专利名称：重组东亚马氏钳蝎毒rBmKaIT1的基因工程的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，具体地说涉及设计基因DNA顺序，DNA化学全合成和DNA重组等基因工程技术。
背景技术：
蝎属节肢动物门、蛛形纲、蝎目，是已知最古老的陆生节肢动物，已有四亿多年的生存史。全世界一共约有800种蝎子，其中对人体构成危害的，即具有医学意义的约有50种，它们几乎都属于钳蝎科。中国有15种蝎子，其中以马氏钳蝎(亦称东亚马氏钳蝎，Buthus Martensii Karsch，下简称BmK)分布最广，它属于钳蝎科中的钳蝎亚科，主要分布在河南、山东和辽宁一带。马氏钳蝎毒的毒性较弱，对人无致命危险，在我国的传统医药宝库中也有重要的位置。本草纲目指出蝎“主治中风半身不遂口眼歪斜语涩手足抽掣”。
蝎毒是由蝎尾的毒腺所分泌的成分较复杂的混合物，其主要毒性成分是分子量介于5000到10000道尔顿之间的蛋白类神经毒素，其中绝大部分是一类选择性地影响电压敏感钠离子通道的由60到70个氨基酸残基组成的单链多肽。这些神经毒素根据其作用对象可分为哺乳动物毒素、昆虫毒素和甲壳动物毒素。1994年Gurevitz，M.根据一级结构的同源性和毒性作用的选择性，将钳蝎亚科的蝎毒素分为以下几类[参见文献J.Toxicol.-Toxin Reviews(1994)13，65-100](1)α型哺乳动物毒素，与神经、肌肉的钠通道作用，使动作电位延长，去极化减缓，表现出抑制去极化；(2)β型哺乳动物毒素，表现出致极化，造成钠离子的异常通透；(3)兴奋型昆虫毒素，表现出提高动作电位并减缓其灭活，使得动作神经持续激活；(4)抑制型昆虫毒素，引起缓慢的抑制性麻痹作用，通过增加休止钠离子的通透性并抑制活性钠离子的传导，实现对钠离子的阻遏；(5)α型昆虫毒素，对昆虫具有强的活性，而对哺乳动物则呈弱的毒性，具有与α型哺乳动物毒素相似的化学序列结构，以及相似的抑制钠通道失活化功能。电生理显示此类毒素与大鼠脑突触体钠通道不发生结合反应，而与昆虫钠通道的结合不依赖膜电位。本发明中所涉及到的由工程菌表达的重组蝎毒rBmKαIT1即属于此类α型昆虫毒素。
正是由于蝎神经毒素所具备的特异活性和高度选择性，它们作为重要的工具已经并正在被日益广泛地应用于神经生物科学中涉及到相关靶离子通道蛋白成分的鉴定与纯化，毒素与受体位点结合的特异性和敏感性，以及其受体调控胞内递质释放和信息传输的分子机制等生命现象的基础理论研究。另一方面，它们作为未来的新型药物也正显示出十分诱人的潜力和前景。长链蝎毒素具有高的同源性，特别是八个半胱氨酸残基在肽链氨基酸序列中的位置和构成4对特定的二硫键，是蝎毒素的一个保守结构因素。蝎毒素都具有共同的折叠方式，即由一个α螺旋和3个反平行的β折叠组成。因此蝎毒素也是研究蛋白质结构和功能关系的极好模型。由于天然来源的蝎毒中含有结构同源性很强的多种蝎毒多肽，因此从天然来源分离纯化单一的蝎毒多肽基因有一定困难。1988年Carbonell等首次由Buthuseupeus蝎中昆虫神经毒素氨基酸序列推导并化学合成其基因序列，但仅在杆状病毒载体中得到微弱表达[参见文献Gene(1988)73，409-418]，自此人们广泛试验将各种属的系列蝎毒素基因重组到大肠杆菌、酵母、杆状病毒、植物等表达载体进行表达。在绝大多数的表达载体中只有无活性或含量非常少的活性蛋白可以表达并纯化。这是由于蝎毒素所含有的4对二硫键能否正确重组所造成的。Zilberberg，N.等人在大肠杆菌内以包涵体形式表达了LqhαIT蝎毒，并在体外复性获得了活性蛋白[参见文献Biochemistry(1996)35，10215-10222]。Tonny，M.J.等人采用了氧化型的大肠杆菌菌株表达β型的蝎毒CssII获得成功[参见文献Peptides(2000)21，767-772]。我国在蝎毒表达这一领域也展开了积极的研究。Shao，F.等人在啤酒酵母中成功表达了BmK M1蝎毒[参见文献ProteinExpression and Purification，(1999)17，358-365]。在大肠杆菌中表达有活性的东亚马氏钳蝎毒，尤其是α型昆虫毒素目前尚无报道。1999年Wu，H.-M.等人报道了BmKαIT1的氨基酸序列[参见文献Pure Appl.Chem.(1999)71，1157-1162]，2000年Zhu，S.-Y.等人报道了BmαTX12的cDNA及其推导的编码蛋白质氨基酸序列[参见文献Toxicon(2000)38，1653-1661]，该序列与BmKαIT1的氨基酸序列涉及的是同一个客观实体。因此，我们综合了两者的合理部分作为设计重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的依据之一。
发明内容
本发明要解决的问题就是用基因工程方法制备重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1及其突变体。
本发明提供了重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因，其DNA的核苷酸顺序如下所示1 76C ATG GTT CGT GAT GCA TAT ATT GCC CAA AAC TAC AAT TGT GTA TAC CAT TGT GCT CGT GAT GCA TAT TGC AAC GAA151CTG TGC ACT AAG AAT GGT GCC AAG TCC GGA TCT TGC CCA TAC TTG GGT GAG CAC AAA TTC GCC TGC TAC TGC AAG206GAC CTG CCA GAT AAC GTT CCA ATC CGT GTC CCG GGT AAG TGC CAC TAA TAGGATC由这个合成基因衍生的突变体基因，可与上述的合成基因相对应的密码子有50％以上相同。
本发明的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的表达质粒可以是质粒pE2rBmKαIT(于2001年11月28日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0655)，结构如下所示 该表达质粒的宿主细胞可以是大肠杆菌BL21(DE3)。
在大肠杆菌中表达有活性的重组东亚马氏钳蝎毒，尤其是α型昆虫毒素目前尚无报道。本发明针对这一特点，在不排斥探索分离天然蝎毒多肽基因的同时，采用人工设计基因的战术，从而保证了需要合成的蝎毒蛋白的结构规定性和确定性。如前所述，本发明综合了BmKαIT1的氨基酸序列与BmαTX12的cDNA及其推导的编码蛋白质的氨基酸序列两者的合理部分以及在大肠杆菌中表达需要相应的密码子与之匹配，人工设计了编码rBmKαIT1结构基因序列，它与天然报道的cDNA的密码子有51％不同。
本发明用基因工程方法制备重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1蛋白，在大肠杆菌中以包涵体形式表达出除N-端增加一个Met残基外与天然蝎毒具有相同氨基酸序列的多肽链，并在体外复性为有活性的蝎毒蛋白。其是通过设计并化学合成重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结构基因序列，即通过分步配对一次T4 DNA连接酶反应的单链DNA合成法[参考文献Chen，H.-B.et al.Nucl.Acids.Res.(1990)18，871-878]，将化学合成的寡核苷酸片段连接合成该基因并直接克隆入载体pET15b，得到表达质粒pE2rBmKαIT1，并将此表达质粒转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，目的蛋白以包涵体形式获得高表达，接着通过体外复性使二硫键正确重组，高效液相色谱分离，从而获得二硫键正确配对的有活性的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1蛋白。
本发明提供了一种能在大肠杆菌中表达并在体外复性获得有活性的rBmKαIT1蛋白的基因工程制备方法，通过重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结构基因的设计，化学全合成、基因表达、表达产物的体外复性及分离纯化和活性测定而确定得到重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1蛋白。具体过程例如1.重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结构基因的设计将成熟的东亚马氏钳蝎毒BmKαIT1肽链64个氨基酸残基顺序两端分别配上起始码和双重终止码后输入计算机，运转有关程序，按大肠杆菌高表达基因简并密码子的相对使用频率数据[参见文献Wada，K.，Nucl.Acids Res.(1992)20(supplement)，2111]，设计尽可能多的常用的单一的限制性内切酶位点的要求和分子克隆需要安置两端的限制性内切酶NcoI和BamHI识别序列设计了含206个碱基的rBmKαIT1结构基因，如图1所示。在这个合成基因中，除了两端的NcoI和BamHI外，我们还设置了9个常用的单一的限制性内切酶位点，它们的分布情况见图2，而相应的BmKαIT1天然基因中只有2个这种位点。另外，对照BmKαIT1天然基因，在编码区有许多碱基不一样，这是为了改变34个密码子(占67个密码子的50.8％)使基因工程的rBmKαIT1更适应于在大肠杆菌中表达。
2.重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结构基因的化学全合成本发明参照Chen，H.-B.等人的文献方法[Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878]加以改进后完成了rBmKαIT1结构基因的化学合成。用T4 DNA连接酶经单链法催化连接化学合成的寡核苷酸片段成为单链DNA(ssDNA)大片段，然后用DNA重组技术将连接成的rBmKαIT1的单链大片段克隆进质粒载体，并转化宿主菌BL21(DE3)，使之在宿主菌内装配成完整rBmKαIT1结构基因双链DNA，得到含此基因的克隆质粒。图3表示rBmKαIT1结构基因的正股被划分为A、B、C、D四个大片段以及连接和克隆所需的A’b、bc、cd和D’等负股短片段。图4的琼脂糖凝胶电泳分离结果显示用DNA单链法合成了rBmKαIT1结构基因的单链。将它们重组到载体pET15b中并转化宿主菌得到含完整rBmKαIT1结构基因的质粒pE2rBmKαIT1(CGMCC No.0655)，经过DNA测序分析证明合成基因与设计的完全一致。
3.重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的表达质粒pE2rBmKαIT1转化大肠杆菌BL21(DE3)后取单菌落接种于LB培养基，经预培养并诱导表达后，经SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定出现一条与预期分子量一致的表达产物(如图8所示)。
4.重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的体外复性与分离纯化和鉴定采用如图7所示的纯化步骤，超声破碎表达后的菌体，依次用缓冲液洗涤沉淀，用变性溶液溶解后，再经过透析、复性、浓缩，最后用高效液相色谱分离纯化(图10和11)。纯化产物(图9和11)依次用圆二色性光谱、毛细管电泳、1H核磁共振、电喷雾质谱、电生理及昆虫整体活性测定等技术鉴定，结果(见图12～21)表明基因工程产生的重组rBmKαIT1具有与天然分离的BmKαIT1相同的完整α型抗昆虫活性。
本发明与已有技术相比。目前文献报道的还没有国产的东亚马氏钳蝎在大肠杆菌内表达并得到完整的二硫键正确配对的蝎毒多肽。通过大肠杆菌发酵表达获得重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1，比从天然分离纯化而得具有费时少，方便可行，经济效益高的特点。通过普通的生物发酵即可制备高纯度的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1。
图1重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因与天然BmKαIT1基因及其编码的氨基酸顺序。
图中说明第一行为东亚马氏钳蝎毒BmKαIT1天然基因的DNA核苷酸顺序(只给出与设计顺序不同的碱基)；第二行为重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因设计的DNA核苷酸顺序；第三行为重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1蛋白的氨基酸顺序。
图2重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因中限制性核酸内切酶位点分布图。
图3为合成重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因而划分的寡核苷酸片段。
图4琼脂糖凝胶(3％)电泳分离鉴定重组的rBmKαIT1合成的寡核苷酸片段及其连接产物——合成基因的单链。
图中说明泳道1DNA分子量标准，长度依次为65，75，214，396，517，1419bp；泳道2连接产物；泳道3片段B；泳道4片段C；泳道5片段D。
图5重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因克隆及表达质粒pE2rBmKαIT1的构建程序图。
图6pE2rBmKoIT1的DNA顺序测定结果图，从图中60位附近NcoI识别顺序CCATGG开始到260位附近的HindIII识别顺序GGATCC为止的测定结果与设计的DNA顺序完全一致。
图7基因表达的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1蛋白的变性、复性和分离纯化流程图。
图8大肠杆菌BL21(DE3)中质粒pE2rBmKαIT1诱导表达的SDS-PAGE分离图。
图中说明菌液样品经过离心后收集沉淀的菌体，菌体经过常规操作裂解后离心取上清液上样至10％凝胶进行SDS-PAGE分离。泳道1BL21(DE3)含pE2rBmKαIT1生长至A600为0.6，未诱导时的全菌蛋白；
泳道2～4依次为IPTG诱导4小时后的全菌蛋白，菌体裂解上清液和菌体裂解后的沉淀；泳道5沉淀经洗涤后的包涵体。
图9纯化后的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的SDS-PAGE。
图中说明电泳条件与图8相同。泳道1蛋白质分子量标准，从上至下依次为26.6，17.0，14.2，6.5和3.5kDa；泳道2HPLC纯化后的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1；泳道3HPLC纯化的天然BmKαIT1。
图10天然BmKαIT1和初步纯化的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的C18RP-HPLC洗脱曲线图。
图中说明梯度设置为0min(5％ B)，5min(30％ B)，35min(40％ B)，40min(100％ B)，45min(100％ B)，50min(5％ B)和55min(5％ B)。
图11重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的最终纯化的HPLC洗脱曲线。
图中说明梯度设置为0min(22％ B)，40min(26％ B)和45min(40％ B)。
图12天然BmKαIT1和重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的圆二色性谱图。
图中说明○指天然BmKαIT1的CD谱图；□指重组的rBmKαIT1的CD谱图。
图13天然BmKαIT1和重组的rBmKαIT1的毛细管电泳行为曲线。
图中说明左图指天然BmKαIT1的毛细管电泳行为；右图指重组的rBmKαIT1的毛细管电泳行为。
图14重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的1H NMR谱。
图15重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的电喷雾质谱图。
图中说明谱图右上角由质谱仪标出重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1分子量显示为7310.63+1.07与计算值7310.5在合理的误差范围内。
图16重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的电生理性质。
图中说明在全细胞电压片钳实验中重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对大鼠背根神经节钠电流峰电流的影响。上图为对照实验，记录了从背根神经节的静息电位-70mV开始，以每10mV递增直至+30mV的脉冲刺激对钠电流的影响；中图显示1μmol/L重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1使钠电流的失活化减缓；下图为10mV刺激钠电流达到峰值时重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对钠电流失活化的影响。
图17重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对德国小蠊半数麻痹量(PU50)的测定。
图中说明按图中虚线计算而得，对德国小蠊的50％麻痹量(PU50)为15.6μg/kg，与已报道的天然BmKαIT1的PU50值24.16μg/kg在允许的误差范围内。
图18用表面等离子体共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)测定不同浓度的蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结合对共振单位(Resonance Unit，RU)的影响。
图中说明从上至下依次代表浓度为36，18，12，9和6pmol/L的蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结合的RU随时间变化的曲线。
图19高浓度重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对固定化的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的竞争抑制。
图中说明上一条曲线代表36pmol/L蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线；下一条曲线代表36pmol/L蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与30μmol/L重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1在25℃温育1小时后与固定在芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线，此曲线表明高浓度重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1事先对蟑螂腹神经突触体膜的结合完全抑制了固定在芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对蟑螂腹神经突触体膜的结合，即不存在非特异性吸附。
图20不同浓度的蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与天然BmKαIT1的结合对RU值的影响。
图中说明从上至下依次代表浓度为36，18，12，9和6pmol/L的蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的天然BmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线。
图21高浓度重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对固定化的天然BmKαIT1的竞争抑制。
图中说明上一条曲线代表36pmol/L蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线；下一条曲线代表36pmol/L蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与30μmol/L重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1在25℃温育1小时后与固定在芯片表面的天然BmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线，此曲线表明高浓度重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1事先对蟑螂腹神经突触体膜的结合完全抑制了固定在芯片表面的天然BmKαIT1对蟑螂腹神经突触体膜的结合。
图22不同浓度的大鼠脑突触体膜悬浮液与重组BmKαIT1的结合对RU值的影响。
图中说明曲线A、B分别代表浓度为36和9pmol/L的蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的重组rBmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线。曲线C、D分别代表浓度为175和58.3pmol/L的大鼠脑突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的重组rBmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线。此曲线表明重组rBmKαIT1对大鼠脑突触体膜没有结合。
图23不同浓度的大鼠脑突触体膜悬浮液与天然BmKαIT1的结合对RU值的影响。
图中说明曲线A、B分别代表浓度为36和9pmol/L的蟑螂腹神经突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的天然BmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线。曲线C、D分别代表浓度为175和58.3pmol/L的大鼠脑突触体膜悬浮液与固定在芯片表面的天然BmKαIT1的结合的RU随时间变化的曲线。此曲线表明天然BmKαIT1对大鼠脑突触体膜没有结合。
图24PCR突变的设计流程。
具体实施例方式
以下实施例有助于理解本发明，但不限于本发明的内容材料与方法四种全保护的亚磷酰胺核苷单体和四种全保护的脱氧核苷CPG(ControlledPore Glass，500A或1000A)衍生物购自ABI公司(Applied Biosystem Inc.)。
ATP，牛血清白蛋白(BSA)，丙烯酰胺，溶菌酶，对甲基苯磺酰氟(PMSF)，胃酶抑素(pepstatin)A，碘乙酰胺，1，10-菲咯啉，Triton X-100，蛋白低分子量标准和考马斯亮兰G-250均购自Sigma公司。
T4 DNA连接酶购自华美生物工程公司(SABC)。
N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，溴化乙锭(EthidiumBromide，EB)来自Aldrich公司；苏式-1，4-二巯基-2，3-丁二醇(DTT)购自BDH公司；N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)购自E.Merck公司；Sep-pak C18反相柱购自Waters公司；低熔点琼脂糖凝胶(LMP Agarose)购自Gibco BRL公司；pET15b质粒和菌种BL21(DE3)购自Novagen公司；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母抽取物(Yeast Extract)购自Oxiod公司；盐酸胍和三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自Amresco公司；Bradford蛋白定量用储存液购自Bio-rad公司；5，5′-二巯基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)购自Acros公司；CsCl和十二烷基硫酸钠(SDS)购自Boehringer Mannheim公司；Macrosep(MWCO 3k)购自Pall-Gelman公司；C18 RP-HPLC柱(300，10×250和4.6×250mm)及其预柱Security Guard购自Phenomenex公司；CM5芯片及N-乙基-N-(二甲氨基丙基)-羰二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)购自瑞典BIACore公司；氨苄青霉素钠(Amp)购自上海第四制药股份有限公司；其他无机盐和常用化学试剂为国产分析纯试剂。
本发明中所涉及的基因合成用的寡核苷酸片段由本实验室按固相亚磷酰胺三酯法在DNA合成仪(381A型，美国ABI公司)上合成。合成产物经浓氨水60℃放置过夜，使之从固相上脱落并切除保护基团，初产物浓缩后溶于水，用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，含纯产物的凝胶带经碳酸氢三乙胺(1mol/L)浸出后，用Sep-pak C-18反相柱按文献方法[参考文献Lo，K.-M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，2285-2289]脱盐后得到纯的寡核苷酸片段纯的寡核苷酸片段B，C和D用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常规方法进行5’磷酸化。
DNA核苷酸顺序分析由上海基康生物技术公司在ABI 3700自动测序仪上进行。
8mol/L尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化DNA片段、寡核苷酸片段的5’磷酸化和质粒转化大肠杆菌宿主细胞按常规方法进行[参考文献Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2ndEd)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York]。
蛋白定量用Bradford试剂按文献方法[Bradford，M.，Anal.Biochem.(1976)72，248]以BSA标准水溶液(1mg/ml的A280＝0.661)作A595对BSA浓度的标准曲线。然后在相同条件下测蛋白样品的A595，根据标准曲线确定相应的蛋白样品浓度。
游离巯基定量用Ellman试剂按文献方法进行[Ellman，G.L.，Arch.Biochem.Biophysics(1959)82，70-77]。
HPLC是在Waters 510(Waters公司)上进行的。检测器为Waters 484型。C18 RP-HPLC柱(300，10×250和4.6×250mm)及其预柱的流动相为A液0.1％(v/v)TFA/H2O；B液0.1％(v/v)TFA/乙腈。流速为3ml/min。紫外检测A280。
远紫外CD光谱是在JASCO J-715(美国)旋光分光计上进行的。实验条件比色杯光程长度为0.1cm，扫描范围190-250nm，扫描速度10nm/min，时间常数0.25秒，温度25℃。数据经过进一步处理，减小噪音，基线平滑，信号平均，最后得到平均残基摩尔消光系数[θ](图8c所示)。
毛细管电泳是在Waters Quanta 4000E毛细管电泳系统(美国WATERS公司)上进行的。电泳条件流动相为50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 2.5)，电压25kV，温度为30℃，时间为10min，毛细管为30cm长，直径75μm。样品进样时间为30秒，紫外检测A214。
1H NMR是在Varian Inova-600谱仪上采集，在Sun工作站上用VNMR软件进行谱图处理。数据在300K采集，用预饱和技术压水峰。化学位移根据水峰定标。样品溶于H2O/D2O(9∶1)，并用HCi或NaOH调节至pH 4.9，样品终浓度0.66mmol/L。
重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的电喷雾质谱是在QUATTRO LC(英国Macromass质谱公司)上测定。
电生理实验采用从成年大鼠的背根神经节(DRG)中分离的神经元细胞[参考文献Song，et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.(1997)282，707-714]。全细胞记录采用小直径DRG神经元(10-25μm)。膜电流通过玻璃毛细管吸管(2-5MΩ)连接到EPC-9扩增器，通过Pulse/Pulsefit software(德国HEKA elektronik)处理。吸管溶液由120mmol/L CsCl，20mmol/L氯化三乙基铵(TEACl)，5mmol/L Na2ATP，10mmol/L乙二醇双乙胺醚-N，N′-四乙酸(EGTA)，10mmol/L HEPES，2.5mmol/LMgCl2和0.4mmol/L Na2GTP组成。溶液用CsOH调节至pH 7.3。外液组成为140mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，2.5mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2，10mmol/LHEPES和10mmol/L D-glucose。外液用NaOH调节至pH 7.3-7.4。Ag-AgCl盐桥作为参比电极。峰电流根据它们和对照的相对强度被挑选出来。
抗昆虫生物活性测定采用的昆虫为德国小蠊(Blattella germanica，55±3mg)。将蛋白按不同浓度溶于测活缓冲液中，测活缓冲液组成为0.9％ NaCl和1％ BSA，腹腔注射0.6μl，并用石蜡封口，5分钟后观察麻痹症状，翅膀张开，后腿伸直，仰面躺下至少30分钟，每测定一个数据用8个昆虫。
大鼠脑突触体膜按照文献方法制备[参考文献Dodd，P.R.et al.Brain Res.(1981)226，107-118]和蟑螂(Periplaneta americana)腹神经节突触体膜按照文献方法制备[参考文献Lima，M.E.D.et al，Insect Biochem.(1989)19，413-422]。突触体膜悬浮于运行缓冲液[运行缓冲液含有140mmol/L氯化胆碱，1.8mmol/L CaCl2，5.4mmol/L KCl，0.8mmol/L MgSO4，10mmol/L D-葡萄糖和25mmol/L(pH 7.4)Hepes-Tris]。并加入蛋白酶抑制剂混合物至各组分终浓度为对甲苯磺酰氟(PMSF)50μg/ml，1μmol/L胃酶抑素A，1mmol/L碘乙酰胺和1mmol/L 1，10-菲咯啉。突触体膜悬浮液的浓度用Bradford蛋白定量法定量。
SPR实验是在BIACore 3000(瑞典BIACore公司)上进行的。芯片采用CM5型。芯片表面的羧甲基葡聚糖先用35μl 1∶1(v/v)的400mmol/L N-乙基-N-(二甲氨基丙基)-羰二亚胺(EDC)和100mmol/L N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化。重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1溶于固定缓冲液(此缓冲液组成为10mmol/L NaOAc，pH 6)中，终浓度0.2mg/ml，此蛋白溶液流经芯片并将重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1或天然的BmKαIT1固定在芯片表面，至RU值到达750左右，停止进样。未反应的N-羟基-琥珀酰亚胺酯用35μl封闭试剂(1mol/L盐酸乙醇胺，pH 8.0)封闭。整个固定过程流速为5μl/min。配体与受体相互作用是通过检测不同浓度的突触体膜悬浮液结合于芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1所造成的RU值的变化及其动力学过程。缓冲液为上述所提到的运行缓冲液。流速20μl/min，共流过60μl，温度25℃。竞争实验则先将蟑螂腹神经节突触体膜悬浮液与重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1混和于25℃放置1小时或大鼠脑突触体膜悬浮液与重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1混和于37℃放置30分钟再与芯片结合。
实施例1重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因的设计、全合成与克隆A、编码重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结构基因的设计将重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的氨基酸顺序输入计算机后，运行DNAStar软件，按照(1)大肠杆菌高表达基因密码子使用频率，(2)均匀安置单一的限制性内切酶于重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因中，(3)合成基因片段分段和消除片段自身配对等三项要求人工选定每个氨基酸的密码子而确定重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1结构基因的DNA顺序，如图1所示。
B、寡核苷酸片段的制备寡核苷酸片段在DNA合成仪(ABI 381A型)上用固相亚磷酰胺三酯法合成。每个片段被单独合成后，经浓氨水60℃放置过夜，使之从固相上脱落并切除保护基团，初产物浓缩后溶于水，用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，含纯产物的凝胶带经1mol/L碳酸氢三乙胺浸出后，用Sep-pak C-18反相柱按文献方法[Lo，K.-M.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，2285-2289]脱盐后得到纯的寡核苷酸片段。
纯的寡核苷酸片段B，C和D用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常规方法进行5’磷酸化。
C、重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1合成基因各片段的连接及连接产物的克隆寡核苷酸片段配对并连接合成完整的单链DNA正股各片段各取1nmol，负股各片段各取1.2nmol，按如下三组分别配对A+B+A′b，C+bc+cd和D+D′。90℃保温3分钟，然后自然冷却至16℃，将三组溶液合并总体积为34μl，加入2单位T4 DNA连接酶，4℃连接过夜。
连接产物的克隆连接产物经过3％低融点琼脂糖凝胶电泳分离纯化与pET15b的NcoI/BamHI双酶切线性片段按9∶1比例一起连接，直接转化大肠杆菌JM109，酶切鉴定正确的菌落，经进一步顺序分析鉴定证实(图6)，得到了相应的如图5所示的克隆及表达质粒pE2rBmKαIT1。
实施例2基因表达质粒pE2rBmKαIT1，转化大肠杆菌BL21(DE3)。取单菌落接入5ml LB培养基，此培养基中含有Amp(100μg/ml)，在37℃条件下振荡过夜。然后在100ml上述培养基中，按1∶100接种，37℃培养至A600为0.6，再在1L的上述培养基中按1∶100接种，37℃培养至A600为0.6，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，继续诱导4～6小时，表达产物用10％的Tris-Tricine SDS-PAGE检测，结果如图8所示。
实施例3表达产物的体外复性及分离纯化A、包涵体的制备在4℃条件下，离心(5,500g)收集经诱导表达后的大肠杆菌菌体，菌体重悬于20ml缓冲液A中(缓冲液A由50mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，2.5mmol/L EDTA，20mmol/L β-巯基乙醇组成)，加入溶菌酶和PMSF分别至终浓度为0.2mg/ml和1mmol/L，冰浴放置1小时后，超声破菌10分钟(～150W，超声30秒，间歇30秒)，15,000g离心20分钟，收集沉淀。沉淀依次用3×20ml缓冲液A(加入1％(v/v)Triton X-100)和20ml缓冲液A(内含2mol/L盐酸胍)洗涤。每次洗涤前先用缓冲液重悬沉淀，并在室温下搅拌30分钟，然后离心收集沉淀。这样制备得到的即为较纯的包涵体。
B、包涵体的溶解及体外复性将从1L培养基中得到的包涵体100mg，加入5ml变性缓冲液(变性缓冲液含有50mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，6mol/L盐酸胍，0.2mol/L DTT)，4℃放置过夜，离心(15,000g)收集上清。上清以1∶50比例对透析缓冲液4℃透析过夜(透析缓冲液含有50mmol/L Tris(pH 7.5)，4mol/L盐酸胍)后，离心收集透析上清液。透析上清液用Bradford法进行蛋白浓度定量，然后迅速用复性缓冲液稀释此蛋白至终浓度为0.1mg/ml(复性缓冲液含有50mmol/LTris-Cl(pH 7.5)，50mmol/L KCl)。然后4℃放置此复性溶液并用Ellman反应跟踪游离巯基直至呈阴性反应。
C、表达产物的分离纯化将上述复性溶液用离心超滤装置浓缩至3ml，上样至C18 RP-HPLC柱，梯度洗脱。流动相为A液0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)/H2O；B液0.1％(v/v)TFA/乙腈。流速为3ml/min。紫外检测A280。初步分离纯化时梯度为0min(5％ B)，5min(30％ B)，35min(40％ B)，40min(100％ B)，45min(100％ B)，50min(5％ B)，55min(5％ B)。如图10所示重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1的HPLC洗脱行为一致。最终纯化的梯度为0min(22％ B)，40min(26％ B)，45min(40％ B)。如图9和图11所示最终纯化的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的纯度已达95％以上。
实施例4表达产物的纯度及活性测定A、SDS-PAGE通过10％ Tris-Tricine SDS-PAGE进行纯度检测，图9显示重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1不仅和天然的BmKαIT1电泳行为相同，蛋白条带大小显示同预期分子量一致，而且纯度也达到95％以上。
B、圆二色性光谱(CD)重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1均溶于20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。图12显示了重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1具有相同的圆二色性行为，说明了重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1具有与天然的BmKαIT1相同的α螺旋、β折叠等二级结构。
C、毛细管电泳(CE)重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1均溶于50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 2.5)，样品终浓度为0.1mg/ml。从图13上可以看出重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1具有相同的出峰时间，都是8.25分钟，说明它们蛋白的表面性质相同。
D、1HNMR谱()1HNMR谱(图14)显示峰形分散得很好，表明了重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1具有良好的空间三级结构，即二硫键是正确装配的而不是无序的。
E、质谱重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的分子离子峰显示为7310.63±1.07(图15)，与计算的分子量7310.5一致。
F、电生理图16显示了在1μmol/L浓度下重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαITl对大鼠背根神经节的钠离子通道有明显的减缓失活化的影响，说明了重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1具有α型蝎毒素的典型电生理性质。
G、抗昆虫生物活性测定重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1溶于测活缓冲液中，样品终浓度分别为1，1.5，2和2.5ng/μl，每只小蠊注射0.6μl，每个浓度注射8只，共做3组独立实验。根据麻痹百分数对浓度作图，测活结果如图17所示，可得到重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对德国小蠊的50％麻痹量(PU50)为15.6μg/kg，与已报道的天然BmKαIT1的PU50值24.16μg/kg在允许的误差范围内。说明重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1已具有天然BmKαIT1相同的抗昆虫活性。
H、重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1与昆虫钠离子通道的结合测试CM5芯片经NHS和EDC活化后分别与0.2mg/ml的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1进行偶联，然后用乙醇胺封闭。其最终偶联上芯片的RU值分别为768和737，具有相同的偶联水平。蟑螂腹神经节突触体膜悬浮液经Bradford蛋白浓度定量，其浓度为0.45mg/ml(≈0.9nmol/L钠离子通道)。按比例稀释得到一系列浓度的蟑螂腹神经节悬浮液，钠离子通道的浓度，分别为36，18，12，9，6pmol/L。按浓度由低到高的次序依次进样，可得到不同浓度的钠离子通道与芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1(如图18所示)和天然BmKαIT1(如图20所示)结合所引起的RU值的变化。通过BIAevaluation3.1软件按1∶1的Langmuir模式进行动力学拟和，可得到重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1与昆虫钠离子通道的解离平衡常数为1.3×10-9mol/L，天然BmKαIT1与昆虫钠离子通道的解离平衡常数为1.3×10-8mol/L。芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1对蟑螂腹神经节突触体膜悬浮液的非特异性吸附是由高浓度的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1(30μmol/L)与蟑螂腹神经节突触体膜悬浮液(36pmol/L)先在25℃温育1小时后，再进样测定而得。从图19和图21表明高浓度重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1事先对蟑螂腹神经突触体膜的结合可以完全抑制了固定在芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1或天然BmKαIT1对蟑螂腹神经突触体膜的结合，即说明不存在非特异性吸附。
I、重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1与哺乳动物钠离子通道的结合测试大鼠脑突触体膜悬浮液经Bradford蛋白浓度定量，其浓度为0.35mg/ml。按比例稀释得到一系列钠离子通道浓度的大鼠脑突触体膜悬浮液，分别为350，175，116.7，87.5，70，58.3pmol/L。按浓度由低到高的次序依次进样，可得到不同浓度的钠离子通道与芯片表面的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1结合所引起的RU值的变化。通过比较重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1与蟑螂腹神经节突触体膜和大鼠脑突触体膜(如图22和23所示)，可以看出不论重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1还是天然BmKαIT1，其对大鼠脑突触体膜的结合远低于蟑螂腹神经节突触体膜，在175pmol/L的受体浓度下其RU值均低于20RU，说明对大鼠脑突触体膜没有结合。
综合上述实验结果，重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1对大鼠背根神经节的钠离子通道有明显的减缓失活化的影响，与蟑螂腹神经节突触体膜有明显的结合，但与大鼠脑突触体膜没有结合，说明了它具有α型抗昆虫毒素的特征。
实施例5人工基因突变的例子，rBmKαIT1第30位的天冬酰胺(Asn)突变成天冬氨酸(Asp)，即N30D突变体的构建。
A、PCR突变引物的设计PCR突变方法参照《现代基因操作技术》，胡福泉主编，人民军医出版社，第31章用Megaprimer PCR进行基因突变和基因融合。
PCR突变的设计流程参见附图24。上游引物A 5’GCGATGGCCATGGTTCGTGA 3’(内含NcoI位点)突变引物M 5’(即附图24中含突变碱基的下游引物)CTTGGCACCATCCTTAGTGCACAGTTCGTTG 3’下游引物B 5’GAGTGCGGCCGCAAGCTTGCATGCC 3’(含有BamH I和HindIII位点)B、质粒pE2BmKαIT1-N30D的构建PCR1以pE2BmKαIT1为模板，加入上游引物A和突变引物M，进行第一轮PCR，PCR条件与普通PCR相同。PCR产物经Agarose胶回收分离纯化，得到108bp的片段，作为下一步PCR的大引物Megaprimer。
PCR2加入下游引物B，上游引物则采用上一步PCR的产物Megaprimer。100μl PCR反应体积中有模板DNA(与PCR1中相同的pE2BmKαIT1)400ng，下游引物B 25pmol，Megaprimer 18pmol以及一般性PCR反应物。退火温度60℃，扩增30个循环。取5μl反应液经Agarose低熔点胶分离(电泳缓冲液采用修改过的TAE缓冲液，EDTA浓度为0.1mM)，切下含所需大小片段的胶(257bp)放入Ultrafree-DA(Millipore Co.)离心10分钟，得到20μl DNA提取液。取5μl溶液即作为下一步PCR反应的模板。
PCR3100μl反应体积中含模板5μl(约25ng)，上游引物A 100pmol，下游引物B 100pmol以及一般性PCR反应物，扩增30个循环。
PCR产物经Agarose胶回收分离纯化后，用Nco I/BamH I进行酶切与pET15b的NcoI/BamH I酶切的线性质粒连接，构建了pE2BmKαIT1-N30D质粒。
C、rBmKαIT1-N30D的分离纯化及活性测定质粒pE2BmKαIT1-N30D转化大肠杆菌BL21(DE3)。细菌培养及后处理分离纯化操作参见实施例2、3。但是在HPLC分离时没有出现单峰，粗产物测定CD时主要显示“无规卷曲”，1HNMR谱也显示“无规卷曲”，抗昆虫生物活性测定PU50表明其活性约为天然的4％左右。通过以上实验说明30位残基由Asn突变为Asp以后，在我们的复性条件下不能得到正确折叠的产物，这说明30位残基为Asn对于该蝎毒蛋白形成正确的折叠是非常重要的。
权利要求
1.一种重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于该基因的DNA核苷酸顺序如下所示1 76C ATG GTT CGT GAT GCA TAT ATT GCC CAA AAC TAC AAT TGT GTA TAC CAT TGT GCT CGT GAT GCA TAT TGC AAC GAA151CTG TGC ACT AAG AAT GGT GCC AAG TCC GGA TCT TGC CCA TAC TTG GGT GAG CAC AAA TTC GCC TGC TAC TGC AAG206GAC CTG CCA GAT AAC GTT CCA ATC CGT GTC CCG GGT AA6 TGC CAC TAA TAGGATC
2.如权利要求1所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于由这个合成基因衍生的突变体基因，与权利要求1所述的合成基因相对应的密码子有50％以上相同。
3.如权利要求1所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的表达质粒是质粒pE2rBmKαIT1(CGMCC No.0655)，结构如下所示
4.如权利要求1所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于所述的表达质粒的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
5.如权利要求1或2所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因的应用，其特征在于应用于产生重组东亚马氏钳蝎毒蛋白rBmKαIT1及其突变体，包括将合成基因克隆入表达质粒载体构建成表达质粒pE2rBmKαIT1，然后在大肠杆菌中表达，通过体外复性和分离纯化获得重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的方法。
6.如权利要求5所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1基因的应用，其特征在于所述的表达质粒载体是pET15b。
7.如权利要求3所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的应用，其特征在于所述的表达产物经体外复性并分离纯化，获得有活性的重组东亚马氏钳蝎毒蛋白，其所含有的四对二硫键具有正确的共价键连接。
8.如权利要求1所述的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的应用，其特征在于具有完整α型抗昆虫活性。
全文摘要
本发明涉及基因工程制备的重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1。本发明通过设计和化学全合成获得了编码重组东亚马氏钳蝎毒rBmKαIT1的基因后使之克隆入质粒,它在大肠杆菌中获得高表达,表达产物以包涵体形式出现并占菌体总蛋白的15%左右。经过变性、复性、高效液相色谱分离纯化后可获得纯度达95%以上的活性rBmKαIT1。全蝎是我国传统的名贵中药,其有效成分正是蝎毒,具有极高的应用开发价值,但从蝎尾腺采集费时而且量少。因此本基因工程所得的重组东亚马氏钳蝎神经毒rBmKαIT1具有诱人的应用前景和潜力。
文档编号A01N63/00GK1373219SQ0211058
公开日2002年10月9日 申请日期2002年1月18日 优先权日2002年1月18日
发明者陈海宝, 黄昊 申请人:中国科学院上海有机化学研究所