专利名称：番茄耐盐性状筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种番茄耐盐性状筛选方法，可用于所有果菜类，如番茄、茄子、辣椒、黄瓜、甜瓜等耐盐新品种培育，侧枝扦插部分内容可用于所有性状的培育，属于农作物育种技术领域。
番茄为严格的自花授粉植物，长期的人工驯化和有性杂交，使其基因背景越来越窄，一些耐逆境基因，如耐盐基因已很难在其栽培种中找到，故近年来国内外许多专家都试图通过基因工程技术和细胞工程技术来培育番茄耐盐新品种，但大都只有获得耐盐植株的报道，育成品种的报道甚少。就其原因，一则因为耐盐性的表达大多受多基因控制；二则研究证明番茄不同的生育时期耐盐性的表达不尽相同，这给耐盐性状的筛选带来不便，从而延长了筛选时间，且降低了筛选的有效性，最终阻碍了耐盐育种的进程。(陈火英等，番茄耐盐性状的离体筛选(英文)，上海交通大学学报(农业科学版)，2002，20(1)，1-6)，(M.Ashraf.Breedingfor salinity tolerance in plants，Critical Reviews in Plant Sciences，1994，13(1)17-42)。
为实现这样的目的，本发明利用在氯化钠NaCl胁迫下番茄芽体的生根情况、子叶愈伤组织的增殖情况、幼苗的生长势、成株期的侧枝扦插的生根情况以及下一世代种子的发芽势，综合评判番茄植株的耐盐性，同时加快番茄耐盐育种的进程。
本发明的技术方案中，各个时期的技术关键包括
①芽体的生根情况将要鉴定材料的种子浸种24小时，饱和漂白粉液消毒20分钟，再在无菌条件下催芽，接着将处于萌动状态的种子播种于1/2的MS(Murashige and Skoog的基本培养基)大量元素培养基中；出苗后10天，将其芽体切下，接种于附加有75mmol/L NaCl的MS培养基中，10天后观察和统计生根情况。
②子叶愈伤组织的增殖量取上述生根快的植株的子叶作为外植体，接种于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培养基中诱导愈伤组织，每15天继代1次，将继代2次的愈伤组织接种于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培养基中，观察愈伤组织的增殖情况，并测定其干重，以重复进行耐盐性的鉴定。
③幼苗生长势将芽体生根快的植株移栽于大棚苗床或育苗钵中。缓苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作为灌溉水源，进行耐盐性的胁迫筛选。
④成株期侧枝扦插的生根情况将上述在盐胁灌溉下生长势强的、叶片盐害症状轻的植株移栽于大棚中，观察农艺性状；取第一花穗下的具4-5片叶子的侧枝，侧枝的基部用100mmol/L的NAA(萘乙酸)处理10分钟，尔后扦插于基质槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培养基作为营养液灌溉，10天后观察和统计侧枝的生根情况。
⑤下一世代种子的发芽势将上述由生根快的侧枝形成的植株定植于大棚或大田中进一步观察该材料的其它农艺性状，并将其相对应植株留一穗果打顶以加快种子的成熟，加快世代进程。将种子在无菌条件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培养基上进行发芽试验，7天后统计发芽势。将发芽势大于50％的材料，进入下一世代的筛选。
与传统筛选技术相比，本发明方法简便，一般常规育种工作者易于掌握；整个系统的耐盐性筛选都在可控条件下，使得筛选结果更加可靠；利用组培室有限的空间进行大量材料的初步筛选；利用侧枝在基质槽进行盐池鉴定，即可以减少工作量，又可做到育种材料的不间断；耐盐植株留一穗果打顶，可使番茄在长江中下游地区的气候条件下繁殖4个世代，大大缩短了育种时间。
本发明选用试验材料为上海交通大学农业与生物学院耐盐番茄育种课题组的育种材料，可分为两组①以拟改良品种“鲜丰”为受体，通过花粉管通道技术分别将野生耐盐的奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716的Total DNA及带有耐盐目的基因HVA1的pBY520质粒作为供体导入到受体的后代材料；②以拟改良品种“鲜丰”为对象，进行体细胞突变体筛选的后代。
研究表明，利用本发明可在1年到1年半的时间内完成番茄变异体的稳定性筛选，而传统的筛选技术则需要2-3年的时间；耐盐性鉴定覆盖了整个种子到种子的过程，避免了盐胁过程中生理适应性的干扰，从而大大提高了选择的有效性；利用本发明在不到3年的时间内已成功获得了7个耐盐的、农艺性状稳定的系统。其中，2个系统耐盐且农艺性状优良，在上海崇明东旺沙新围垦的，盐度达到0.7％-0.8％的大棚中，且用盐度达0.8％海水灌溉(由于崇明岛的海水盐度不稳定，故根据每次取水的实际浓度加上一定量的NaCl复配而成)条件下正常生长，成品率达到80％-100％；而对照“鲜丰”叶片有严重的盐害症状，所结果实脐腐病的发病率达到80％以上，成品率最高达20％。
将24个果实的种子浸种24小时，饱和漂白粉液消毒20分钟，再在无菌条件下催芽，接着将处于萌动状态的种子播种于1/2的MS大量元素培养基中；出苗后10天，将其芽体切下，接种于附加有75mmol/L NaCl的MS培养基中，10天后统计生根情况，并初步断定耐盐植株15株。
取上述15株植株的子叶作为外植体，接种于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培养基中诱导愈伤组织，每15天继代1次，将继代2次的愈伤组织接种于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培养基中，观察愈伤组织的增殖情况，并测定其相对干重，以进一步鉴定材料的耐盐性。
将上述15株植株移栽于大棚苗床中。缓苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作为灌溉水源，进行耐盐性的胁迫筛选。
将上述在盐胁灌溉下生长势强的、叶片盐害症状轻的植株移栽于大棚中，观察农艺性状；取第一花穗下的具4-5片叶子的侧枝，侧枝的基部用100mmol/L的NAA处理10分钟，尔后扦插于基质槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培养基作为营养液灌溉，10天后观察和统计侧枝的生根情况。
将由生根快的9个侧枝形成的植株定植于大棚中进一步观察其它农艺性状，并将其相对应植株(取侧枝的母株)留一穗果打顶以加快种子的成熟，加快世代进程；9个植株单株留种，将9个株系的种子在无菌条件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培养基上进行发芽试验，7天后统计发芽势有5个株系的发芽势达到50％以上。从第3世代开始将材料种植于上海崇明东旺沙新围垦的，盐度达到0.7％-0.8％的大棚中，且用盐度达0.8％海水灌溉进行筛选。
利用本发明，将上述材料连续筛选1.5年(6个世代)获得了一个耐盐、且农艺性状优良的有限生长型番茄新品种。
实施例2将利用体细胞突变体筛选获得的10株耐盐植株移栽于育苗钵中。缓苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作为灌溉水源，进行耐盐性的胁迫筛选。10株均表现耐盐。接着将其移栽于大棚中，只有2株生长正常，并能开花结实。取第一花穗下具4-5片叶子的侧枝，侧枝的基部用100mmol/L的NAA处理10分钟，尔后扦插于基质槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培养基作为营养液灌溉，10天后观察和统计侧枝的生根情况。
将2个侧枝形成的植株定植于大棚中进一步观察该材料的其它农艺性状，并将其相对应植株(取侧枝的母株)留一穗果打顶以加快种子的成熟，加快世代进程；2个植株单株留种，将2个株系的种子在无菌条件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培养基上进行发芽试验，7天后统计发芽势。从第3世代开始将材料种植于上海崇明东旺沙新围垦的，盐度达到0.7％-0.8％的大棚中，且用盐度达0.8％海水灌溉进行筛选。
利用本发明，将上述材料连续筛选1.5年(6个世代)获得了一个耐盐、且农艺性状优良的有限生长型番茄新品种。
权利要求
1.一种番茄耐盐性状筛选方法，其特征在于包括①芽体的生根情况将要鉴定材料的种子浸种24小时，消毒后在无菌条件下催芽，接着将处于萌动状态的种子播种于1/2的MS大量元素培养基中，出苗后10天，将其芽体切下，接种于附加有75mmol/L NaCl的MS培养基中，10天后观察和统计生根情况；②子叶愈伤组织的增殖量取上述生根快的植株的子叶作为外植体，接种于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培养基中诱导愈伤组织，每15天继代1次，将继代2次的愈伤组织接种于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培养基中，观察愈伤组织的增殖情况，并测定其干重，以重复进行耐盐性的鉴定；③幼苗生长势将芽体生根快的植株移栽于大棚苗床或育苗钵中，缓苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作为灌溉水源，进行耐盐性的胁迫筛选；④成株期侧枝扦插的生根情况将上述在盐胁灌溉下生长势强的、叶片盐害症状轻的植株移栽于大棚中，观察农艺性状；取第一花穗下的具4-5片叶子的侧枝，侧枝的基部用100mmol/L的萘乙酸NAA处理10分钟，尔后扦插于基质槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培养基作为营养液灌溉，10天后观察和统计侧枝的生根情况；⑤下一世代种子的发芽势将上述由生根快的侧枝形成的植株定植于大棚或大田中，并将其相对应植株留一穗果打顶，将种子在无菌条件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培养基上进行发芽试验，7天后统计发芽势，将发芽势大于50％的材料，进入下一世代的筛选。
全文摘要
一种番茄耐盐性状筛选方法，利用在氯化钠NaCl胁迫下番茄芽体的生根情况、子叶愈伤组织的增殖情况、幼苗的生长势、成株期的侧枝扦插的生根情况以及下一世代种子的发芽势，综合评判番茄植株的耐盐性，同时加快番茄耐盐育种的进程。本发明方法简便，易于掌握，整个系统的耐盐性筛选都在可控条件下，使得筛选结果更加可靠；利用组培室有限的空间进行大量材料的初步筛选；利用侧枝在基质槽进行盐池鉴定，即可以减少工作量，又可做到育种材料的不间断；耐盐植株留一穗果打顶，可大大缩短育种时间。
文档编号A01H4/00GK1433680SQ03115379
公开日2003年8月6日 申请日期2003年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者陈火英, 庄天明, 刘风荣 申请人:上海交通大学