专利名称：小孢子成熟胚直接萌发成植株的制备方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，具体地说，本发明涉及一种小孢子成熟胚直接萌发成植株的制备方法。
背景技术：
植物小孢子又叫幼嫩花粉是一种单倍性，单细胞的群体。在体外通过组织培养可诱导小孢子脱分化，启动胚性分裂形成胚。目前，小孢子(花粉)胚胎发生已在25个科，50个属，近200个种中取得了成功(Ferrie AMR，Palmer CE，KellerWA.，Haploid embryogenesis.InThorpe TA(ed)In vitro embryogenesis.In plants.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht.，1995.309-344.)。与其它体外胚胎发生体系相比，由小孢子发育而来的胚状体具有个体形态更为一致，发生量大，结构完整等优点，而且其具单倍体的遗传背景，经自发或人工加倍后，即可获得纯合的二倍体，因而在无性系快速繁殖，植物遗传工程和品种改良等方面的应用价值都受到高度重视(Ragharan V.，Embryogenenic Development of Pollen Grains.InRagharan V(ed)Molecular embryology of flowering plants.New YorkCambridgeUniversity Press，1997.500-524.)。然而其应用潜力在很大程度上要受到花粉胚状体直接萌发困难，或者萌发率不够高的限制。这主要是由于胚状体萌发过程中存在一个问题，即接种的胚状体直接萌发受到抑制，通常需要二次成胚或愈伤化后通过器官发生再生小植株。按照常规的方法，将油菜小孢子胚状体接种于B5培养基上，只有极少数(5-7.8％)从分生组织处正常萌发，直接再生小植株，大多数胚状体在培养基上先愈伤化，再二次成胚，或通过器官发生形成小植株(Chuong PV，Beversdorf WD.High frequency embryogenesis through isolatedmicrospore culture in Brassica napus L.and B.carinata Braun.Plant Sci，1985，39219-226；Swanson EB，Coumans MP，Wu SC，Barsby TL，Beversdorf WD.Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryosfrom Brassica napus.Plant Cell Rep，1987，694-97；Cao MQ，Li Y，Liu F，Dore C.Embryogenesis and plant regeneration of pakchio(Brassica rapa L.ssp.Chinensis)via in vitro isolated microspore culture.Plant Cell Rep，1994，13447-450)。同时，在其萌发和生长中，常出现分生组织缺乏，早期坏死，多子叶等不正常现象(CaoMQ，Li Y，Liu F，Dore C.Embryogenesis and plant regeneration of pakchio(Brassicarapa L.ssp.Chinensis)via in vitro isolated microspore culture.Plant Cell Rep，1994，13447-450)。Senaratna T等(1991)将油菜(B.napus.L)子叶期的小孢子胚先在50mM的ABA处理7天后，再于低于15％的湿度下干化处理至少7天，获得了较好的萌发效果，直接萌发频率可达50％(Senaratna T，Kott L，BeversdorfWD，Mckersie BD.Desiccation of microspore derived embryos of oilseed rapa(Brassica rapa L.).Plant Cell Rep，1991，10342-344.)。但此法复杂、费时，且萌发频率仍不能满足要求。
发明内容
本发明目的在于提供一种小孢子成熟胚直接萌发成植株的制备方法，该方法解决小孢子胚难以直接萌发成苗的技术难题，可使80％以上的小孢子胚直接萌发成植株。
根据本发明提供的方法并使用本发明提供的培养基可实现上述目的。
一种小孢子胚萌发成植株的方法，该方法包括以下步骤1、小孢子的制备选取小孢子处于单核晚期的新鲜花蕾，消毒，无菌水洗去消毒液，在B5培养基中轻轻挤压花蕾，使小孢子游离至培养基中，过筛除花蕾组织残渣，离心收集小孢子；2、小孢子胚的诱导用NLN-13培养基调小孢子密度至1-2×105/mL，分装小孢子于培养皿中， 28-35℃恒温暗培养12-16天，移至25-28℃，在光照为2-10μmol·s-1·m-2时，培养8-12天，再用NLN-0培养基稀释至300-400胚状体/3.5cm培养皿，弱光培养10-15天，形成小孢子胚；3、小孢子胚的萌发将具有明显的根和子叶，长度为6-8mm已分化完全的胚的根插入含氯化钙的MS固体培养基中，在28-35℃恒温，光照为2-10μmol·s-1·m-2时培养12-16天形成植株，其中培养基的组成是(以下简称WH-1培养基)(以1000毫升计)MS常用培养基 500毫升水500毫升氯化钙 700-1000毫克蔗糖 20-30毫克琼脂 6-10毫克调PH至5.3-6.0在本发明的一个优选方案中，由小孢子萌发成植株的方法包括以下步骤1、孢子的制备选取小孢子处于单核晚期的新鲜花蕾，消毒，无菌水洗去消毒液，在B5培养基中轻轻挤压花蕾，使小孢子游离至培养基中，过筛除花蕾组织残渣，离心收集小孢子；2、小孢子胚的诱导用NLN-13培养基调小孢子密度至1-2×105/mL，分装小孢子于培养皿中，32℃恒温暗培养14天，移至25℃光照为2-10μmol·s-1·m1时培养10天，再用NLN-0培养基稀释至300-400胚状体/3.5cm培养皿，弱光培养15天，形成小孢子胚；3、小孢子胚的萌发将已分化完全的胚的根插入含氯化钙的MS固体培养基中，在32℃恒温2-10μmol·s-1·m-2培养30天形成植株，其中培养基的组成是(WH-1)(以1000毫升计)MS常用培养基 500毫升水500毫升氯化钙900毫克蔗糖 30毫克琼脂 8毫克调PH至5.8本发明的方法与现有技术相比具有下列优点1、萌发频率高，达80％以上。传统方法最高仅达50％。
2、操作简单，只需使用特制的培养基，按传统方法接种即可。
3、无须进行低温、干化及激素处理。传统方法必须经过各种预处理才能使胚直接萌发。
4、降低了染色体变异的可能性。如经愈伤组织化再生苗，或经二次胚胎发生形成苗，染色体变异的机会将大大增加，不利于保持物种的特性。
5、提高了遗传转化效率。转入外源基因的幼胚如经愈伤组织化再生苗，或经二次胚胎发生形成苗，会明显降低转化细胞形成苗的机会，从而降低了转化效率。
为了叙述方便，在本发明中小孢子是指单核晚期花粉；小孢子胚是指由小孢子经组织培养诱导产生的胚；小孢子胚的直接萌发是指由小孢子胚经生长发育直接形成植株；植株是指有完整根、茎、叶成熟结构的植物个体。本发明中的氯化钙是可溶性的，其它可溶性的钙盐也可应用于本发明领域。有效钙离子浓度达800-1000毫克/升即可。MS培养基是指Murashige T和Skoog F1962年发明的培养基(Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bio-assayswith tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15473-497.)，B5培养基是指SattoT，Nishio T，和Hirai M.1989发明的培养基(Satto T，Nishio T，Hirai M.Plantregeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage(Brassicacampestris ssp.Dekinensis).Plant Cell Rep，1989，8486-488.)。
图1分化成熟的小孢子胚图2插入固体培养基的小孢子胚图3小孢子胚高频率直接萌发群体图4由小孢子胚直接萌发成苗
具体实施例方式
在本发明中，氯化钙是可溶性的，其它可溶性的钙盐满足800-1000毫克/升钙离子浓度也可应用于本发明领域。
作为能够应用本发明方法的植物的实例，可以列举属于下列目的植物大白菜，芥菜等，青菜，萝卜，红菜薹等作为这些植物的具体实例，可以列举的有油菜。
一种小孢子胚萌发成植株的培养基，该培养基为(以1000毫升计)MS常用培养基 500毫升水500毫升氯化钙700-1000毫克蔗糖 20-30毫克琼脂 6-10毫克调PH至5.3-6.0
本发明的培养基主要是在半量的MS培养基的基础上，附加一定数量的氯化钙。氯化钙是可溶性的，其它可溶性的钙盐满足800-1000毫克/升钙离子浓度也可应用于本发明领域。小孢子胚在此培养基上进一步可直接萌发成植株。
根据本发明提供的方法和特殊培养基，能够由植物的小孢子直接高频率地萌发成植株，这些植株再通过常规的培养方法进一步培养成可供育种和/或生产的种苗，从而使具有相同性状的小孢子胚大量产生。顺便指出，本发明得到的植株可进一步通过普通的栽培方法长成具有相同性状的完整成熟植株体。
实施例2油菜小孢子胚高频率直接萌发成植株选取小孢子处于单核晚期、长约3mm的新鲜花蕾材料，置于4％的次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水洗3-4次，加入B5培养基4-5ml，用平头玻棒轻轻挤压花蕾，使小孢子游离至培养基中，通过50μm孔径尼龙筛网除去花蕾组织残渣，加入5mL新鲜B5培养基冲洗筛网，收集小孢子悬液，用100×g，3min离心，洗涤3次，最后用NLN-13培养基(NLN培养基，附加13％蔗糖，不加外源激素，pH6.0)将小孢子密度调至1-2×105/mL。将小孢子悬液分装于3.5cm小培养皿中，每皿1.5mL，32℃恒温暗培养，约14天，移至25℃弱光培养，10天，用NLN-0(NLN培养基，不加外源激素和渗透压调节剂)稀释至300-400胚状体/3.5cm小培养皿，弱光培养10-15天，得到小孢子胚，此时孢子胚已分化完全，具有明显的根和子叶，长度6-8mm；将小孢子胚移至WH-1固体培养基上继续培养。孢子胚的培养基组成与实施例1相同。
权利要求
1.一种小孢子成熟胚直接萌发成植株的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤A、孢子的制备选取小孢子处于单核晚期的新鲜花蕾，消毒，无菌水洗去消毒液，在B5培养基中轻轻挤压花蕾，使小孢子游离至培养基中，过筛除花蕾组织残渣，离心收集小孢子；B、小孢子胚的诱导用NLN-13培养基调小孢子密度至1-2×105/mL，分装小孢子于培养皿中，28-35℃恒温暗培养12-16天，移至25-30℃，在光照为2-10μmol·s-1·m-2时，培养8-12天，再用NLN-0培养基稀释至300-400胚状体/3.5cm培养皿，弱光培养10-14天，形成小孢子胚；C、小孢子胚的萌发将根和子叶，长度为6-8mm已分化完全的胚的根插入含附加氯化钙的MS固体培养基中，在28-35℃恒温，在光照为2-10μmol·s-1·m-2时，培养12-16天形成植株，其中培养基的组成是MS常用培养基 500毫升水500毫升氯化钙 700-1000毫克蔗糖 20-30毫克琼脂 6-10毫克调PH至5.3-6.0。
2.根据权利要求1所述的小孢子成熟胚直接萌发成植株的制备方法，其特征在于培养基的组成是MS常用培养基 500毫升水 500毫升氯化钙 700-1000毫克蔗糖 30毫克琼脂 8毫克调PH至5.8。
全文摘要
本发明公开了一种小孢子成熟胚直接萌发成植株的制备方法，首先是小孢子的制备，选取小孢子的新鲜花蕾，消毒，无菌水洗去消毒液，在培养基中挤压花蕾，过筛、离心收集小孢子；其次是小孢子胚的诱导，用培养基调小孢子密度，恒温培养；第三是小孢子胚的萌发，将根和子叶及一定长度的已分化完全的胚的根插入固体培养基中，光照培养一定时间后形成植株。本发明操作简单，萌发频率高，可广泛应用于植物育种和科学研究。
文档编号A01H4/00GK1421125SQ0214789
公开日2003年6月4日 申请日期2002年12月20日 优先权日2002年12月20日
发明者孙蒙祥, 田辉 申请人:武汉大学