极端耐旱齿肋赤藓4个dreb转录因子及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子基因及其编码基因，所述4个转录因子具有SEQIDNO:5-8所示的氨基酸序列，4个转录因子基因核苷酸序列如SEQIDNO:1-4所示，其基因编码区长分别是ScDREB5-3为685bp，ScDREB5-6为681bp，ScDREB5-8为519bp，ScDREB5-10为1165bp；4个转录因子基因均为脱落酸依赖型，并且对干旱、高盐、低温和高温四种非生物胁迫有响应，但响应模式不尽相同。此外，转化这4个转录因子基因的酵母菌在干旱、高盐、冷、热胁迫下的存活率都高于对照非转基因酵母菌，说明极端耐旱藓类齿肋赤藓4个DREB类转录因子基因ScDREB5-3，ScDREB5-6，ScDREB5-8，ScDREB5-10均具有非生物胁迫的抗性。本发明可以用于作物非生物胁迫转基因育种研究。
【专利说明】极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种极端耐旱藓类植物齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因，4个极端耐旱藓类植物齿肋赤藓DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10及其编码基因，利用该基因在提高酵母抗旱、高盐、耐低温及高温胁迫等抗逆性方面的应用，属于植物基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]DREB 转录因子(Dehydration Responsive Element Binding protein),即干旱应答元件结合蛋白，属于AP2/EREBP类基因家族，特异存在于植物中。DREB与抗逆基因启动子区域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)顺式作用兀件结合，其核心序TACCGACAT，启动下游一系列的有DRE顺式作用元件的抗逆基因的表达，广泛参与干旱、高盐，热等胁迫应答反应，从而能从整体上提高植物的抗逆性。
[0003]自1994年Yamaguch1-Shinozaki从拟南芥中首次检测到DRE作用的蛋白因子并命名为DREB1，到1997年Stockinger等首次从拟南芥cDNA文库中克隆到AtCBFl以来，DREB / CBF转录因子基因的克隆一直是植物分子生物学的热点。目前已从拟南芥、水稻、玉米、小麦、黑麦、大豆、西红菜，棉花，芦荟等几十种植物中分离并鉴定出调控干早、高盐及低温耐性的DREB基因，并利用这些基因得到了抗逆性增强的拟南芥、烟草、油菜、西红柿、小麦等转基因植株。从文献报道来看，目前关于抗逆转录因子DREB的功能及转录调控的研究大部分来自模式植物拟南芥及经济作物水稻，小麦等，而对自然界天然存在的抗逆能力极强的植物资源却尝试较少，以天然抗逆性强的野生植物资源为基因克隆材料将是一个有价值的尝试。此外，目前有关DREB基因的研究多局限于草本植物领域，对于较为低等的苔藓植物中DREB的研究很少，仅见于模式藓类小立碗藓中的一例报道(Liu等，2007)。
[0004]另外，以往服务于分子育种的DREB基`因的克隆和转化研究主要是针对单个DREB基因，没有比较和筛选，因此往往出现供转化基因有限及转化后转基因效果不理想等问题。这也是目前大部分的转基因研究费钱，费时，费力的主要原因所在。因此，要想避免下游应用研究的盲目性，必须对上游基因的克隆和筛选工作严加把关，挑选优质的(抗逆性增强且不影响生物量和产量)抗逆基因资源进行下一步的作物抗逆分子改良育种。以基因家族为比较研究单位，系统全面的克隆和分析特定基因家族，从众多家族成员中筛选最有潜力的抗逆基因，有方向有重点的对一个或少数几个优质基因进行转化将是一条新的思路，能有效地解决一直以来对单个基因研究的局限性及用单个基因转化农作物育种研究的盲目性的问题。
[0005]综上，植物中还存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其从天然极端抗逆的荒漠苔藓植物中克隆DREB基因并进行抗逆育种鲜见报道且颇具潜力(Xu等，2011)。同时，站在DREB基因家族的高度，通过比较与筛选进而克隆得到功能更为强大的基因元件用于作物的遗传改良，避免的基因克隆的盲目性，具有更为准确、高效的意义，是一条值得尝试的全新道路。[0006]齿肋赤藓(SyntrichiaCaninervis,又名 Tortula Caninervis),隶属丛藓科赤藓属，为典型的旱生苔鲜植物，是构成古尔班通古特沙漠藓类生物结皮的优势种(张等，2006)。该藓具有极强的综合抗逆性，如抗旱，抗高温，低温等，是优良的开展抗逆研究的好材料。齿肋赤藓自然干燥状态下呈灰黑色，似一层“壳”分布在沙漠表面，形成有重要生态意义的苔藓生物结皮(Putzer等，2002), 一旦遇到降水,齿肋赤藓即在30s内迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色，并开始执行光合作用，是典型的复苏植物代表。其迅速的复水过程及抗旱性、耐热性等的分子调控机制已成为国内外相关科学的研究热点。目前，本项目组还建立了齿肋赤藓茎叶体脱水状态(24h)以及复水0.5、6、12h的4个转录组以及相应的4个蛋白谱数据，为在基因家族高度研究抗逆相关基因，比较其功能，筛选最强的抗逆基因奠定基础。
[0007]因此，在比较筛选基础上，开展极端耐旱藓类齿肋赤藓抗旱相关DREB转录因子基因的克隆，对于深入理解该种的耐旱机理及开发利用抗逆基因资源，定向培育植物新品种均有重要价值。
【发明内容】
[0008]本发明的第一个目的在于为了解决目前可利用的DREB转录因子比较少的问题，提供极端耐旱藓类植物齿肋赤藓4个DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8、ScDREB5-10，其氨基酸序列由SEQ ID N0:5_8所示。
[0009]本发明的第二个目的在于提供编码齿肋赤藓4个DREB转录因子编码基因ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8、ScDREB5_10 基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1-4 所 [0010]本发明的第三个目的在于，所述4个齿肋赤藓ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10转录因子基因在培育抗逆生物，尤其是抗非生物胁迫生物品种中的应用。
[0011]本发明所述的一种极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因，该基因4个 DREB 转录因子为 ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8 和 ScDREB5_10，它们具有 SEQ IDNO:5-8所示的氨基酸序列为:
[0012]SEQ ID N0:5ScDREB5-3 氨基酸序列
[0013]MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAWCLRGSNAELNFPDSPPRWPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAV
[0014]SEQ ID N0:6ScDREB5-6 氨基酸序列
[0015]MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEMRAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVMLQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQMDEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYP
[0016]SEQ ID N0:7ScDREB5-8 氨基酸序列
[0017]MPGMAPSAWRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGA⑶ASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTffEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF
[0018]SEQ ID N0:8ScDREB5-10 氨基酸序列
【权利要求】
1.一种极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因，其特征在于该基因4个DREB转录因子为 ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8 和 ScDREB5_10，它们具有 SEQ ID NO: 5-8 所示的氨基酸序列为: SEQ ID N0:5ScDREB5-3 氨基酸序列
MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAVVCLRGSNAELNFPDSPPRVVPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAVSEQ ID N0:6ScDREB5-6 氨基酸序列
MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEAARAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVAALQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQAADEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYPSEQ ID N0:7ScDREB5-8 氨基酸序列
MPGMAPSAffRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGAGDASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTffEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF SEQ ID N0:8ScDREB5-10 氨基酸序列
MAGEEAPSTLCRIWSAITPLMRFKNKIREHLWASSLLNDPDLHRETETASTLPEQHYYDASSQAFEAASPPAVTASFYDNP⑶LATQLQAMQRNAHAEPEVYMSLDDFPVELISQPISADSYHRSTSEPISEDSYDRSISEPISEDSYDRSMSQPISEDSYLRSMSQPIEEDFTSDGADDDQSSEMMDTGAESSDLRRESSAEEWQQIMFFRHFFGMDSTVPPVPGWTVVVGIVSVFKRITGLIRQRRQERAQNQVAVVPRPRRRRAVVVTRYKGIRPRNGKWVSEIRIGGTKEKVffLGSYNTEKEAALAFDAGKHHCSLLRRTRGFNFNDSPRFLGPPQRFEHLTSEKRRENIKRLAEEHALTYASADIR。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于4个齿肋赤藓转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5_8、ScDREB5_10的氨基酸序列，其中转录因子ScDREB5_3基因编码224个氨基酸，ScDREB5-6基因编码226个氨基酸，转录因子ScDREB5_8基因编码172个氨基酸，ScDREB5-10基因编码371个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于4个基因核苷酸序列SEQID N0:l-4所示: SEQ ID N0:lScDREB5-3基因的核苷酸序列
GGCGGTTAAGGGAGCGCGTCACCCAGAACATCCAAGTGGCAATTTCCGCGAAGGTGAGACCTTCACACCTGTCCTGT
TGCCTTGGGATTCATGTGTCTCGGAGTCGGGTATATATGCCGCTTCGAGCTCTGAAAAGAGGAAAAGTAGCTGTGTG
AAGGTCGATATCAGAGACTGAAGAGAGCAAGAGACCGAAGCAGGAAAGACAGGAAGGAGAGCAAGTCATTGAAGCAG
GAAAGACAGGAAGTAGAGCAAGGCATTGAAGCAGGAAAGAAAGGAATGGTGGAGAAGAACGCCAGCCAGAGAGCAGC
GTCGGACAGTCGTCTAGAGTTTCTGGGAGTGACCAAGGCCAAGGCGAAGAATGAGAAGGCGCCTTCGAGTCCCAAGT
ACAAGGGCGTGCGCATGCGGCAGTGGGGAAAGTGGGTGAGCGAGATTCGGGAGCCCAATAAGCGGTCGAGGATATGG
CTGGGCTCGTTTCCCACAGCGGAGATGGCTGCTAAGGCGTACGACGCTGCCGTCGTGTGCTTGCGGGGCTCCAACGC
GGAACTCAACTTCCCCGACTCGCCTCCGCGCGTGGTCCCCACCTGTACCTCGCCCAAGGACGTGCAGATCGCCGCCG
CGGCTGCCGCGGCCGCTGCGGACCCGTGCACTCCGGTGTCGCTCCCCGCGTTGGGGGCGCAGCCCGTTGCGCAGTCA
CTGGAAACGCAGCTGCACAAGATGGATTCTAGCGCGGTGGAGTGCGTGGCAGAGTCATCCCCGGCGTGCTCGTTCGT
CACGCTGGACCAGGTCGAACTCGCGTGGAGCGACATGAAGTTCATCGACCTGCCGCCGCTAGAGGATCTTGTCGATT
CGTCCGAGCAATCCTCAACTTCCTCTGCTGTGTATTGCCGTGTTTCGTCAGGTCCTCTCGAGAGGAACATCATGGAT
AATTGCTACAATGTGTTCGCGGTATAACGATTTCAGGGCTTCAGAAGCAATTTTGCCGGTGTGGGAAAAGACGGAGT
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于4个基因核苷酸序列SEQID NO: 1-4所示的基因编码区长分别是ScDREB5-3为685bp，ScDREB5_6为681bp，ScDREB5_8为519bp，ScDREB5-10 为 1165bp。
5.根据权利要求1所述的基因，其特征在于将所示的核苷酸序列按常规方法进行酵母表达载体构建，酵母表达载体导入宿主，其中宿主为酵母菌株INVScl，得到具备抗逆能力的转 ScDREB5-3、ScDREB5_6、ScDREB5_8、ScDREB5_10 基因的转化体的功能测试。
6.根据权利要求1所述的极端耐旱藓类植物齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因在制备植物抗逆性育种和改良的用途。
【文档编号】C07K14/415GK103755793SQ201410042554
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】张道远, 李海燕, 李小双 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所