专利名称：一种齿肋赤藓原丝体的培养与保存方法
技术领域：
本发明涉及荒漠苔藓培养与保存的生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种齿肋赤藓的培养与保存的技术领域。
背景技术：
近年来，我国荒漠化越来越严重，是世界上沙漠化最严重的国家之一，沙漠化土地总面积已达373万平方公里，年扩展率为M60平方公里，每年因沙漠化造成的直接经济损失高达540亿元。针对这严重的现状，寻求有效的途径防止土地资源沙化已是当务之急。传统的防风固沙措施如植树造林、草方格沙障和粘土沙障表面上看是有效的，但不能从根本上解决沙化和沙漠化土地的治理问题。主要是高等植物生长缓慢，生长周期长， 另外，每棵高等植物都相当于一个大型的抽水泵，将地下水通过蒸腾释放到大气中，从而使本已贫乏的地下水更加贫乏。特别是大于IOOcm较深层的土壤的含水量下降明显，深根系固沙植物对根际区域水分的利用，进一步恶化了固沙区土壤深层的水分状况，进而抑制了这些植物的生长和生存。生物结皮作为干旱荒漠地区特殊环境的产物，是由苔藓植物、细菌、真菌、蓝绿藻、 地衣与土壤形成的有机复合体。而土壤微生物结皮是苔类、叶苔、蓝绿藻、地衣类、真菌和细菌等生物组分与其下很薄的土壤共同形成的一个复合的生物土壤层。生物结皮在其发育过程中，积极参与土壤的形成，具有改变土壤理化性质、增加土壤有机质含量的功能，对土壤抗侵蚀性能的提高有着显著功效。土壤生物结皮抗逆性强，具有光合、生物固氮两大生理功能，光能利用率远高于高等植物，能够有效的利用光能资源，可以在干旱、严寒、盐碱、土壤贫瘠的恶劣的环境下发育生长，形成5-50mm厚的地表覆盖物，从而增强地表的稳定性，有效地减小荒漠地表的侵蚀，在防风、固沙、防止土壤侵蚀、改变水分分布状况等方面起着重要作用。土壤生物结皮在干旱-半干旱地区分布广泛，特别是在维管植物难以生存地区， 对当地土地资源维持和生态环境保护具有重要意义。生物结皮对于荒漠干旱-半干旱地区具有诸多功能固氮作用，为荒漠植物和土壤微生态系统提供氮素；把金属螯合态转变为植物可吸收形态；提高土壤积聚能力，降低风蚀和沙土流失；构建一个粗糙表面，从而可以捕获水分或者养分含量丰富颗粒。这些功能决定了其在沙漠修复和植被管理当中重要作用。但沙漠生物结皮极易遭受破坏，一旦遭到破坏，会加速沙漠化进程。根据结皮大小，一块完整结皮自然恢复时间从几年到十几年不等，周期漫长。苔藓是几种生物中最高形式，苔藓结皮代表结皮进化最高水平，进一步改良，有可能在上面产生更高级植物；如果苔藓结皮退化，则会转变为其他形式结皮如藻结皮，甚至转变为沙漠，因此苔藓结皮是沙漠向土壤过渡标志，可以作为沙漠环境条件改善与否指示物。如果能人工快速培养出大量的荒漠苔藓材料，经过驯化后与其他的工程手段相结合，势必能够在荒漠地区荒漠化治理和生态重建方面起到重要作用。苔藓植物是一类由水生生活转为陆地生活过渡型的植物类群，在不同的生态系统中均有苔藓植物的足迹。在荒漠生态系统中，苔藓也占据着重要的生态位。齿肋赤藓是古尔班通古特沙漠藓类结皮层中的优势物种，此物种参与生物结皮的形成，在生物防沙、固沙和生态小环境的改善中发挥着不可替代的作用。经检索，已有的研究结果表明，有关齿肋赤藓的生物技术培养与保存在国内外还未见报道。因此，探索和研究齿肋赤藓原丝体的培养与保存，有利于齿肋赤藓进行大量人工扩繁，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙有着极为重要的理论和实践意义。
发明内容
针对国内外有关齿肋赤藓的生物技术培养与保存的技术现状，本发明的目的在于提供一种可用于干旱地区荒漠化治理的齿肋赤藓原丝体的培养与保存方法，有利于齿肋赤藓进行大量人工扩繁，解决荒漠苔藓自然繁殖速度缓慢技术难题，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙提供可行的生物材料。本发明具体提供一种齿肋赤藓原丝体的培养方法，具体培养步骤包括(1)材料选择与处理在古尔班通古特沙漠选择以齿肋赤藓为建群种发育良好的藓类结皮斑块，挑选一些生长健壮的齿肋赤藓植株；先用自来水冲洗干净，再用无菌蒸馏水反复冲洗；在无菌操作台将清洗干净的苔藓植株在70%的酒精浸泡消毒20s，取出后再用无菌蒸馏水冲洗3-4次；将清洗干净的苔藓植株置于无菌操作台上用无菌风自然风干；在已灭菌的研钵内，将风干的苔藓植株轻微研磨成碎片待用。(2)接种与培养将上述步骤获得的苔藓碎片用无菌蒸馏水稀释，然后接种在盛有BG11固体培养基的培养皿中，用parafilm封口膜封口 ；将培养皿置于光照培养箱中，温度 22°C，采用光照强度27μπι01 ·πΓ2 ν—1，光照条件和黑暗条件分别为14h、10h，而且为两者交替进行。培养3周后，苔藓碎片上开始长出原丝体，再过IOd后在无菌操作台上收集苔藓原丝体。(3)扩大培养将上述制备获得的苔藓原丝体转入装有BG11液体培养基的200ml 培养瓶中，BG11培养基中添加2% W/W的蔗糖，温度22°C，光照强度27μπι01 · m_2 · s—1 ；培养3-4周后，再次将原丝体转入IOL大培养瓶中，液体培养基5-6L，通气培养，通气量为 5L · h—1，其它培养条件不变，培养一个月可采收。进一步，本发明提供一种齿肋赤藓原丝体的保存方法，具体培养步骤包括(1)将采收的苔藓原丝体置于阴凉通风处风干。(2)风干后的苔藓原丝体置于无菌封口塑料袋于-40°C冰箱中保存备用，用叶绿素a的荧光值(Fv/Fm)表示其光合活性，室温下测得浓度为2g · L-I的原丝体的Fv/Fm值是0. 36士0. 01，其活性显著高于其它温度下保存的原丝体。本发明中，在制备BG11固体培养基琼脂粉添加量为15g · Γ1,121°C灭菌30min，然后将培养基倒入直径为90mm的培养皿中。本发明中，每升BG11培养基组分如下硝酸钠1.58，，磷酸氢二钾0.048，硫酸镁 0. 07g，氯化钙0. 036g,柠檬酸0. 006g,柠檬酸铁胺0. 006g,乙二胺四乙酸钠盐0. OOlg,碳酸钠0. 02g，微量元素^溶液lmL，琼脂粉添加量为15β· Λ其中，^溶液组分每升重蒸水中加入 H3BO3 2. 86g, MnCl2 · 4H20 1. 86g, ZnSO4 · 7H20 0. 22g, Na2MoO4 · 2H20 0. 39g, CuSO4 · 5H20 0. 08g, Co(NO3)2 · 6H200. 05g。
本领域熟知，原丝体阶段是苔藓植物有性生殖的必经阶段，在苔藓植物生活史的世代交替中，占有十分重要的地位。多数苔藓植物的繁殖是通过胞蒴的孢子萌发产生原丝体，再由原丝体发育到成熟的苔藓植物体。然而，齿肋赤藓生长在极端干旱的荒漠生境中， 在其生长发育过程中无胞蒴出现，不能利用孢子产生原丝体。本发明提供的齿肋赤藓原丝体的培养与保存方法，有利于齿肋赤藓进行大量人工扩繁，而原丝体可以发育成新的植株， 这将为齿肋赤藓的人工繁殖提供了新的途径。通过实施本发明具体的技术内容，可以达到以下有益效果。1、本发明提供的齿肋赤藓原丝体的培养与保存方法，有利于齿肋赤藓进行大量人工扩繁，而原丝体可以发育成新的植株，这将为齿肋赤藓的人工繁殖提供了新的途径。2、通过本发明提供的齿肋赤藓原丝体的培养与保存方法，实现了齿肋赤藓茎叶碎片可以在BG11固体培养基中长出原丝体，并且齿肋赤藓原丝体可以在这种液体培养基通过通气培养可大量扩繁；齿肋赤藓原丝体冷冻干燥的保存方式。3、本发明的内容是利用荒漠沙区土壤微生物结皮的培养物人工植入荒漠土地后依靠其自然繁殖修复地表。通过模拟土壤微生物结皮形成的自然规律，使荒漠地区的高结皮覆盖率的形成时间缩短，既能大规模快速治理沙漠流沙，又能使治理区的生物与环境、生物与生物长期协调发展。此项技术对增加干旱荒漠地区地表生物结皮覆盖度，增强沙面稳定性，减小地表侵蚀具有重要的意义。4、本发明提供的方法能适用于工业化规模生产。
图1显示齿肋赤藓植物体碎片在BG11固体培养基上形成的原丝体图，图中，a_b为离体叶片形成的原丝体；c为茎尖形成的原丝体；d为假根形成的原丝体；e为叶的碎片形成的原丝体；f为芽孢形成的原丝体。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。实施例一齿肋赤藓原丝体的培养方法具体培养步骤包括(1)材料选择与处理在古尔班通古特沙漠选择以齿肋赤藓为建群种发育良好的藓类结皮斑块，挑选一些生长健壮的齿肋赤藓植株；先用自来水冲洗干净，再用无菌蒸馏水反复冲洗；在无菌操作台将清洗干净的苔藓植株在70%的酒精浸泡消毒20s，取出后再用无菌蒸馏水冲洗3-4次；将清洗干净的苔藓植株置于无菌操作台上用无菌风自然风干；在已灭菌的研钵内，将风干的苔藓植株轻微研磨成碎片待用。(2)接种与培养将上述步骤获得的苔藓碎片用无菌蒸馏水稀释，然后接种在盛有BG11固体培养基的培养皿(直径9cm)中，用parafilm封口膜封口 ；将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，光照强度27μπι01 ·πΓ2 · s—1，光照/黑暗时间为14h/10h，培养3周后， 苔藓碎片上开始长出原丝体，再过IOd后在无菌操作台上收集苔藓原丝体。参见附图1，表明齿肋赤藓植物体的茎、叶、假根等离体碎片在适宜的培养条件下均有萌发长出原丝体，为后续的培养和实验提供了大量的材料。
(3)扩大培养将上述制备获得的苔藓原丝体转入装有BG11液体培养基的200ml 培养瓶中，BG11培养基中添加少量蔗糖，浓度为2%，培养条件同上；培养3-4周后，再次将原丝体转入IOL培养瓶中，液体培养基5-6L，通气培养，通气量为5L · h—1，温度和光照条件不变，培养一个月可采收。在制备BG11固体培养基琼脂粉添加量为15g · L-I，高温灭菌后将培养基置于直径为60mm的培养皿中。本发明中，每升BG11培养基组分如下硝酸钠1.58，，磷酸氢二钾0.048，硫酸镁 0. 07g，氯化钙0. 036g,柠檬酸0. 006g,柠檬酸铁胺0. 006g,乙二胺四乙酸钠盐0. OOlg,碳酸钠0. 02g，微量元素A5溶液ImL琼脂粉添加量为15g · Λ其中，A5溶液组分每升重蒸水中加入 H3BO3 2. 86g, MnCl2 · 4H20 1. 86g, ZnSO4 · 7H20 0. 22g, Na2MoO4 · 2H20 0. 39g, CuSO4 · 5H20 0. 08g, Co(NO3)2 · 6H200. 05g。实施例二 齿肋赤藓原丝体的保存方法具体培养步骤包括(1)将采收的苔藓原丝体置于阴凉通风处风干。(2)风干后的苔藓原丝体置于无菌封口塑料袋于-40°C冰箱中保存备用，用叶绿素a的荧光值(Fv/Fm)表示其光合活性，室温下测得浓度为2g -Γ1的原丝体的荧光值(Fv/ Fm)是0. 36士0. 01，其活性显著高于其它温度下保存的原丝体。采用本发明提供的齿肋赤藓原丝体的培养与保存方法，将有望对齿肋赤藓进行大量人工扩繁，利用组织培养技术实现荒漠苔藓及其生物结皮的人工快速培育，是荒漠苔藓人工繁殖的新突破。该技术非常适合用于荒漠化地区土壤改良和生态固沙，为荒漠化治理与干旱地区城市绿化提供新材料应用的可能性。
权利要求
1.一种齿肋赤藓原丝体的培养方法，其特征在于，所述的具体培养步骤包括(1)材料选择与处理在古尔班通古特沙漠选择以齿肋赤藓为建群种发育良好的藓类结皮斑块，挑选一些生长健壮的齿肋赤藓植株；先用自来水冲洗干净，再用无菌蒸馏水反复冲洗；在无菌操作台将清洗干净的苔藓植株在70%的酒精浸泡消毒20s，取出后再用无菌蒸馏水冲洗3-4次；将清洗干净的苔藓植株置于无菌操作台上用无菌风自然风干；在已灭菌的研钵内，将风干的苔藓植株轻微研磨成碎片待用；(2)接种与培养将上述步骤获得的苔藓碎片用无菌蒸馏水稀释，然后接种在盛有BG11 固体培养基的培养皿中，用parafilm封口膜封口 ；将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C， 采用光照强度27μπι01 ·πΓ2 · s—1，光照条件和黑暗条件分别为14h、10h，而且为两者交替进行；培养3周后，苔藓碎片上开始长出原丝体，再过IOd后在无菌操作台上收集苔藓原丝体；(3)扩大培养将上述制备获得的苔藓原丝体转入装有BG11液体培养基的200ml培养瓶中，BG11培养基中添加2% W/W的蔗糖，温度22°C，光照强度27 μ mol · m_2 · s—1 ；培养3_4 周后，再次将原丝体转入IOL大培养瓶中，液体培养基5-6L，通气培养，通气量为5L化―1，其它培养条件不变，培养一个月可采收。
2.一种如权利要求1所述齿肋赤藓原丝体的培养方法，其特征在于，所述的在制备BG11 固体培养基琼脂粉添加量为15g · Γ1,121°C灭菌30min，然后将培养基倒入直径为90mm的培养皿中。
3.—种如权利要求1或2任意所述齿肋赤藓原丝体的培养方法，其特征在于，所述的BG11固体培养基，每升BG11培养基组分含有硝酸钠1. 5g，，磷酸氢二钾0. 04g，硫酸镁 0. 07g，氯化钙0. 036g,柠檬酸0. 006g,柠檬酸铁胺0. 006g,乙二胺四乙酸钠盐0. OOlg,碳酸钠0. 02g,微量元素A5溶液lmL，琼脂粉添加量为15g · 其中，A5溶液组分按照每升重蒸水中加入 H3BO3 2. 86g, MnCl2. 4H20 1. 86g, ZnSO4 · 7H20 0. 22g, Na2MoO4 · 2H20 0. 39g, CuSO4 · 5H20 0. 08g, Co(NO3)2 · 6H20 0. 05g。
4.一种通过权利要求1所述培养方法制备获得齿肋赤藓原丝体的保存方法，其特征在于，所述的具体培养步骤包括(1)将采收的苔藓原丝体置于阴凉通风处风干；(2)风干后的苔藓原丝体置于无菌封口塑料袋于-40°C冰箱中保存备用，用叶绿素a的荧光值(Fv/Fm)表示其光合活性，室温下测得浓度为2g · L-I的原丝体的荧光值(Fv/Fm) 是 0. 36 士 0. 01。
全文摘要
本发明公开了一种齿肋赤藓原丝体培养和保存的方法。通过首先选择合适的材料，经冲洗、消毒、冲洗、风干、研磨等处理，然后将苔藓碎片接种于BG11固体培养基，在光照培养箱中22℃光照强度27μmol·m-2·s-1，光照/黑暗时间为14h/10h条件下培养诱导原丝体的出现，然后转入液体培养逐级扩繁。原丝体经收集后，经自然风干装于封口塑料袋，然后置于-80℃下保存。本发明有利于齿肋赤藓进行大量人工扩繁，而原丝体可以发育成新的植株，这将为齿肋赤藓的人工繁殖提供了新的途径，具有广阔的应用领域。
文档编号A01H4/00GK102257954SQ201110084559
公开日2011年11月30日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者张丙昌, 张元明, 王敬竹 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所