专利名称：哺乳类动物的脏器保存方法
技术领域：
本发明涉及在生物体外长期保存哺乳类动物的脏器的技术。
背景技术：
人类的肺、心脏、肝脏、肾脏、胰腺等脏器的临床移植治疗早已被实用化、日常化，但相对于每年增加的等待移植的患者的捐赠者不足的问题非常严重，等待手术的时间延长了。另外，即使脏器移植的捐赠者出现了，目前的状况是像血液这样长期保存或者供给体制的配备不充分。
特别是在移植脏器方面，低温保存是主流，对脏器移植的有效的保存时间的界限是保存约4～24小时(Cooper JD，Patterson GA，Trulock EPet all；J.Thorac.Cardiovasc.Surg.107，460-471，1994)。
在实际使用University of Winsconsin Solution液(UWS液)进行的大鼠、兔子、狒狒的摘出心脏的低温保存和再生中，限度为6～18小时(Makowka I，Zerbe TR，Champman F，et all；Transplant Proc.21，1350，1989 and Yen T，Hanan SA，Johson DE，et all；Ann.Thorac.Surg.49，932，1990)。
另外，组合使用该UWS液和全氟化碳介质保存大鼠的心脏并移植成功，为24小时(5只全部)到48小时(5只中的4只)(Kuroda Y，KawamuraT，Tanioka T，et all；Transplantation，59，699-701，1995)。该理由的根据在于摘出的心脏一旦暴露在4℃的低温或者受到缺血伤害，则细胞膜受到损伤，因此组织细胞不能再生(Pegg DE；Organ presevation.Surg，Clin.Notth Am.66，617，1986OzMC，Pinsky DJ，Koga S，et all；Circulation 88，291-297，1993and Heffner JE，Pepine JERev.Pespir.Dis.140，531-554，1989)。
哺乳动物的活体组织的长期保存·再生的技术一直只在血液、精子、卵子等单细胞方面进行开发。有关作为细胞的集合的组织或者由若干个组织构成的脏器的低温保存，也正在朝实用化进行，总之，目前的状况是必须在最大24小时以内进行移植(Kalayoglu M，Sollinger HW，Strarra RJ，et all；Lancet，2，617，1988)。
附带说一下，海藻糖是在自然界广泛分布的非还原性的二糖类，据报导在各种应激下，对细胞膜构造具有稳定化或保护的作用(Crowe JH，CroweLM，Chapman D；Science 233，701-703，1984 and Wiemken A；Ant inei VanLeeunwenhoek.58，209-217，1990)。据报导，心脏一旦暴露在4℃的低温或者受到缺血伤害，海藻糖就会对细胞膜显示出保护作用(Stringham JC，Southhard JH，Hegge J，et all；Transplantation，58，287-294，1992and Hirata T，Fukuse T，Liu CJ，et all；Surgery，115，102-107，1994)。另外，据报导，在缓步类动物的高静水压实验中，一旦成为无水状态，则海藻糖增大10倍(Crowe JH，Crowe LM，Chapman D；Science 233，701-703，1984 and Crowe JH，Crowe LM，Chapman D，Aurell Wistorm C；Biochemical Journal，242，1-10，1987)。该缓步类动物由约40000个细胞构成，是也具有神经细胞的多细胞生物。
本发明人发现了干燥状态的缓步类动物等在全氟化碳液中，可以耐受所谓极限为600Mpa这样的高水压环境的负荷，保持着生命力(KunihiroSeki et al；Nature Vol.395，No.6705，pp.853-854，29 Oct.1998，和特开平11-289917号；该内容引入本说明书中，作为参考)。缓步类动物的干燥状态通过大桶状态或酒桶状态形成。其生理机理虽然不十分明了，但可知缓步类动物的体内的水分量极端减少，成为脱水状态。
上述以往的脏器的冷藏保存是通过降低脏器的温度，使其代谢功能降低，从而维持其生存状态。通过温度降低，虽然代谢功能降低了，但在作为极性介质的水分中存在丰富的离子，它们成了随着时间流逝引起细胞的自崩溃、细胞死亡、坏死(Necrosis)的原因。
因而，冷藏保存的保存时间越长，就不可避免地具有严重的血栓或功能障碍急增的可能性，其保存时间存在质的界限。
另一方面，一般动物的组织细胞如果没有水分则不能生存。如果是由不同种组织构成的高等脏器的话，容易预计由干燥状态的再生是不可能的。以往已经开发出干燥保存植物或各种细菌的技术，但还没有看到干燥保存高等动物的器官本身之后使其再生的实验例。
令人惊奇的是，本发明人发现在一定的条件下，从哺乳类动物摘出的脏器除去大量的水，将该脏器浸在惰性介质中并在低温下保存时，达到和缓步类动物以酒桶状态长时间维持生命时一样的假死状态(apparentdeath)状态(特开2000-72601将该申请引入本说明书中，作为参考)。
特别令人惊奇的是，确认了哺乳类动物的多细胞且多组织的脏器从极度脱水状态再生，以及再生的心脏的跳动。这些脏器的各细胞被认为处于氧消耗量极端地降低至正常时的1/1000或以下或者氧消耗实质上停止了的假死状态。
用特开2000-72601所公开的方法保存的脏器，再生后可以采集活的神经或干细胞，可以将脏器自体或采集的组织用在移植治疗中。另外，在病理组织学的研究中，重大的意义在于可以长期保存可再生的生物体材料而不是坏死的标本。
上述保存方法可以防止在活体外保存的脏器的细胞或组织的随时间流逝的自崩溃，可以大幅度增加保存的天数，但该脱水方法依赖于与脏器接触的脱水剂。为了进一步改良该保存方法，需要探索更优异的脱水方法。
发明的公开本发明涉及哺乳类动物的心脏这样的脏器的保存方法，包括从脏器除去水分且残留可以再生的水分量的脱水步骤，和将脏器浸渍在惰性介质中，保持在冷藏温度下的步骤。
本发明的哺乳类动物的脏器的保存方法包括，脱水步骤，该步骤从含有生理学上正常水分量的脏器，通过其血管系统导出该脏器内的水分，来除去相对于脱水前的脏器总重量，重量比为约10％或以上或25％或以上的水分，且相对于脱水前的总水分量，残留重量比为约10～约20％或以上的水分；和将该脏器浸渍在惰性介质中，并保持在冷藏温度下的步骤。上述脏器可选自心脏、肝脏、肾脏、胰腺和肺。
本发明的哺乳类动物的心脏的保存方法包括，脱血步骤，该步骤将生理盐水溶液灌注到心脏中，将心脏内的血液置换为生理盐水溶液；脱水步骤，该步骤从脱血的心脏，通过其血管系统导出该脏器内的水分，来除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约10～约50％的水分；以及将该心脏浸渍在惰性介质中，并保持在约1～约8℃的冷藏温度的步骤。另外本发明理论上也可以包括除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约25％～约60％的水分的脱水步骤。
利用上述血管系统的脱水，包括向脏器或者心脏的血管系统送入气体。例如，将气体灌注到心脏的大动脉时，通过该气体的流动，从该心脏的血管系统导出水分。即通过该气体的流压，水分被挤出到脏器外。优选流压是恒压。而且，上述脱水步骤也可以进一步包括使脱水剂与浸渍在惰性介质中的脏器接触。特别是在使用气体的脱水中，为了避免血液和灌注的气体接触而凝固的问题，优选在脱水步骤之前，用生理盐水溶液对脏器进行脱血处理。最优选的是流压是恒压的脱血灌注。
送入到血管系统中的气体优选使用空气、O2-CO2混合气体，但也可以使用N2、He、Ar、Ne、Kr或者Xe等惰性气体。例如，使用用于灌注生理盐水溶液的灌注装置，可以送入气体来取代该生理盐水溶液。通过向血管系统灌注气体，脏器内的体液被挤出，而且，从一个个细胞经毛细管导出水分。
作为送入到血管系统中的液体，包括浓度比脏器的体液高的高渗溶液那样的利用渗透压差从细胞转移水分的溶剂。另外也可以是后面所述的惰性介质或者醇类。
通过上述介质进入到上述血管系统的毛细管中而产生流压，使气体大致相等地到达全体脏器组织，因此，气体在毛细管中循环(例如从动脉血管到静脉血管)，能够达到血管系统的另一端。该脱水由于利用在脏器中固有的水分供给路径，所以可以以各个组织或细胞为目标，慢慢地制造出均匀的脱水状态。即使是哺乳类动物的多细胞且多组织的脏器，也可以不对生物体组织施加无用的应激，向高度的脱水状态转移。因而，通常即使是对生物体组织成为应激的10wt％或以上或者25wt％或以上的脱水，脏器也可以不伴有缺血障碍或生物体组织的损伤，达到极其稳定的假死状态。于是，在恢复水分时，功能复原，不仅其细胞或组织，而且脏器自体的功能也可以再生。
一般假死状态意指生物学上的假死，但在本发明中意图的假死意指通过高度的脱水状态，不能确认外观上的生命现象，但在恢复水分时，可以再次确认生命现象的状态。本发明中所谓的“再生”意指从该脱水状态恢复水分时，可以确认组织的电生理学反应或者作为器官的生物学的生命活动的现象。
在其它方面，本发明涉及哺乳类动物的心脏的保存方法，包括，在含有生理学上正常水分量的脏器表面上形成油膜的步骤、通过将该心脏暴露在气体中，使该心脏内的水分蒸发到该气体中，由此除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约10％或以上的水分的步骤和将该脏器保持在约1～约8℃，优选约2～约4℃的冷藏温度下的步骤。
本发明还涉及哺乳类动物的心脏的保存方法，包括向心脏灌注生理盐水溶液，将心脏内的血液置换为生理盐水溶液的脱血步骤、在脱血的心脏的表面形成油膜的步骤、通过将该心脏暴露在气体中，使该心脏内的水分蒸发到该气体中，由此除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约10～约50％的水分的步骤和将该脏器保持在约1～约8℃的冷藏温度下的步骤。
采用本发明的方法，一旦除去来自脏器的组织和细胞的游离水，则难于受到可使生物体膜等的生物结构在水相中活化的物质，特别是金属离子的攻击。另外，可认为该生物结构被其周围被称为结合水的结晶状态的水包围而受到保护。使生物组织恶化的极性介质被除去的结果是，组织或细胞可以逃避不可逆的经时崩溃，从而谋求脏器的保存状态的质的改善。此时，保存液中的海藻糖赋予生物结构的稳定化。
通过将被加热到体温程度的体液或者代用体液，例如上述生理盐水溶液、人工血液和/或血液灌注到其血管系统中，用本发明的方法保存的心脏、肝脏、肾脏、胰腺或者肺可以再生。对于再生的脏器，可以将该脏器或从该脏器采集的组织移植到人体中。另外，从再生的脏器采集神经组织、其它活的组织或细胞，可用在药理试验等中。
另外，本发明可适用于以向人体异种移植为目的的除人之外的哺乳类动物的脏器，由此，可以提供因捐赠者不足估计在临床上的需要增大的动物脏器的保存技术。特别是本发明在养殖的猪的心脏、肝脏、胰腺等的可大量生产的脏器的保存中也是有用的，提供可耐受长时间的输送，尤其是超过数十小时的航空输送的保存技术。
再者，如本发明可长期保存的技术对脏器库的建立是有用的。例如，通过培养具有像胚胎干细胞这样具有全能性的干细胞，可以再生所需的组织或器官，本发明可适用在它们的保存中。在发现疾病前，通过保存预备的脏器，发病后可马上接受移植。而且本发明对脑或其它神经组织等的保存也是有用的。
术语的定义本发明中所谓的“除去约10％或以上的水分”或“除去约25％或以上的水分”是指除去血管系统内的体液以及各个细胞和细胞间的游离水。另外，本发明中所谓的“保留约10～约20％或以上的水分”是指包括在生物组织内的结合水，对于再生具有充足量的水分。在本发明中，一般认为控制保存的脏器的新鲜度的主要是游离水的量，理论上，为了实现保存时间的长期化，优选尽可能除去游离水。另外，为了保持再生能力，优选残留可以保持结合水的范围的水分量。所谓结合水是可观测到水合状态或者结晶状态的水，游离水可定义为结合水以外的水。
血管系统在解剖学上被分为血管系统和淋巴系统。本发明中所谓的“血管系统”优选包括用于向脏器的各个细胞补充水分和养分的营养血管系统。另外，如果是心脏，可将灌注装置和与心房和心室连接的固有的血管连接，向与心脏的营养血管系统连接的冠状动脉和冠状静脉间接地施加流压。进而，所谓像肝脏这样的营养血管系统是具有另外与门脉循环有关的功能血管系统的脏器，也可以利用这样的功能血管系统。
在本发明中所谓的“含有生理学上正常水分量的脏器”是指，典型地从活体摘出后的状态的脏器，另外，例如在包括脱血步骤的发明中，可理解为是通过用于脱血的灌注，其血液被置换为生理盐水溶液的状态的脏器。将具有这样的生理学上正常的水分量的脏器的重量作为基准，可以特别指定上述脱水量。
在本发明中所谓的“生理盐水溶液”是和血液一样的具备生物学活性的代用体液，已知代表性的是林格液(Ringer’s solution)，例如是KH(Kreps-Henseleit)液。可以在这种生理盐水溶液中溶解使用有助于脱水状态的生物结构稳定的多糖类。这种多糖类优选海藻糖。另外，作为其它的生物结构物质，也可以将苹果酸、甘露糖醇、甘油、甜菜碱、脯氨酸、1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-吡啶甲酸等氨基酸溶解在生理盐水溶液中使用。
本发明中所谓的“惰性介质”是在水和油中不溶解的介质，是在保存温度下为液状的氟化烃液体，特别优选全氟化碳液体。另外，只要满足类似于其的条件，不限于液体，也可以使用气体、溶胶或者凝胶。再者，作为其它惰性介质，可以使用水银或者硅酮油。
附图的简单说明
图1是在实施例3的实验8中纪录的心电图。
图2是在实施例3的实验9中纪录的心电图。
图3是在实施例4的实验1中纪录的心电图。
图4是在实施例4的实验2中纪录的心电图。
图5是在实施例5的实验中纪录的心电图。
实施发明的最佳方式包括利用血管系统的脱水的发明的方式一般来说，一旦血液和气体接触，或者暴露在低温下，就会凝固而引起血栓，这会妨碍后面所述的脱水或者再生。因此，保存对象的脏器，例如通过手术摘出的脏器，要被洗净，脱血。作为用于脱血的灌注装置，可以使用公知的Langendorff的装置，对于该脱血灌注的技术，作为Langendorff法(Doring H.J，Dehnert H；Biomesstechnik-Vertag MatchGmb，Germany，1988)，本领域技术人员是公知的。按照Langendorff法，对于脏器，将灌注用的导管(或者套管)安装到其血管系统的大动脉上，向血管系统送入海藻糖-KH(Kreps-Henseleit)混合液，将脏器的血液置换为生理盐水溶液。对该生理盐水溶液预先充入氧气，脏器内经常被送入新鲜的代用液体。利用该灌注进行脱血时，脏器的温度降低至1～8℃，使脏器的活动停止。脱血完了，接着进入脱水步骤。
脱水步骤利用在上述脱血中使用的Langendorff的装置来完成。例如，在规定的流压下，从灌注装置向脱血完了的脏器的大静脉送入气体来代替生理盐水溶液。人工灌注手段不限于单方面从大动脉送入气体的手段，本领域技术人员容易理解也包括在大动脉和大静脉之间连接的封闭循环系统。即，上述气体灌注不限于送入气体的方法，也可以是将血管内抽真空的方法。
利用上述灌注装置向血管系统施加流压时，生理盐水溶液从脏器内的大静脉侧流出，进行脱水。优选进入到血管内的气体通过各个毛细血管流向大静脉侧，而且各个细胞和细胞间的水分因其蒸汽压而进入到流过血管内的气体中。最终，各组织和细胞内的游离水的大部分通过血管系统向脏器外排出。
利用上述血管系统的脱水与接触脱水剂的处理不同，而是利用在脏器内均匀分布的毛细血管的极其广大的表面积的脱水，虽然是慢慢地，但可以在比较短的时间里将组织和各个细胞目标性脱水。与上述脱水剂相比较，脱水较均匀且脱水的脏器的变色情况也不严重，从这一点就可以看出其优点。如后面所述的实施例所示，在利用气体灌注的脱水中，实际上再生率非常高，且可以看到再生状态的改善。另外，用气体的脱水是从外部有效控制的主动的处理，对于要求迅速且慎重处理的脏器来说是应激少且有效的手段。
送入到血管系统中的气体可以是在市售的钢瓶中装满的便宜的压缩气体。如果是O2-CO2混合气体的话，优选含有低于5％CO2的混合气体。另外，在后面所述的实施例中，使用的是干燥的气体，但也可以使用含有湿气的气体。而且作为脱水用的气体，更优选可使用N2、Ne、Ar、Ne、Kr或者Xe等惰性气体。在惰性气体中，Xe价格高，但由于有报导其对生物组织有麻醉作用，所以预期在本发明的脱水中使用Xe的优点较大。另外，使用惰性气体也意味着可以避免由活性氧造成的生物组织的损伤。
除了用上述气体灌注的脱水之外，也可以辅助性合并使用保存时使脱水剂直接或间接地与脏器接触的脱水方法。
在脱水步骤中使用脱水剂的场合，将调整到所需容量的脱水剂和脏器一起浸渍在后面所述的惰性介质中的方法是简单的。具体地说，将例如用硅胶、分子筛、沸石等包围的脏器收纳在相对于保存用的惰性介质是惰性材质的金属丝网、合成纤维网等中，使它们浸渍在惰性介质中。
使用的脱水剂的量可以从该脏器所需的后面所述的除水率来计算，另外，浸渍后，也可在适当的时间除去、追加或交换脱水剂。
另外，在本发明人的缓步类动物的实验中，在高湿度，优选80％湿度的环境下进行脱水处理时，再生率可达到100％。如果考虑此情形，可认为脏器在高湿度下进行脱水处理是优选的。
上述气体灌注的条件的一个例子是在0.05～0.2kgf/cm2，优选0.1kgf/cm2的流压下，1小时～1小时30分钟或以上，将空气灌注到大鼠的心脏的大动脉中。最优选在恒压下的灌注。通过这样的空气灌注，对于即将该脱水之前的脏器，可以达到25wt％或以上的除水率。
即将脱水前的脏器是具有代用体液，含有生理学上正常水分量的脏器，为了长期保存，从该水分量尽可能除去大量的游离水。在本发明中，用以下式表示的脏器总重量作为基准的水分除去率(重量比)规定应该除去的水分量。
水分除去率(重量比)＝100-(脱水后的脏器总重量÷脱水前的脏器总重量×100)在特定上述脱水状态时，除了作为重量比的水分除去率之外，还可以使用NMR，规定脏器内的水分子的绝对量或其状态。NMR是在生物组织中的水的状态的研究中一直最为广泛使用的手段。
对于使用NMR的生物组织中的水的最初的研究是由Belton，P.S.，Jackson，R.R.，Packer，K.J.Pulsed NMR studies of water in strainedmuscle，I.Transverse nuclear spin relaxat ion times and freezingeffects；Biochem.Biophys.Aata.28616-25(1972)报导的。而且，用NMR的水的结构解析是由例如Hazlewood，C.F.，Chang，D.C.，Woessner，D.E.，Nichols，B.C.Nuclear magnetic resonance transverserelaxation times of water protons in skeletal muscle. Biophys.J.14583-605(1974)报导的。
Belton等下结论为水由3个状态构成，约8％的水分子是与细胞膜的内膜、蛋白质、核酸这样的生物体内分子结合的结合水，约82％的水分子是结合水以外的游离水，残存的10％的水分子是与细胞膜的外侧相接的游离水。该结合水和其它的水分子不同，确保一定优势的配行，基于和生物高分子直接结合的水分子，在数个分子层中处于定向的状态。
一般可理解为在生物组织内的总水分量中，结合水占约10～约20％，游离水占约80～约90％。在大鼠的心脏内，以脏器总重量为基准，一般总水分量为约80质量％，结合水为8～16质量％，游离水为64～72质量％。
在本发明涉及的脱水步骤中，理论上可认为可以除去脏器总重量的约25～60wt％的水分。如果是该程度，一般认为除去的水全部是游离水。
因而，脱水的结果，大鼠心脏内残存的自由水的质量％降至数％～40％左右，但结合水的绝对量没有变。即使实际的水分量因动物种类或脏器的种类多少有些不同，通过除去相对于脱水前的脏器总重量，重量比为约25％或以上的游离水，也可以残留相对于脱水前的总水分量，重量比为约10～20％或以上的水分(含结合水)。
脏器所允许的自由水的除去率因脱水方法、脏器的种类、所希望的保存期、其它的保存条件而异。目前，认为对于大鼠心脏来说，约25～35％是安全的。对猪的心脏来说，一般认为约10～50％，特别是15～25％比较合适。
在现阶段，上述的脱水状态与在脏器的保存时间的增加如何相互关联的机理不十分明了。根据本发明人的研究，至少可以判断为，保存时间的增加不取决于保存液的成分，在很大程度上取决于脏器的组织或细胞内的水分子的绝对量。从通过各组织和细胞的脱水没有发现实质性的生命活动的脏器在其后再生的事实，可认为脏器达到假死状态(apparent death)。该假死状态可以称为“不死的状态”或者学术上称为“crypotbiotic状态”(Vreeland H.R.et al；Nature Vol.407 pp.897-900，19 Oct.2000Cano J.R at al；Science Vol.268 pp.1060-1064，19 May.1995)。
被脱水的脏器在作为在水和油中不溶的惰性介质的全氟化碳中保存。脏器浸渍到惰性介质中一般在常压下的密闭状态下进行，还可以根据需要在加压状态下进行。此时，如上所述，也可以与脱水剂一起保存。另外，惰性介质优选被纯氧充气。
本发明中所谓的“冷藏温度或以下的温度”是在约+1～约+8℃，优选约+2～约+4℃附近，在该保存状态下可以保持规定的天数。另外，如果充分除去脏器的自由水，理论上也可以在冷藏温度，例如在液氮内保存。
脏器从保存状态的再生可以利用上述Langendorff法。首先从全氟化碳中取出保存的脏器，如果有脱水剂，将其除去。将该脏器放入+4℃的培养皿内的KH液体中，优选用纯氧充气的KH液中。将灌注用的导管固定到该脏器的大动脉上，优选将连续用O2-CO2混合气体充气且在加热至37℃的KH液体通过灌注泵产生的一定流量下送入大动脉侧的导管中。通过该灌注谋求脏器的再生。
在哺乳类动物的脏器的保存中成为问题的是在必须验证保存后脏器的哪个组织真的生存下来了等方面。作为其手段，有组织解剖学的手段、实际移植而验证的移植法、电生理学的手段等。无论采用这些手段的哪一种，首先都必须验证组织细胞是否生存。
在本发明中，作为验证组织细胞的再生的方法，使用电生理学手段，例如对心脏使用心电图测定。心电图可以实时纪录神经细胞组织的活动，可以在神经细胞的活动消失的时点，判断细胞死亡发生的情况。另外，辅助性的，可以用目视观察脏器组织的变色情况，除此之外，如果是心脏，通过确认有无心脏跳动，可以观察作为脏器的再生状态。
包括油膜的形成以及通过暴露在气体中达到脱水的发明该发明使用将脏器暴露在气体中而达到水分蒸发来代替上述从血管系统的脱水。其脱血步骤和再生步骤基本上与从上述的血管系统脱水的发明相同。对于通过暴露在气体中的发明，其保存步骤既可以应用，也可以不应用将脏器浸渍在惰性介质中的上述保存方法。在不将脏器浸渍到惰性介质中的场合，干燥的脏器可以在所需的保存期间，在冷藏温度下保持在适当的湿度的气体中。
将脱血的脏器和套管一起从灌注装置中取下，轻轻地浸渍在油中。在脏器的整个表面形成油膜。油膜的形成可以防止因在干燥气体下的水分除去而担心摘出的心脏的干燥速度的不平衡以及由此造成的心脏表面的收缩或角质化。
使用的油对脏器是无害的，优选具有可在脏器的表面形成适当厚度的油膜的粘度，典型的是硅油。硅油由有机氧化硅的聚合物构成，在生理学上几乎无害，且是化学惰性的物质。在后面所述的实施例中使用的硅油的动粘度为100mm2/s(摄氏25℃)，且是不挥发性的，一般认为适合于保护以免经过长时间心脏表面过量干燥。一旦在心脏的表面形成油膜，就可以用目视确认在没有油膜时，由干燥产生的心脏表面的裂纹等物理性伤害减轻了。
对于使用的气体，一般可以使用空气，或者O2-CO2混合气体，但对它们没有限定。作为干燥用的气体，优选O2-CO2混合气体。
如后面所述的实施例所示，作为保存用的气体，可以使用含有Xe的气体。由于氙气是不具有极性的惰性气体，所以与周围的水疏水性水合，从而可以抑制水分子的热运动。如果水的构造化提高，分子运动缓慢的话，水的粘度就会上升，而且由于生物体反应通过水进行，所以一般认为如果水的粘度上述的话，细胞的代谢就会受到抑制。除了除去自由水以及在低温下保持之外，如果在保存气体中使用氙气的话，脏器的代谢可进一步受到抑制。
另外，氙气的离解压(摄氏0℃)是1.15个大气压(0.1115MPa)，已知在比较低的加压下，容易制造气体水合物。因而，在使用氙气的场合，在加压下保存脏器比较好。一般认为，在加压环境下，氙气在脏器(包括细胞内和细胞外)内的水相中的溶解度会提高。如果对包围脏器的氙气加压，可推测可以促进脏器内的水的构造化，脏器的代谢将显著受到抑制。
对于使用暴露在气体中的脱水方法，例如放入干燥剂硅胶，并将脱血后的脏器放入保持在冷藏温度下的密闭容器中，经规定时间将脏器暴露在干燥的气体中。应达成的脱水率因脏器的重量而异，是脱水前的脏器总重量的10-50wt％。但是，在同一干燥条件下，由于要达到的脱水率取决于脏器的大小(重量等)，所以优选适用考虑了该情况的干燥条件。
用于脱水的时间因脏器的重量和干燥剂的量而异。例如，如果是大鼠的心脏，则在24～48小时左右，如果是猪的心脏，则在1周左右，对它们没有限定。在各干燥期间后，将脏器保存在惰性介质中比较好。用该脱水方法可以不伤害脏器，从而达成在长期保存中所希望的高的脱水率。由于脏器的损伤少，所以在比较短的时间保存下，再生状态非常好，另外，即使在长时间保存下，再生率也上升了。
在后面所述的实施例4中，使猪脏器在37天后再生成功了。在以往的冷藏保存中这是猪脏器腐败的期间，但在此却确认了脏器的心肌组织再生了。
实施例实施例1(通过血管系统使之脱水的大鼠心脏的保存)按照美国的NIH的实验动物基准，使用人工繁殖的7周龄的Wistar系雄性大鼠(体重300g)作为实验动物。
在大鼠的腹腔内注射给药戊巴比妥钠0.25ml和肝素钠(肝素钠盐)5mg，测定体重后，开始摘出心脏。将摘出的心脏放置在恒温槽中，向大动脉插入导管后，使用溶解有海藻糖117mmol并充入了95％O2-5％CO2混合气体的KH液体，进行Langendorff式的脱血灌注。降低恒温槽的温度并使心脏停止，结束脱血灌注。
测定心脏重量后，通过其灌注装置，向心脏送入上述95％O2-5％CO2混合气体并开始脱水。一面测定心脏的重量并记录水分除去率，一面在从脱水开始进行气体灌注，到约1小时30分钟后停止气体灌注。在仅擦拭去外表面的水分的状态下测定心脏的总重量。
将脱水的心脏浸渍在预先充入了1分钟纯氧的4℃的全氟化碳液体(住友スリ-エム社制，フロリナ-トFC77；C8F17)500ml中，将其装入密闭容器中，保存在冷藏库内。
规定的时间后，从全氟化碳液体取出保存的心脏，向大动脉插入导管，并使用充入了上述混合气体的热的KH液体，试着进行了通过Langendorff式灌注的再生。
·实验1(4小时的保存)R349(Wistar大鼠，5周龄，雄性)2000年9月11日室温24℃15:39体重测定130g15:51开始心脏摘出15:53心脏摘出以及插入导管结束15:53脱血灌注开始恒温槽温度5.0℃，速度1.0～3.8ml/min16:14心脏停止，脱血灌注结束恒温槽温度5.0℃，心脏温度18.2℃16:14心脏重量测定0.663g16:18用混合气体灌注的脱水开始气压0.05kgf/cm2，恒温槽温度2.8℃16:48心脏重量测定0.516g，水分除去率22.2％16:50脱水继续气压0.05kgf/cm2，恒温槽温度1.1℃17:20心脏重量测定0.458g，水分除去率30.9％17:21脱水继续气压0.05kgf/cm2，恒温槽温度1.6℃17:51心脏重量测定0.394g，水分除去率40.6％17:55浸渍在PFC液中，保存4小时0.6℃21:54保存结束，捞出心脏(室温26℃)21:55心脏重量测定0.436g21:55再生灌注开始恒温槽温度34.4℃，速度1.0～3.8ml/min23:40再生灌注结束恒温槽温度33.7℃评价KH灌注开始后4分钟，虽然可以看到心肌的微弱收缩，但心房没有动。心肌继续动直至停止灌注，心脏略微膨胀。
·实验2(8小时的保存)R350(Wistar大鼠，5周龄，雄性)2000年9月12日室温25℃19:10体重测定150g19:20开始心脏摘出19:22心脏摘出以及插入导管结束
19:22脱血灌注开始恒温槽温度5.0℃，速度1.0～3.8ml/min19:37心脏停止，脱血灌注结束恒温槽温度4.6℃，心脏温度15.7℃19:39心脏重量测定0.718g19:43用混合气体灌注的脱水开始气压0.1kgf/cm2，恒温槽温度4.4℃20:13心脏重量测定0.647g，水分除去率9.9％20:15脱水继续气压0.1kgf/cm2，恒温槽温度2.4℃20:35心脏重量测定0.550g，水分除去率23.4％20:48脱水继续气压0.05kgf/cm2，恒温槽温度4.8℃20:18心脏重量测定0.483g，水分除去率32.7％17:55浸渍在PFC液中，保存8小时0.6℃2000年9月13日05:21保存结束，捞出心脏(室温27℃)05:23心脏重量测定0.523g05:24再生灌注开始恒温槽温度33.6℃，速度1.0～3.8ml/min07:25再生灌注结束恒温槽温度36.6℃评价从05:29开始，心肌剧烈收缩，但约10秒钟就停止了。0600的时候，确认了肺动脉周围(右心)附近微弱运动。心脏相当膨胀，在外观上几乎不能确认跳动，但在停止灌注并去掉心脏的KH液时，可以清楚地看出在跳动。
·实验3(16小时的保存)R351(Wistar大鼠，5周龄，雄性)2000年9月13日室温24℃16:22体重测定120g16:28开始心脏摘出16:31心脏摘出以及插入导管结束16:31脱血灌注开始恒温槽温度26.9℃，速度1.0～3.8ml/min16:44心脏停止，脱血灌注结束恒温槽温度4.6℃，心脏温度16.2℃16:45心脏重量测定0.605g16:50用混合气体灌注的脱水开始气压0.1kgf/cm2，恒温槽温度3.3℃
17:20心脏重量测定0.534g，水分除去率11.7％17:23脱水继续气压0.1kgf/cm2，恒温槽温度1.3℃17:53心脏重量测定0.517g，水分除去率14.5％17:55脱水继续气压0.2kgf/cm2，恒温槽温度0.5℃18:25心脏重量测定0.522g，水分除去率13.7％18:30浸渍在PFC液中，保存16小时2.8℃2000年9月14日10:28保存结束，捞出心脏(室温25℃)10:30再生灌注开始恒温槽温度32.9℃，速度1.0～3.8ml/min17:25再生灌注结束恒温槽温度34.5℃评价由于心脏的膨胀剧烈，跳动的状态不明了，因此采取通过心电图的记录。
·实验4大鼠R443(24小时的保存)2001年2月6日16:10心脏摘出16:20脱血灌注开始恒温槽温度26.8℃→7.9℃16:45脱血灌注结束，心脏重量测定0.582g16:45一边从大动脉灌注空气(0.1kgf/cm2)，一边浸渍在PFC液中2001年2月7日16:48从PFC液捞出心脏16:50心脏重量测定0.430g，水分除去率26.1％16:50KH液的灌注开始(恒温槽27.0℃→35.5℃)18:30再生确认，有稳定的跳动再生·实验5大鼠R444(24小时的保存)2001年2月7日18:55给药戊巴比妥钠0.2ml18:57给药肝素钠5mg
18:57体重测定19:00心脏摘出19:03溶解海藻糖的KH液灌注(恒温槽27.6℃→5.5℃)19:23灌注结束，心脏重量测定0.767g19:27在瓶内空气灌注(0.1kgf/cm2，0.8℃)19:57灌注结束，心脏重量测定0.483g，水分除去率34.8％20:00PFC浸渍2001年2月8日20:25从PFC(0.5℃)捞出心脏20:27心脏重量测定20:27KH液灌注开始(恒温槽温度26.9℃→35.4℃)21:27再生确认，跳动数次，停止实施例2(通过血管系统使之脱水的大鼠心脏的保存)实验动物按照美国的NIH实验动物基准，使用繁殖的Wistar大鼠(5周龄，雄性)。在下述的各实验例中，分别各使用5只大鼠。作为惰性介质，使用全氟化碳(PFC)。
·实验1(4小时的保存)给大鼠腹腔内给药戊巴比妥钠0.2ml后，腹腔内给药将肝素钠5mg溶解在0.3ml的生理盐水中的溶液。将大鼠开胸并摘出心脏后，将导管插入到摘出的心脏的大动脉上并用棉线结扎。将插入导管的摘出心脏装配在定流量灌注装置上，以3.2ml/min灌注溶解了117mmol海藻糖的27℃的KH液体。KH液体时常用95％O2-5％CO2的混合气体充气。慢慢降低灌注液的温度并使心脏停止，测定完全停止的心脏的重量后，用导管在0.1kgf/cm2的流压下灌注空气来干燥心脏。测定干燥的心脏的重量后，在时常用混合气体充气下，将其浸渍保存在保冷到4℃的PFC中。4小时后，从保存液取出心脏，将其安装在定流量灌注装置上，以3.2ml/min灌注经常用混合气体充气的27℃的KH液体。摘出的心脏保存后再次开始灌注时，组织细胞如果维持生命的话，就会自动再生，神经活动显现，这一点是已知的。在再生的心脏上安装电极，用描笔式记录器记录表面心电图。
·实验2(16小时的保存)除了将保存时间定为16小时之外，和上述实验例12一样进行。
上述各大鼠的气体灌注时间和水分除去率如下所示。实验1的脱水率1-1 1小时34分，44.1％1-2 2小时37分，32.8％1-3 2小时37分，44.4％1-4 2小时37分，47.5％1-5 3小时7分， 41.1％实验2的脱水率2-1 1小时35分，44.4％2-2 2小时37分，41.2％2-3 1小时3分， 45.8％2-4 3小时12分，41.3％2-5 2小时9分， 41.4％实验例2的结果在实验1和实验2的双方中，所有的试样再生了。在上述实验1和2中可以看到，水分除去所需的时间和水分除去率显著的参差不齐。可认为原因是摘出时的心脏的状态不一定。从插入到大动脉的导管送入的空气从左右冠状动脉口遍布在心肌的毛细血管中，使各心肌细胞干燥，但在毛细血管中，即使很少，但一旦产生有血栓，则空气就不会达到其前面的细胞，时间和除去率就不成比例。总之，令人惊奇的是，在此次实验中，水分除去率40％或以上的大鼠心脏保存4小时和16小时，可以确认100％的再生。
实施例3(暴露在气体中使之脱水的大鼠心脏的保存)在本实施例中，将硅油涂布到从大鼠摘出的心脏上，在干燥气体的加压下，在4℃保存该心脏3天。
在本实验中使用的大鼠是按照美国的NIH的实验动物基准，使用人工繁殖的7周龄的Wistar系雄性大鼠(300g)。从大鼠摘出心脏，进行脱血后，用导管注入心肌保护液(Miotecter持田制药制)2ml，使心脏停止。将硅油(WF·30和光纯制药)涂布到灌注结束的心脏的表面上，将心脏包裹在灭菌纱布(120×120mm)中，放入标准瓶(60ml)中。将放入了心脏的瓶子放置到铺满硅胶的耐压室内并密封。用混合气体(氧气95％，二氧化碳5％)置换室内后，充入混合气体以达到0.2Mpa。处理后，将室保存在摄氏4度的冷藏库中。
根据需要，每24小时打开室，将硅油涂布到摘出的心脏上，进行修整。经过规定时间后，从室内的硅油取出心脏，放在恒压灌注装置中。从充满了用氧95％，二氧化碳5％的混合气体连续充气的KH液的灌注液贮留槽导出的灌注液在恒压(约60mmHg)下送入到大动脉导管中。摘出的心脏在摄氏37度下开始灌注。在灌注中，将心电图记录用电极安装到左心室和大动脉开口部，使用生物放大器(Bioview-ENEC三荣制)连续记录双曲诱导下的心电图·基本的实验顺序如下。
1.将摘出的心脏浸在充满了KH液的培养皿中。
2.在培养皿中将套管插入到大动脉，用棉线固定。
3.将套管安装在Langendorff式恒压灌注装置上，向心脏脱血灌注KH液。在此时的KH液中添加青霉素钾20万u/L。灌注温度约37℃，灌注压力60mmHg。
4.20分钟的灌注后，将约2ml心停止液(心肌保护液)ミオテクタ一灌注到心脏中，促进心脏停止。
5.从灌注装置与套管一起取下心脏，用纱布擦去表面的水分，测定心脏的重量。
6.将心脏轻轻地浸在硅油中，在表面形成硅油层。
7.用纱布慢慢包裹心脏，放入容器中。
8.将放入了心脏的容器收容在耐压室中。在室内的底部铺满硅胶。
9.将室密闭，送入混合气体(95％氧，5％二氧化碳)加压直至达到0.3MPa。根据需要，使用氙气(例如氙气约0.1MPa和混合气0.2MPa)。
10.加压完了后，与室一起放入冷藏库，在2～4℃保存。
11.3天后，从冷藏库取出室后，排出气体。
12.打开室，取出心脏，测定重量。
13.将心脏安装在Langendorff式恒压灌注装置上，开始灌注。例如，灌注温度为37.0℃，灌注压力为60mmHg。
14.如果确认了再生，则测定心脏表面的心电图。
另外，根据试样改变充入到室内的气体，或者改变干燥期间。将干燥期结束的试样浸渍到保存液(硅油·PFC)中，和干燥时一样，在室内加压保存。
应用上述方法被确认再生的实验如下所示。
·实验1保存前的心脏重量1.46g保存开始的日期和时间2001年12月30日21:07使用的气体混合气体0.3Mpa再生开始的日期和时间2002年1月2日16:09再生开始前的心脏重量0.97g(3天除去35％的水分)·实验2保存前的心脏重量1.29g保存开始的日期和时间2001年12月30日21:07使用的气体混合气体0.3Mpa再生开始的日期和时间2002年1月2日17:42再生开始前的心脏重量0.89g(除去35％的水分)·实验3保存前的心脏重量1.37g保存开始的日期和时间2002年1月8日19:20使用的气体混合气体0.2Mpa，还有Xe0.1MPa再生开始的日期和时间2002年1月11日14:34再生开始前的心脏重量0.98g(除去32％的水分)·实验4保存前的心脏重量1.41g保存开始的日期和时间2002年1月8日19:20
使用的气体混合气体0.2Mpa，还有Xe 0.1MPa再生开始的日期和时间2002年1月11日15:42再生开始前的心脏重量1.10g(除去27％的水分)·实验5保存前的心脏重量1.60g保存开始的日期和时间2002年1月9日10:16使用的气体混合气体0.2Mpa，还有Xe0.1MPa再生开始的日期和时间2002年1月12日17:42再生开始前的心脏重量0.94g(除去46％的水分)·实验6保存前的心脏重量1.63g保存开始的日期和时间2002年1月15日19:13使用的气体混合气体0.3Mpa再生开始的日期和时间2002年1月18日13:49再生开始前的心脏重量1.12g(除去31％的水分)·实验7保存前的心脏重量1.41g保存开始的日期和时间2002年1月15日19:13使用的气体混合气体0.3Mpa再生开始的日期和时间2002年1月18日16:02再生开始前的心脏重量1.04g(除去35％的水分)·实验8保存前的心脏重量1.43g保存开始的日期和时间2002年1月8日19:20使用的气体混合气体0.2Mpa，还有Xe0.1MPa再生开始的日期和时间2002年1月11日18:54再生开始前的心脏重量1.07g(除去28％的水分)
图1是在本实验中的心脏表面心电图(21:04测定)·实验9
保存前的心脏重量1.61g保存开始的日期和时间2002年1月9日20:16使用的气体混合气体0.2Mpa，还有Xe0.1MPa再生开始的日期和时间2002年1月12日19:18再生开始前的心脏重量1.00g(除去42％的水分)图2是在本实验中的心脏表面心电图(20:25测定)实施例4(暴露在气体中使之脱水的猪心脏的保存)在该实施例中，将猪心脏暴露在混合气中使之脱水，在该混合气下保存7～8天·实验1(7天)保存前的心脏重量31.9g保存开始的日期2002年2月16日使用的油硅油使用的气体混合气(没有加压)程序用聚氨酯泡沫包裹涂布了油的心脏，并收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室内，进行向混合气的置换。将其放入冷藏库中，保持在2～4℃的冷藏温度下。每天取出脏器，涂布硅油，进行修整。
再生开始的日期2002年2月23日再生开始前的心脏重量25.6g(除去19.7％的水分)图3是保存7天后使之再生的该心脏表面的心电图。
·实验2(8天)保存前的心脏重量31.2g保存开始的日期2002年2月17日使用的油硅油使用的气体混合气(没有加压)程序用聚氨酯泡沫包裹涂布了油的心脏，并收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室内，进行向混合气的置换。将其放入冷藏库中，保持在2～4℃的冷藏温度下。每天取出脏器，涂布硅油，进行修整。
再生开始的日期2002年2月25日再生开始前的心脏重量23.5g(除去24.6％的水分)图4是保存8天后再生的该心脏表面的心电图。
实施例5(暴露在气体中使之脱水的猪心脏的长期保存)在该实验中，应用将猪心脏暴露在气体中的脱水，试验长期保存(37天)。
猪体重5kg，保存前的心脏重量32.6g保存开始的日期和时间2001年12月16日使用的气体混合气(没有加压)程序用聚氨酯泡沫包裹涂布了油的心脏，并收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室内，进行向混合气的置换。将其放入冷藏库中，保持在2～4℃的冷藏温度下。每天取出脏器，再次涂布硅油。从脱水开始至1周后，浸渍到惰性介质(PFC)中，保持在2～4℃的冷藏温度下。
再生开始的日期和时间2002年1月22日从脱水开始37天后，取出脏器，进行用于再生的灌注。
再生开始前的心脏重量25.1g(除去23％的水分)如图5所示，再生开始后(19:04)，心脏表面(温度29.0℃)的心电图显现。从1mV至最大5mV，记录了每分钟8次～40次的脉冲。
权利要求
1.一种哺乳类动物的脏器的保存方法，包括脱水步骤，该步骤从含有生理学上正常水分量的脏器，通过其血管系统，导出该脏器内的水分，除去相对于脱水前的脏器总重量，重量比为约10％或以上的水分，且相对于脱水前的总水分量，残留重量比为约10～约20％或以上的水分，和将该脏器浸渍在惰性介质中，并保持在冷藏温度下的步骤。
2.一种保存方法，包括脱血步骤，该步骤将生理盐水溶液灌注到心脏中，将心脏内的血液置换为生理盐水溶液；脱水步骤，该步骤从脱血的心脏，通过其血管系统导出该脏器内的水分，除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约10～约50％的水分；以及将该心脏浸渍在惰性介质中，并保持在约1～约8℃的冷藏温度下的步骤。
3.一种保存方法，包括脱血步骤，该步骤将生理盐水溶液灌注到心脏中，将心脏内的血液置换为生理盐水溶液；脱水步骤，该步骤从脱血的心脏，通过其血管系统导出该脏器内的水分，除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约25～约60％的水分；以及将该心脏浸渍在惰性介质中，并保持在约1～约8℃的冷藏温度下的步骤。
4.权利要求1～3任一项所述的保存方法，上述脱水步骤包括送入气体作为导出水分的介质。
5.权利要求4所述的保存方法，上述脱水步骤包括向心脏的大动脉灌注气体，通过该气体的流动，从该心脏的血管系统导出水分。
6.权利要求1～3任一项所述的保存方法，上述脱水步骤包括向脏器或者心脏的血管系统送入空气。
7.权利要求1～3任一项所述的保存方法，上述脱水步骤包括向脏器或者心脏的血管系统送入以O2为主要成分的O2-CO2混合气体。
8.权利要求1～3任一项所述的保存方法，上述脱水步骤进一步包括使浸在惰性介质中的该脏器与脱水剂接触。
9.权利要求1或2所述的保存方法，在上述生理盐水溶液中溶解使用海藻糖。
10.权利要求1～3任一项所述的保存方法，在上述惰性介质中使用全氟化碳液体。
11.权利要求1所述的保存方法，上述脏器选自心脏、肝脏、肾脏、胰腺和肺。
13.权利要求1所述的保存方法，上述脏器是猪的心脏。
14.一种哺乳类动物的心脏的保存方法，包括在含有生理学上正常水分量的脏器表面形成油膜的步骤、通过将该心脏暴露在气体中，使该心脏内的水分蒸发到该气体中，来除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约10％或以上的水分的步骤和将该脏器保持在约2～约8℃的冷藏温度下的步骤。
15.一种哺乳类动物的心脏的保存方法，包括向心脏灌注生理盐水溶液，将心脏内的血液置换为生理盐水溶液的脱血步骤、在脱血的心脏的表面形成油膜的步骤、通过将该心脏暴露在气体中，使该心脏内的水分蒸发到该气体中，以除去相对于脱水前的心脏总重量，重量比为约10～约50％的水分的步骤和将该脏器保持在约1～约8℃的冷藏温度下的步骤。
16.权利要求14或15所述的保存方法，进一步包括将除去水分的上述脏器浸渍在惰性介质中，并保持在约1～约8℃的冷藏温度下的步骤。
17.权利要求14或15所述的保存方法，上述脏器选自心脏、肝脏、肾脏、胰腺和肺。
18.权利要求17所述的保存方法，上述脏器是猪的心脏。
全文摘要
本发明涉及哺乳类动物的脏器的保存方法，包括从含有生理学上正常水分量的脏器，通过血管系统导出该脏器内的水分，除去相对于脱水前的脏器总重量，重量比为约10％或以上，优选25％或以上的水分的脱水步骤，和将该脏器浸渍在惰性介质中并保持在冷藏温度下的步骤。
文档编号A01N1/02GK1505474SQ0280888
公开日2004年6月16日 申请日期2002年3月6日 优先权日2001年3月6日
发明者关邦博 申请人:生物库株式会社