acc ctt ggc gag aag ctt ttg gag agg gga acg1280Leu Arg Pro Glu Leu Thr Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Arg Gly Thr360 365 370atg gct ttg cac tac att tgg ttt aat agt gtt gcg ttt tat ctg ctc 1328Met Ala Leu His Tyr Ile Trp Phe Asn Ser Val Ala Phe Tyr Leu Leu375380 385 390ccc gga tgg aaa cca gtt gta tgg atg gtg gtc agc gag ctc atg tct 1376Pro Gly Trp Lys Pro Val Val Trp Met Val Val Ser Glu Leu Met Ser395400 405ggt ttc ctg ctg gga tac gta ttt gta ctc agt cac aat gga atg gag 1424Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Phe Val Leu Ser His Asn Gly Met Glu410 415 420gtg tac aat acg tca aag gac ttc gtg aat gcc cag att gca tcg act 1472Val Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Phe Val Asn Ala Gln Ile Ala Ser Thr425 430 435cgc gac atc aaa gca ggg gtg ttt aat gat tgg ttc acc gga ggt ctc 1520Arg Asp Ile Lys Ala Gly Val Phe Asn Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu
440 445 450aac aga cag att gag cat cat cta ttt cca acg atg ccc agg cac aac 1568Asn Arg Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn455460 465 470ctt aat aaa att tct cct cac gtg gag act ttg tgc aag aag cat gga 1616Leu Asn Lys Ile Ser Pro His Val Glu Thr Leu Cys Lys Lys His Gly475 480 485ctg gtc tac gaa gac gtg agc atg gct tcg ggc act tac cgg gtt ttg 1664Leu Val Tyr Glu Asp Val Ser Met Ala Ser Gly Thr Tyr Arg Val Leu490 495 500aaa aca ctt aag gac gtt gcc gat gct gct tca cac cag cag ctt gct 1712Lys Thr Leu Lys Asp Val Ala Asp Ala Ala Ser His Gln Gln Leu Ala505 510 515gcg agt tga ggcatcgcag cactcgtcga aacatttttg tctgttatag 1761Ala Ser520tgttcatatg tgatcgaggg gaaaaggtcc catgctctga tctattcttc tgtagccaat 1821atttttcaat tgaaaggagg ttcctcactt atcttccatc tatcgttgca catcctgcat 1881cagagttagc gttggagtaa tgttaagcac ttgtagatta tgcccaccat tgccacattt 1941ctgttcggtt acaatcgttt gattccatgc tatcctccgt gttcatctcg ttgttataag 2001caagcttgaa aaaacatgct acgagattgg cagacgttgt cttggcagct gtagaggttg 2061gttccattca ttgtgtagta cagaactctc tcgtccctgt ttctctacat tacttgttac 2121atagtgactt tcattcacag caaaaaaaaa aaaaaaaaa2160<210>12<211>520<212>PRT<213>角齿藓(Ceratodon purpureus)<400>12Met Val Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Gln Gly Ser Ile Glu Glu Asn15 10 15Ile Asp Val Glu His Leu Ala Thr Met Pra Leu Val Ser Asp Phe Leu20 2530Asn Val Leu Gly Thr Thr Leu Gly Gln Trp Ser Leu Ser Thr Thr Phe3540 45Ala Phe Lys Arg Leu Thr Thr Lys Lys His Ser Ser Asp Ile Ser Val505560Glu Ala Gln Lys Glu Ser Val Ala Arg Gly Pro Val Glu Asn Ile Ser65 707580Gln Ser Val Ala Gln Pro Ile Arg Arg Arg Trp Val Gln Asp Lys Lys85 90 95Pro Val Thr Tyr Ser Leu Lys Asp Val Ala Ser His Asp Met Pro Gln100 105 110Asp Cys Trp Ile Ile Ile Lys Glu Lys Val Tyr Asp Val Ser Thr Phe115 120 125Ala Glu Gln His Pro Gly Gly Thr Val Ile Asn Thr Tyr Phe Gly Arg130 135 140Asp Ala Thr Asp Val Phe Ser Thr Phe His Ala Ser Thr Ser Trp Lys145 150 155 160Ile Leu Gln Asn Phe Tyr Ile Gly Asn Leu Val Arg Glu Glu Pro Thr165 170 175Leu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Arg Glu Leu Arg Ala Leu Phe Leu Arg180 185 190Glu Gln Leu Phe Lys Ser Ser Lys Ser Tyr Tyr Leu Phe Lys Thr Leu195 200 205Ile Asn Val Ser Ile Val Ala Thr Ser Ile Ala Ile Ile Ser Leu Tyr210 215220Lys Ser Tyr Arg Ala Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Met Gly Leu Phe225 230 235 240Ile Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gln Val245 250255Phe Glu Thr Arg Trp Leu Asn Asp Val Val Gly Tyr Val Val Gly Asn260 265 270Val Val Leu Gly Phe Ser Val Ser Trp Trp Lys Thr Lys His Asn Leu275 280 285His His Ala Ala Pro Asn Glu Cys Asp Gln Lys Tyr Thr Pro Ile Asp
290295300Glu Asp Ile Asp Thr Leu Pro Ile Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Leu305 310315320Ala Thr Val Glu Ser Lys Thr Met Leu Arg Val Leu Gln Tyr Gln His325 330 335Leu Phe Phe Leu Val Leu Leu Thr Phe Ala Arg Ala Ser Trp Leu Phe340 345 350Trp Ser Ala Ala Phe Thr Leu Arg Pro Glu Leu Thr Leu Gly Glu Lys355 360 365Leu Leu Glu Arg Gly Thr Met Ala Leu His Tyr Ile Trp Phe Asn Ser370 375 380Val Ala Phe Tyr Leu Leu Pro Gly Trp Lys Pro Val Val Trp Met Val385 390 395 400Val Ser Glu Leu Met Ser Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Phe Val Leu405 410415Ser His Asn Gly Met Glu Val Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Phe Val Asn420 425 430Ala Gln Ile Ala Ser Thr Arg Asp Ile Lys Ala Gly Val Phe Asn Asp435 440 445Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro450 455460Thr Met Pro Arg His Asn Leu Asn Lys Ile Ser Pro His Val Glu Thr465 470 475 480Leu Cys Lys Lys His Gly Leu Val Tyr Glu Asp Val Ser Met Ala Ser485 490 495Gly Thr Tyr Arg Val Leu Lys Thr Leu Lys Asp Val Ala Asp Ala Ala500 505 510Ser His Gln Gln Leu Ala Ala Ser515 520
权利要求
1.一种选自下列一组的编码具有Δ6-乙炔酶和/或Δ6-脱饱和酶活性的多肽的分离的核酸序列a)具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列的核酸序列，b)由于遗传密码的简并性而由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列衍生的核酸序列，c)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示核酸序列的衍生物，它编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少75％的同源性，这种多肽的酶促活性具有可以忽略的降低。
2.一种由权利要求1的核酸序列所编码的氨基酸序列。
3.如权利要求2的氨基酸序列，它是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO11所示序列编码的。
4.一种表达框，含有权利要求1的核酸序列，其中，该核酸序列与一个或多个调控信号连接。
5.一种载体，含有权利要求1的核酸序列或权利要求4的表达框。
6.一种生物，含有至少一种权利要求1的核酸序列或至少一种权利要求4的表达框或至少一种权利要求5的载体。
7.如权利要求6的生物，其中，该生物是植物、微生物或动物。
8.一种转基因植物，含有权利要求1的功能性的或非功能性的核酸序列或权利要求4的功能性的或非功能性的表达框。
9.一种制备不饱和脂肪酸的方法，该方法包括将至少一种权利要求1的核酸序列或至少一种权利要求4的表达框导入产油的生物中，培养该生物并分离该生物所含有的油，释放出所述油中所含的脂肪酸。
10.一种制备具有较高含量不饱和脂肪酸的甘油三酯的方法，该方法包括将至少一种权利要求1的核酸序列或至少一种权利要求4的表达框导入产油的生物中，培养该生物并分离该生物所含有的油。
11.如权利要求9或10的方法，其中，所述不饱和脂肪酸具有较高含量的在6号位置上具有三键或双键或者在6号位置上具有三键和双键的不饱和脂肪酸。
12.如权利要求9-11中任一项的方法，其中，所述生物是植物或微生物。
13.一种含有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白。
14.一种含有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白。
15.将权利要求13或14的蛋白用于制备不饱和脂肪酸的用途。
16.一种制备具有较高含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯的方法，该方法是通过将具有饱和或不饱和或饱和和不饱和脂肪酸的甘油三酯与至少一种权利要求2、13、14的蛋白一起温孵。
17.如权利要求16的方法，其中，所述甘油三酯是在有能够摄取或释放还原性等同物的化合物存在的条件下制备的。
18.如权利要求16或17的方法，其中，所述脂肪酸是从甘油三酯中释放出来的。
19.一种用权利要求9或18的方法制备的不饱和脂肪酸。
20.一种用权利要求10、16、17的方法制备的具有较高含量不饱和脂肪酸的甘油三酯。
21.将权利要求1的核酸序列或权利要求4的表达框用于生产转基因植物的用途。
22.将权利要求1的核酸序列或其片段用于通过同源性筛选分离基因组序列的用途。
23.将权利要求19的不饱和脂肪酸或权利要求20的具有较高含量不饱和脂肪酸的甘油三酯用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品的用途。
全文摘要
本发明涉及一种制备不饱和脂肪酸的方法,以及制备具有较高不饱和脂肪酸含量的甘油三酯的方法。本发明还涉及用编码角齿藓Δ6－乙炔酶/Δ6－脱饱和酶或Δ6－脱饱和酶的DNA序列生产转基因生物,优选转基因植物或转基因微生物,该转基因生物具有较高含量的具有Δ6三键和/或Δ6双键的脂肪酸、油类或脂类。本发明还涉及分离的核酸序列;涉及含有一种核酸序列的表达框,含有一种核酸序列的表达框的载体和生物。本发明还涉及具有较高含量不饱和脂肪酸的不饱和脂肪酸和甘油三酯及其用途。
文档编号A01K67/033GK1369012SQ00811423
公开日2002年9月11日 申请日期2000年6月7日 优先权日1999年6月7日
发明者E·海恩茨, S·施蒂姆尼, M·李, T·吉尔克, P·施佩林, U·采林格 申请人:巴斯夫植物科学股份有限公司