酰基载体蛋白-dna序列及合成的制作方法

专利名称:酰基载体蛋白-dna序列及合成的制作方法
本申请是1986年7月31日提交的美国专利申请891529号的后续部分。
酰基载体蛋白是于蛋白质可被分离作体外使用，或者可使蛋白于细胞内被转移到叶绿体或与体内修变脂肪酸产生有关之细胞器内的条件下被转录的。本发明所提供的构建物可在种子组织中使用种子特异性启动子表达酰基载体蛋白。
植物为食品原料和食物成品提供了丰富的来源。植物脂肪酸可广泛用于多种工业目的，如作为植物油用于烹调，用作润滑剂以及在醇酸树脂中用作特殊化学品等。大部分植物脂肪酸为18碳原子的，通常只有少数脂肪酸具有16个以下的碳原子。就许多应用目的来说，期望具有8至14个脂肪酸的脂肪酸。为此，在建立生产其中大部分脂肪酸为14或少于14碳原子之植物油的方法上集中了相当大的兴趣。
为达到这一目的，必须改变导致脂肪酸生成並使之伸长为较高级脂肪酸之代谢途径的组成成分。为此，必须能够产生一种或多种脂肪酸代谢链上的成分，並借以改变植物代谢过程。此外，脂肪酸代谢途径中的个别成分还可能具有重要的工业应用价值。
Kuo和Ohlrogge(ArchivesofBiochem.andBiophys.(1984)234290-296)描述了菠菜酰基载体蛋白的一级结构。Ohlrogge和Kuo(J.Biol.Chem.(1985)2608032-8037)报导了在不同组织中有不同表达的酰基载体蛋白的不同异构体。Crouch等人(J.Mol.Appl.Genet.(1983)2273-283)报导了编码napin蛋白之cDNA的合成。
本发明提供了用于表达植物酰基载体蛋白的DNA构建物。特殊构建物是使用在种子成熟期间的植物胚胎中导致表达的转录起始区制成的。可通过改变参予脂肪酸生成之代谢途径的叶绿体或相关细胞器中的组成成分来调节脂肪酸的量和组成。
本发明提供了生产酰基载体蛋白的方法及成分，其中酰基载体蛋白作为一种体外使用的或连同植物种子生成的终产物，可用以修变体内脂肪酸的表达。为此目的，须制备DNA构建物，其中是将编码植物酰基载体蛋白的序列连接到在预期宿主中有表达酰基载体蛋白之功能的转录起始和终止调节区上。
该表达构建物在转录的5′-3′方向上提供了一个转录起始调节区(其为结构性的或调节性的)、一个编码酰基载体蛋白之至少一种功能性蛋白的开放读码，期望包括一个用于转位到叶绿体上作体内使用的转换肽序列，以及一个在适当的宿主中有功能活性的转录终止调节区。
调节区将根据所用宿主而有所不同。当在原核或真核微生物，特别是单细胞宿主内表达时，可使用多种结构性的或可调节的启动子。在这些情况下，制备酰基载体蛋白的主要目的是将此酰基载体蛋白于体外使用。
大多数情况下，构建物将包括在植物中有功能活性的调节区，用以提高酰基载体蛋白的产生，进而借以提高和/或修变脂肪酸组成。
所用的编码序列可得自于天然来源，亦可以是合成的，或者以此两种途径得到的。为从天然来源获得基因，可使用多种植物或细菌作为基因的来源。这些植物包括菠菜、芸苔属植物如油菜或甘蓝型油菜、椰子、棉花、红花、向日葵、萼距花等。用以获得基因的各种方法包括制备基因组成cDNA文库。可基于酰基载体蛋白的氨基酸序列来制备探针。因为不同来源的酰基载体蛋白之间存在有相当程度的免疫交叉反应性，故可利用原核和真核生物的多克隆抗体自某特殊来源中分离酰基载体蛋白，並进一步用于自其它植物来源分离酰基载体蛋白。之后测定整个的或部分的酰基载体蛋白序列，並基于肽序列设计探针。如只测得部分DNA序列，该部分序列即可满足需要，或者移动基因以确保得到整个编码序列。
一旦得到了预期的序列，即可以各种方法操纵之。当序列包括非编码的侧接区时，可使用核酸酶如Bal31切断侧翼区，亦可用限制性核酸内切酶作限制性酶切，或者使用体外诱变、引物修复来进行修饰，或者用其它方法向序列内引入突变或损伤。这样即在天然存在的序列上完成了转换、颠换、缺失和插入。此外，可以合成全部或部分序列，其中可改变一个或多个密码子以提供修变了的氨基酸序列，或者引入一个或多个密码子的突变以提供方便的限制性酶切点或达到其它与构建或表达有关的目的。可进一步使用合成的接合物或连接子，向基因内引入一个或多个方便的限制性酶切点。
酰基载体蛋白可以是任何一种可见于某特殊宿主内的同工酶，如由Ohlrogge和Kuo定名的见于菠菜中的ACP-Ⅰ和ACP-Ⅱ(见上述文献)，或者见于其它植物宿主内的其类似物。
其中特别有用的是菠菜酰基载体蛋白，尤其是具有下列序列的ACP-Ⅰ。
菠菜ACP-Ⅰ
a)cDNA序列b)由DNA序列推测出的氨基酸序列c)经蛋白质序列分析(Kuo和Ohlrogge，1984，上述文献)测得的氨基酸序列＊b)和c)之间存在差异处该有用的序列通常有至少300bp，大多至少约360bp，较好是411bp，这里的整个编码序列包括411个碱基对。此外，可能还有自编码区之5′或3′末端伸展出的5′和3′非编码侧接区，长度可由1至200个或200个以上bp，通常有少于100bp，尤其是少于约10bp天然存在之非编码侧接区的起始密码子的侧翼。
编码酰基载体蛋白或其功能性片段的开放读码在其5′端连接到转录起始调节区。有许多转录起始调节区均可利用，其提供了多种结构或调节功能，如包括结构基因的转录。根据所用宿主的不同，转录起始调节区可包括来自病毒、质粒之结构基因或染色体基因等的区域。前已述及的转录起始区有得自细菌和酵母宿主如大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母者，其包含有β-半乳糖苷酶基因、λ左或右启动子、糖酵解酶启动子等。用于植物的转录起始区是与nopaline、章鱼碱、mannopine、1，3-二磷酸核酮糖羧化酶(大和小亚基)、花椰菜镶嵌病毒的全长启动子、napin、云扁豆蛋白等的结构基因有关的区域。
其中特别有用的是那些在种子生长期间受到调节的启动子，尤其是在胚胎的子叶中合成的启动子。这些调节区包括napin、云扁豆蛋白和大豆球蛋白等基因的调节区。特别有用的调节区是得自芸苔属，特别是油菜和甘蓝型油菜者。调节区一般至少约150bp且不超过约3500bp，大多不超过约2500bp，可望不多于约1000bp。虽然Crouch等人(上述文献)已描述了napin基因，但並没有公开其调节区，亦没有述及调节区在异源基因方面的应用。
转录起始调节区和编码区可以直接连接，其中可存在有方便的限制性切点或者已向两个区域引入了这样的限制性切点，必要时亦可借助于合成的接合物或连接子。许多调节区是作为质粒得到的，其中起始和终止调节区被一多聚连接子所分离，这样即可得有许多适于结构基因插入的限制性切点。这些表达构建物大多是可为微生物宿主利用的。
尽管已分离出了在植物中有功能活性的许多转录起始和终止区(特别是由Ti和Ri质粒上的基因中得到的)，但这些区域並没有达到包含多聚连接子、标志物、复制系统等的真正可用之构建物的水平。再者，对于本发明来说，其主要兴趣在于使表达得以调节，以便在种子中启动转录过程。为此目的，基因如napin基因是有重要意义的。
可使用一筛选napin宿主(如Crouch，1983，上述文献中所述的油菜种子宿主)之基因组文库的探针来获得napin调节区，该探针包含一相邻于结构基因之3′或5′末端或中间编码序列的序列。通过鉴定于严格条件下与探针杂交的片段，即可鉴定出具有napin结构基因的片段。可通过限制性酶切图和DNA序列分析鉴定napin结构基因的潜在的调节序列5′端。可以在各种条件下操作这些序列，以全部或部分地除去编码napin的密码子，留下非编码的5′区而没有或基本上没有napin编码区。在某些情况下，可期望除去相邻于起始密码子的短的非编码区，其一般是少于大约20bp，大多少于约10bp。有关更详细的内容请参见实验部分。
在将酰基载体蛋白结构基因的开放读码与转录起始调节区相连接之后，作为该构建方法的一个结果，功能性转录起始调节区即可被包含或引入其中。终止区可与起始区一样来自同一结构基因即酰基载体蛋白基因，或者方便时可来自不同的结构基因。终止区通常包括终止密码子和编码聚腺苷酸化作用的序列。
可通过引入一用于细胞内转位的单一序列，特别是引入到种子的白色体内或其它植物细胞的叶绿体内以括入基因或对其进行修变。
在组建表达构建物中，通常是将表达构建物或其片段的各种组分插入到能够在细菌宿主如大肠杆菌中复制的常用克隆载体内。文献已描述了大量的已有载体。
每次克隆后，可分离质粒並作进一步的操作，如限制性裂解、插入新的片段、连接、删除、切断、插入、体外诱变或引物修复，以便将各组分裁制成预期的序列。一旦制成构建物，之后即可转移到适当载体内，以进一步依照转化植物细胞的方法操纵之。
正常情况下，表达构建物将包括一个具有为在宿主中表达所必需的调节区，並提供为选择转化细胞所需之标志物的结构基因。该基因可提供对细胞毒性剂如抗生素、重金属、毒素等的抗性，同时为营养缺陷型宿主提供自养及病毒的免疫性等。根据不同宿主种的数目来引入表达构建物或其组分，可使用一个或多个标志物，使不同的选择条件适用于不同的宿主。
本发明所用将构建物引入植物宿主内的方法並不是很严格的。任何能提供有效转化的方法均可使用。这些方法包括使用Ti或Ri质粒、微量注射、电穿孔、脂质体融合等。许多情况下，期望得到在一侧或两侧由T-DNA接界的、特别是有左和右边缘区，更好是有左边缘区的构建物。当构建物使用根癌病土壤杆菌(A.tumefaciens)或发根病土壤杆菌(A.rhizogenes)作转化模型时这一特点是十分有用的，不过在使用其它转化模型时T-DNA边缘区也是有用的。
当将土壤杆菌(Agrobacterium)用于植物细胞转化时，可使用能引入到土壤杆菌内、以与存在于土壤杆菌宿主中的Ti或Ri质粒的T-DNA进行同系重组的载体。含有用于重组之T-DNA的Ti或Ri质粒可以是有防护能力的(能够引起瘿形成)或没有防护能力的(不能引起瘿形成)，只有当vir基因存在于已转化之宿主中时后一种情况才是可允许的。有防护能力的质粒可产生正常植物细胞和瘿的混合体。
在某些使用土壤杆菌作为转化植物细胞之载体的情况下，可将由T-DNA边缘区接界的表达构建物插入到广谱宿主载体内，文献中已对这些广谱宿主载体作了描述。最常用的是pRK2或其衍生物(如见Ditta等，1980，PNASUSA，777347-7351和欧洲专利申请0120515号，这些文献已被列为参考文献)。因已被表达构建物所包括，而且T-DNA贡献一个或多个标志物，这样即充许选择已转化的土壤杆菌和已转化的植物细胞。业已发现了许多可为植物细胞所用的标志物，如抗氯霉素、氨基糖苷及潮霉素等的抗性标志。对于本发明来说，使用何种抗性标志並不重要，可根据特定宿主或构建方法来优选某种标志物。
该表达构建物可为多种活性体植物所利用，特别是用于参予植物油生产的植物。这些植物包括芸苔属，如甘蓝型油菜(napus)和油菜(Campestris)、向日葵、红花、棉花、萼距花属(Cuphea)、大豆和谷物。
使用土壤杆菌转化植物细胞时，可使外植体结合並与已转化的土壤杆菌保温足够时间以使之转化、之后杀死细菌並将植物细胞培养在一适当的选择培养基内。一旦愈创组织形成，即可依照已知方法使用适当的植物激素来促进幼芽形成，並将幼芽移入适于植物再生的生根培养基内。之后使植物生长，长成种子並使种子反复传代並用以分离植物油。
亦可使用DNA序列作为探针，探寻在並非由其中得到基因的宿主中产生的酰基载体蛋白。此外，依照本主题发明所产生的酰基载体蛋白也被来制备检测酰基载体蛋白的方法中所用的相应抗体。亦可将酰基载体蛋白连同叶绿体溶解产物一起使用来提高体外制得之脂肪酸的生产和/或改变脂肪酸组成。还可用酰基载体蛋白研究植物和细菌中脂肪酸生成的机理。
下列实施例旨在进一步阐明本发明，而不是对其加以限制。
实验部分材料和方法克隆载体使用的克隆载体包括pUC载体，即pUC8和pUC9(Vieira和Messing，(1982)Gene19259-268)、pUC18和pUC19(Norrande等，(1983)Gene26101-106;Yanisch-Perron等，(1985)Gene33103-119)，以及用氯霉素抗性基因交换上述pUC质粒的氨苄青霉素抗性作标志物的类似载体(pUC-CAM〔pUC12-Cm，pUC13-Cm〕Buckley，K.，Ph.D.Thesis，U.C.S.D.，CA1985)。如用pUC-CAM的多克隆位点交换pUC18和pUC19载体的多克隆位点以产生出具CAM抗性的pCGN565和pCGN566。还使用了pUC118和pUC119。两者分别是具有在pUC的NdeⅠ位点插入了M13之基因间区(即从5465处的HgiAⅠ位点到5941处的AhaⅢ位点)的pUC18和pUC19(得自于VieiraJ.和Messing.J.，WaksmanInstitute，RutgersUniversity.Rutgers，N.J.)。
材料得自于Bethesda Research Laboratories的末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)、核酸核酸酶H(RNaseH)、大肠杆菌DNA聚合酶、T4激酶和限制性内切酶;得自New England Biolabs的大肠杆菌DNA连接酶;得自Life Sciences有限公司的反向转录酶;得自Amersham公司的同位素及得自Bachem有限公司(Torrance，CA)的Ⅹ-gal。
构建菠菜叶的cDNA文库依照Facciotti等人(Biotechnology(1985)3241-246)所述的方法在4M硫氰酸胍缓冲液内自嫩菠菜叶中提取总RNA.按Maniatis等人(MolecularCloningALaboratoryManual.，ColdSpringHarborLaboratory，New York，1982)所述的方法，将总RNA过Oligo(dT)-纤维素柱层析两次得到poly(A)+RNA。依照Gubler和Hoffman(Gene，1983，25263-269)的方法，经稍加改进在pUC13Cm中构建cDNA文库。在合成第一股cDNA中删除RNasin(如果不完全除去它会干扰第二股cDNA合成)，而且按文献中所述的方法用dCTP接尾载体DNA並用dGTP接尾双股cDNA而不使之倒转。依照Hanahan(J.Mol.Biol.(1983)166557-580)的方法使已退火的cDNA转化到足够的大肠杆菌JM83(Messing，Recombinant DNA Technical Bulletin，NlH Publication NO.79-99，2(1979)NO.243-48)细胞内並散布于含有50ug/ml氯霉素和0.005%X-Gal的LB琼脂平皿上(Miller，Experiments in Molecular Genetics，(1972)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
菠菜ACP-ⅠcDNA的鉴定经与得自各代表200个cDNA克隆之40份储集品的克隆分析(见下述)DNA作Southern吸印(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)和斑点吸印(见下述)杂交，筛选出总共约8000个cDNA克隆。一个与菠菜ACP-Ⅰ之16氨基酸区域至少有66%同源性的5′末端标记的合成寡核苷酸(ACPP4)5′-GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCCACATTGATACCAAACTCCTCCTC-3′互补于一个能编码菠菜ACP-Ⅰ(Kuo和Ohlrogge，Arch.Biochem.Biophys.，(1984)234290-296)之残基49-64，即16氨基酸肽glu-glu-glu-phe-gly-ile-asn-val-asp-glu-asp-lys-ala-gln-asp-ile的DNA序列被用作ACP探针。
按下述方法制备作Southern和斑点吸印杂交的克隆分析DNA将琼脂平皿中的转化体以每10ml培养基10个克隆的分组转移到含50ug/ml氯霉素的LB培养基中。将培养物于37℃震荡孵箱内保温过夜，之后用等体积培养基稀释並使之生长5小时以上。将20份样品的内容混合得到各200个cDNA克隆的储集品。按Birnboim和Doly(NucleicAcidsRes.，(1979)71513-1523)所述的方法自这些细胞中提取DNA。经用苯酚和氯仿提取，之后用乙醇沉淀，将DNA纯化至能够用限制性内切酶消化。将DNA重新悬浮于无菌的蒸馏水中，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切各1ug之40份储集的DNA样品並通过0.7%琼脂糖凝胶作电泳分离。用Southern吸印杂交技术将DNA转移到硝酸纤维素滤膜上。
依照产品说明书推荐的方法，用r-32pdATP和T4激酶标记ACPP4的5′末端。依照Berent等人(BioTechniques(1985)3208-220)的方法，对得自克隆分析DNA之Southern吸印转移的硝酸纤维素滤膜进行杂交(24小时，42℃)並洗涤。将各1ug DNA储集物加于0.5M NaOH中的尼龙膜滤片上，以制备同一组DNA储集物的斑点印迹。将这些印迹与探针在42℃下于50%甲酰胺/1%SDS/1M Nacl中杂交24小时，並于室温下在2×SSC/0.1%SDS(1×SSC＝0.15MNacl;0.015M柠檬酸钠;SDS＝十二烷基磺酸钠)中洗涤。将与ACPP4寡聚探针杂交的得自储集物的DNA转化到JM83细胞内並按上述方法铺板以制得各自分离的转化体。将DNA加于已与ACPP4寡聚探针杂交的硝酸纤维素滤膜上以制备这些个别cDNA克隆的斑点印迹，並使用对储集的DNA样品作Southern吸印分析的同样条件进行分析。
核苷酸序列分析经用限制性内切酶消化分析阳性克隆pCGN1SOL，並制得如下的部分酶切图。
前面的PstⅠ位点被接尾所破坏＊＊具有所示可利用之限制性酶切点的多聚连接子使用限制性酶切、连接、转化和分析(Maniatis等，1982，上述文献)等标准的实验室技术将cDNA再克隆到pUC118和pUC119中。制备单股DNA模板並使用Sanger二脱氧技术(Sanger等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1977)745463-5467)测定DNA序列。序列分析是使用IntelliGenetics有限公司的程序机组完成的。
pCGN1SOL含有一在3′端包括A残基之伸延部分的约700bpcDNA插入片段，该伸延部分代表了mRNA的poly(A)尾部。推测61位上的ATG密码子是编码MET的翻译起始密码子。该密码子是411核苷酸开放读码的起始，其中核苷酸229-471编码一个其氨基酸序列几乎完全与Ohlrogge和Kuo(上述文献)前已公开的ACP-Ⅰ之氨基酸序列相符的蛋白质。在前面列出的序列中指出了两个氨基酸序列之间的差异。除成熟蛋白质外，pCGN1SOL还编码-56残基转换肽序列，其可望是一种核编码的叶绿体蛋白。
Napin启动子的构建pgN1克隆(为一甘蓝型油菜基因组DNA的3.3KbEcoRⅠ片段，其含有一克隆到pUC8中的napin基因;该克隆得自于MartiCrouch，UniversityofIndiana)上有napin基因之ATG起始密码子的298核苷酸上游区。用EcoRⅠ和SstⅠ酶切pgN1DNA並连接到经EcoRⅠ/SstⅠ裂解的pCGN706上。(pCGN706是含有另一napincDNA克隆pN2(Crouch等，1983上述文献)之3′区及聚腺苷酸化序列的XhoⅠ/PstⅠ片段，其中所说的pN2在SalⅠ和PstⅠ位点被克隆到了pCGN566中)。用SalⅠ酶切所得克隆pCGN707並用酶Bal31处理以除去napin基因的某些编码区。用Bal31处理后，用SmaⅠ酶切所得切断了的DNA並重新连接。依照大小选择出克隆中的一个pCGN713，经用EcoRⅠ和BamHⅠ消化将其再克隆到EcoRⅠ/BamHⅠ酶切的pEBL18(Dente等，NucleicAcidsRes.，(1983)111645-1655)和pUC118中，分别得到E418和E4118。经对E418模板作Sanger二脱氧序列分析进一步确定Bal31消化的程度。对启动子区的Bal31删除只扩展到起始密码子的57核苷酸下游区，从而含有napin编码序列的5′末端和5′非编码区的大约300bp。按Zoller和Smith(NucleicAcidsRes.(1982)106487-6500)的方法，使用寡核苷酸引物5′-GATGTTTTGTATGTGGGCCCCTAGGAGATG-3′进行体外诱变，剪裁E4118以删除包含ATG起始密码子之napin的所有编码区域。经两次转化到大肠杆菌菌株JM83(Messing，J.，上述文献)内並用SmaⅠ消化假定的转化株以筛选适当的突变体。所得napin，启动子克隆即pCGN778且含有由pgN1之EcoRⅠ位点到恰在napin之ATG起始密码子前的A核苷酸处的298个核苷酸。经用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切並连接到EcoRⅠ/BamHⅠ消化的pCGN565上而将启动子区再克隆到氯霉素抗性本底材料中，以得到pCGN779c。
napin启动子克隆的延伸pCGN779c只含有潜在之5′调节序列的298个核苷酸。可用见于原始λBnNa克隆上5′-EcoRⅠ位点之上游区的1.8Kb片段延伸napin启动子。将包含napin区域的λBnNa(得自M.Crouch)的～3.5Kb XhoⅠ片段再克隆到SalⅠ酶切的pUC119中，得到pCGN930。使HindⅢ位点接近于5′XhoⅠ位点，以将pCGN930的HindⅢ/EcoRⅠ片段再克隆到HindⅢ/EcoRⅠ酶切的Bluescript+(载体克隆系统，San Diego，CA)中，得到pCGN942。将用EcoRⅠ和PstⅠ酶切的pCGN779c与用EcoRⅠ和PstⅠ酶切的pCGN942相连接，以延伸napin启动子，得到pCGN943。该启动子含有保留在λBnNa上之napin基因原始ATG的～2.1Kb上游序列。
napin暗盒(napinCassettes)使已延伸的napin启动子与napin3′调节区相结合，以制得用于表达种子特异性基因的napin暗盒。所用的napin3′区来自于含有再克隆到EcoRⅠ/SalⅠ酶切的pCGN565中之pgN1的XhoⅠ/EcoRⅠ片段(XhoⅠ位点位于距napin基因的终止密码子18个核苷酸处)的质粒pCGN1924。连接HindⅢ/PstⅠ酶切的pCGN943和pCGN1924，制得napin暗盒pCGN944，其具有用于插入基因的独特的克隆位点SmaⅠ、SalⅠ和PstⅠ。
napin-ACP构建物连接用HindⅢ/BamHⅠ酶切的pCGN1SOL、用HindⅢ和BamHⅠ酶切的pUC8和用BamHⅠ酶切的pUC118，构建成pCGN796。经用BamHⅠ消化並连接到BamHⅠ酶切的pCGN565上，使pCGN796中的ACP基因转移到氯霉素本底中。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切所得到的pCGN1902並连接到EcoRⅠ/SmaⅠ酶切的pUC118上得到pCGN1920。在NcoⅠ位点切断pCGN1902中的ACP基因，用Klenow片段处理进行充填，用SmaⅠ酶切並再连接即形成pCGN1919。如此即除去了来自ACP基因的5′编码序列並重新产生ATG。经用EcoRⅠ消化pCGN1919、在该位点用Klenow片段填充並连接-PstⅠ连接子，便使该ACP侧接以PstⅠ位点。该克隆被称为pCGN945。将pCGN945的ACP基因作为BamHⅠ/PstⅠ片段移到用BamHⅠ和PstⅠ酶切的pUC118上即制得pCGN945a，这样SmaⅠ位点(由pUC118提供的)将是在ACP序列的5′末端，从而有利于克隆到napin暗盒pCGN944中。将用SmaⅠ和PstⅠ酶切的pCGN945a连接到用SmaⅠ和PstⅠ酶切的pCGN944上即产生napinACP暗盒pCGN946。之后通过自HindⅢ位点克隆，将napinACP暗盒转移到双载体pCGN783中，得到pCGN948。
pCGN783的构建pCGN783是一含有根癌病土壤杆菌之左和右T-DNA边缘区(Barker等，PlantMol.Biol.(1983)2335-350)、pPH1JI之庆大霉素抗性基因(Hirsch等，Plasmid(1984)12139-141)、花椰菜镶嵌病毒(CaMV)(Gardner等，NucleicAcidsRes.(1981)92871-2890)之35S启动子、Tn5(Jorgensen等，见下述;Wolff等，出处同上(1985)13355-367)之卡那霉素抗性基因及来自pTiA6(Barker等，(1983)上述文献)转录本7之3′区的双质粒。
为了得到庆大霉素抗性标志，从pPH1JI的3.1KbEcoRⅠ-PstⅠ片段中分离庆大霉素抗性基因並克隆到pUC9中产生pCGN549。用含有庆大霉素抗性基因的HindⅢ-BamHⅠ片段取代pCGN587的HindⅢ-BglⅡ片段产生pCGN594。
按下述方法制备pCGN587将含有APHⅡ(Jorgensen等，Mol.gen.Genet.(1979)17765)之完整结构基因的HindⅢ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira和Messing，Gene(1982)19259)中，因为有一个EcoRⅠ位点直接邻接于SmaⅠ位点，故可将该片段转化到HindⅢ-EcoRⅠ片段中。之后将含有APHⅡ基因之3′部分的PstⅠ-EcoRⅠ片段与一EcoR-BamHⅠ-SalⅠ-PstⅠ连接子结合到pUC7的EcoRⅠ位点(pCGN546W)。因为该构建物並不贡献卡那霉素抗性，故将APHⅡ基因的BglⅡ-PstⅠ片段插入到BamHⅠ-PstⅠ位点(pCGN546X)以得到卡那霉素抗性。这一处理过程重新装配了APHⅡ基因，从而使EcoRⅠ位点接于基因的侧翼区。一个ATG密码子是在带有APHⅡATG起始密码子之读码区的上游並在其外面。将来自APHⅡ之5′末端的Sau3A-PstⅠ片段(该片段没有此过余的ATG)插入到pCGN546W的BamHⅠ-PstⅠ位点，以提供质粒pCGN550，即避开了不需要的ATG密码子。
之后将含有APHⅡ基因的EcoRⅠ片段克隆到pCGN451的独特的EcoRⅠ位点(其含有一适于表达的章鱼碱合成酶暗盒)，以提供pCGN552(IATG)。
pCGN451包括章鱼碱合成酶表达暗盒，该暗盒含有通过EcoRⅠ连接子与pTiA6之章鱼碱合成酶基因的3′非编码区相融合的约1556bp5′非编码区。pTi等同物是如Barker等人(PlantMol.Biol.(1983)2325)所限定之3′区的核苷酸11，207至12，823和5′区的核苷酸13，643至15，208。
按下述方法得到5′区。将一含有编码区之5′未端的小的已再克隆的片段作为BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆到作为质粒pCGN407的pBR322中。编码区中BamHⅠ-EcoRⅠ片段有一个XmnⅠ位点、而pBR322有两个XmnⅠ位点。用XmnⅠ消化pCGN407，用Bal31核酸酶切断並将EcoRⅠ连接子加至该片段上。EcoRⅠ和BamHⅠ消化后，将各片段按大小分级分离，克隆各部分並测定序列。一种情况是除去整个编码区和5′非翻译序列的10bp，脱离5′非转录区被除去，mRNA帽位点和5′非翻译区的16bp(至BamHⅠ位点)是完整的。经在7%丙烯酰胺凝胶上电泳分离得到这一小的片段並洗脱出长约130bp的片段。
将这一按大小分离得到的DNA片段连接到M13mp9中，测定几个克隆的序列並将此序列与章鱼碱合成酶基因的已知序列进行比较。M13构建物被定名为p14，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切其质粒，以提供连接到含有pTiA6(GarfinKel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)之上游5′序列的XhoⅠ至BamHⅠ片段以及含有3′序列之EcoRⅠ至XhoⅠ片段的小片段。
将所得的XhoⅠ片段克隆到pUC8衍生物的XhoⅠ位点中，所得质粒称为pCGN426。该质粒不同于pUC8在于具有用DNA聚合酶Ⅰ填充的单一EcoRⅠ位点，而且当将XhoⅠ连接子插入到pUC8的独特HincⅡ位点时，由于HincⅡ限制性内切酶有核酸酶污染物，故丢失了PstⅠ和HindⅢ位点。所得的质粒pCGN451在5′非编码区(其具有包括T-DNA之右边缘区、mRNA帽位点和5′非翻译序列之16bp的1550bp5′未翻译的序列)和3′区(其包括267编码区、终止密码子、196bp3′未翻译的DNA、polyA位点和1，153bp3′未翻译的序列)之间有一适于插入蛋白编码序列的单一EcoRⅠ位点。pCGN451也提供了右侧T-DNA边缘区。
用EcoRⅠ酶切在适当定向上具有OCS5′和OCS3′的所得质粒pCGN451，並将得自含完整卡那霉素抗性基因之pCGN551的EcoRⅠ片段插入到EcoRⅠ位点，以提供在适当定向上有卡那霉素抗性基因的pCGN552。
这一OCS/KAN基因被用以为反转型双载体pCGN587提供可选择标志。
工程化章鱼碱合成酶启动子暗盒的5′部分包括在bp15208-13644(Barker的序列编号)处始自XhoⅠ的pTiA6DNA，它还含有参予T-DNA转移过程的T-DNA边缘序列(边缘区)。在质粒pCGN587中，来自pCGN552的OCS/KAN基因提供了一个可选择的标志及右侧边缘区。首先将左侧边缘区作为HindⅢ-SmaⅠ片段(pCGN502)(碱基对602-2213)克隆到M13mp9中，並作为KpnⅠ-EcoRⅠ片段再克隆到pCGN565中以提供pCGN580。pCGN565是一基于pUC8-Cm的克隆载体，但保留有pUC18连接子。用BamHⅠ将pCGN580切成线状並用于取代pVCK102(Knauf和Nester，Plasmid(1982)845)的较小BglⅡ片段，制得pCGN585。用得自含有OCS/KAN基因之pCGN552的XhoⅠ片段取代pCGN585的较小SalⅠ片段，得到pCGN587。
用得自pUC18的HindⅢ-BamHⅠ多聚连接子区取代含有5′-OCS-卡那霉素-OCS-3′(OCS是带有5′标示之启动子区和3′终止密码区的章鱼碱合成酶基因，见美国专利申请775，923号，申请日为1985年9月13日)的pCGN594HindⅢ-BamHⅠ区域。
pCGN566含有已插入到pUC13-Cm之EcoRⅠ-HindⅢ位点之pUC18的EcoRⅠ至HindⅢ多聚连接子。将含有ORF1和-2pTiA6之pNW31C-8.29-1(Thomashow等，Cell(1980)19729)的HindⅢ-BglⅡ片段再克隆到pCGN566的HindⅢ-BamHⅠ位点产生pCGN703。
将含有转录本7之3′区(相当于pTiA6(Barker等，(1983)上述文献)的碱基2396-2920)的pCGN703之Sau3A片段再克隆到pUC18的BamHⅠ位点产生pCGN709。用pCGN587的EcoRⅠ-SmaⅠ片段(其含有卡那霉素抗性基因(APH3-Ⅱ))取代pCGN709的EcoRⅠ-SmaⅠ多聚连接子区产生pCGN726。
将pCGN726的EcoRⅠ-SalⅠ片段加上pCGN734的BglⅡ-EcoRⅠ片段之后插入到pUC8-Cm的BamHⅠ-SalⅠ位点中产生pCGN738。经删去900bpEcoRⅠ-EcoRⅠ片段，即由pCGN738得到pCGN726c。
为了构建pCGN167，用AluⅠ消化得到CaMV(Gardner等，(1981)上述文献)的AluⅠ片段(bp7144-7735)並克隆到M13mp7(Messing等，Nucl.AcidRes.(1981)9309-321)的HincⅡ位点，制得C614。用EcoRⅠ酶切C614，产生含有35S启动子的来自C614的EcoRⅠ片段，将其克隆到pUC8(Vieira和Messing等，Gene(1982)19259)的EcoRⅠ位点得到pCGN146。
为了修剪启动子区，用BglⅡ处理並用Bal31切断BglⅡ位点(bp7670)，之后将BglⅡ连接子连接到Bgl31处理的DNA中得到pCGN147。
用BglⅡ酶切pCGN528並插入pCGN147的BamHⅠ-BglⅡ启动子片段中，制得含有启动子区、可选择标志(有两个ATG的KAN)和3′区的pCGN148a。将该片段克隆到pCGN528的BglⅡ位点中，从而使BglⅡ位点紧接于pCGN528的卡那霉素基因的侧翼。
依照下述方法制备用于这一构建物的穿梭载体。用HindⅢ-BamHⅠ酶切含Tn5(其中包含一卡那霉素基因)的质粒(Jorgenson等，Mol.gen.Genet.(1979)17765)，並将含卡那霉素基因的HindⅢ-BamHⅠ片段插入到pACYC184(Chang和Cohen，J.Bacteriol.(1978)1341141-1156)之四环素基因中的HindⅢ-BamHⅠ位点内，制得pCGN525。将用XhoⅠ连接子插入到SmaⅠ位点内修饰的pTiA6(Thomashow等，Cell(1980)19729-739)的BamHⅠ片段19插入到pCGN525的BamHⅠ位点中，制得pCGN526。经用XhoⅠ酶切並再连接以删除pCGN526的XhoⅠ片段，得到pCGN528。
将pMB9KanXXⅠ的BamHⅠ-卡那霉素基因片段克隆到pCGN148a的BamHⅠ位点，得到pCGN149a。
pMB9KanXXⅠ是一种pUC4K变异体(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268)，其具有XhoⅠ位点缺失，但含有来自Tn903的功能性卡那霉素基因，以允许在土壤杆菌中进行有效的选择。
用BglⅡ和SphⅠ酶切pCGN149a。用BamHⅠ和SphⅠ酶切MⅠ(见下述)，並用分离到MⅠ的BamHⅠ-SphⅠ片段取代pCGN149a的这一小的BglⅡ-SphⅠ片段。如此即产生pCGN167，该构建物含有全长CaMV启动子、1ATG-卡那霉素基因、3′未端和细菌的Tn903型卡那霉素基因。MⅠ是来自pCGN546X(见pCGN587的构建)的EcoRⅠ片段，並以一种使1ATG-卡那霉素基因中的PstⅠ位点邻接于M13mp9之多聚连接子区的方式被克隆到M13mp9的EcoRⅠ克隆位点中。
将含有CaMV-35S启动子、1ATG-卡那霉素基因和pTiA6之BamHⅠ-片段19克隆到pUC19的BamHⅠ-HindⅢ位点内，制得pCGN976。将pCGN976的0.7KbHindⅢ-EcoRⅠ片段(35S启动子)和pCGN709的EcoRⅠ-SauⅠ片段(转录本7∶3′)克隆到pCGN566的HindⅢ-SalⅠ位点，制得pCGN766c。
将pCGN766c的0.7KbHindⅢ-EcoRⅠ片段(CaMV-35s启动子)连接到pCGN726c中的1.5KbEcoRⅠ-SalⅠ片段(1ATG-KAN3′区)上，插入到pUC119的HindⅢ-SalⅠ位点产生pCGN778。用含有CaMV-35S启动子和1ATG-KAN-3′区之pCGN778的2.2Kb区即HindⅢ-SalⅠ片段取代pCGN739的HindⅢ-SalⅠ连接子区，产生pCGN783。
通过转化作用将pCGN948引入根癌病土壤杆菌EHA101(Hood等，J.Bacteriol.(1986)1681291-1301)内。将2mlEHA101的培养物在MG/L液体培养基中于30℃保温过夜。取0.5ml接种于100mlMG/L液体培养基(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732-743)中，並使之在振荡孵箱中于30°生长5小时。于7K离心沉淀细胞，重新悬于1mlMG/L液体培养基中並置于冰上。将大约1μgpCGN948DNA放入已加了200μlEHA101悬液的100μlMG/L液体培养基中;将含有DNA-细胞混合物的试管立即放入干冰/乙醇浴中5分钟，在37℃水浴中将试管内容快速融溶5分钟，之后加入1ml新鲜MG/L培养基並于30℃振荡2小时。离心收集细胞沉淀物並分散于含有100mg/L庆大霉素的MG/L平皿(1.5%琼脂)上。自单个的庆大霉素抗性菌落分离质粒DNA，重新转化到大肠杆菌内，並通过限制性内切酶定性分析以确证卡那霉素抗性EHA101含有pCGN948的完整拷贝。收集单个菌落並通过在含有100mg/L庆大霉素的平皿上作两次以上划线而纯化之。
将甘蓝型油菜(Wester变种)的种子在95%乙醇中浸泡4分钟。浸于每100ml无菌溶液含50μl“Tween20”表面活性剂的1%次氯酸钠溶液中灭菌。浸泡45分钟后，用无菌蒸馏水将种子洗涤4次。将其植于宽7Cm、长7Cm、高10Cm，含50ml MS(Murashige最小量有机物培养基，Gibco)的无菌塑料盒(Magenta)内，其中MS的浓度为10/10(10/10th)，加有吡多素(50μg/L)、烟酸(50μg/L)、甘氨酸(200μg/L)，並用0.6%琼脂固化。使种子于22℃在16小时-8小时光-暗循环(光强度约为65μEm-2s-1)条件下发芽並生长。5天后于无菌操作下取出籽苗，切掉下胚轴并切成长约4mm的碎片。将下胚轴碎片放在饲养平皿上，或者在固化的B50/1/1或B50/1/0培养基上之滤纸的顶上而没有饲养层。B50/1/0培养基含有B5盐和维生素(Gamborg，Miller和Ojima，Experimental Cell Res.(1958)50151-158)、3%蔗糖、2，4-二氯苯氧基乙酸(1.0mg/L)，pH调到5.8，且培养基是用0.6%Phytagar固化的;B50/1/1除含有上述成分外，另外还加有1.0mg/L激动素。经在B50/1/0或B50/1/1培养基上吸移1.0ml静止期烟草悬浮培养物(按Fillatti等人，Mol.gen.Genet.(1987)206192-199中所述方法维持的)将饲养皿预先制备24小时。切下下胚轴碎片並在作土壤杆菌处理之前于饲养皿上放置24小时。
于30℃在MG/L液体培养基上孵育土壤杆菌的单个菌落，制备根癌病土壤杆菌(菌株EHA101×948)。16小时后收获细菌並在MG/L液体培养基中制成每毫升108细菌的细菌悬液。将下胚轴碎片放入土壤杆菌悬液内並使之静置30-60分钟，以使细菌接种到下胚轴碎片上，之后移出並转移到含有B50/1/1或0/1/0培养基(0/1/1是指1mg/L2，4-二氯苯氧基乙酸和1mg/L激动素，而0/1/0是指没有激动素)之培养皿内。于22℃低光照下温育之。细菌与下胚轴碎片共保温24-48小时。移去下胚轴碎片並放在含500mg/L羧苄青霉素(有时是加浓度为10、25或50mg/L的硫酸卡那霉素)的B5 0/1/1或0/1/0培养基上，于22℃连续光照(光强度约65μEm-2s-1)下温育7天。将碎片转移到含1%蔗糖、3mg/L苄氨基-嘌呤和1mg/L玉米素的B5盐培养基内，该培养基添加有500mg/L羧苄青霉素、10、25或50mg/L硫酸卡那霉素，並用0.6%Phytagar(Gibco)固化之。此后，每两周为外植体换一次新鲜培养基。
一个月后即由在含卡那霉素之培养培上选择的绿色愈创组织长出绿色嫩芽。幼苗继续发育3个月。当其至少有1Cm长时，由愈创组织上切掉嫩芽並置于含1%蔗糖、不加生长物质、含300mg/L羧苄青霉素、并用0.6%Phytagar固化了的B5培养基上。使幼苗继续生长並摘取几片叶试验新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)活性。将得有NPTⅡ活性阳性结果的幼苗放在装有含1%蔗糖、2mg/L吲哚丁酸、20mg/L羧苄青霉素，並用0.6%Phytagar固化了的B50/1/1培养基的Magenta盒子内。几周后幼苗长出根並移到土壤中。该植物在生长室(growth Chamber)内，于22℃在16-8小时光-暗循环(光强度220μEm-2s-1)条件下生长並于几周后移入温室内。
Southern吸印分析资料试验了自含pCGN948之根癌病土壤杆菌EHA101与甘蓝型油菜下胚轴之混合细胞培养所再生的甘蓝型油菜植物的适当整合及菠菜叶ACP基因的胚胎特异性表达。Southern分析是依照Dellaporta等人(plant Mol.Biol.Rep.(1983)119-21)的方法，使用由再生之植物的叶子分离的DNA进行的，並通过在CsCl梯度中成带而一次离心纯化的。用限制性内切酶EcoRⅠ切断DNA(10μg)，在0.7%琼脂糖凝胶上电泳並吸印转移到硝酸纤维素滤膜上(见Maniatis等(1982)上述文献)。用含有1.8Kb菠菜ACP序列的pCGN945DNA，或用自含有32p-dCTP标记(按制造商推荐的缺口翻译方法，使用BRL缺口翻译试剂盒〔Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD.〕完成这一标记)之napin 5′序列的pCGN936c(其为将pCGN930的HindⅢ/EcoRⅠ片段转移到pCGN566中制得的)分离的EcoRⅠ/HindⅢ片段探查印迹。将印迹于42℃在50%甲酰胺、10×Denhardt氏试剂、5×SSC、0.1%SDS、5mMEDTA、100μg/ml牛胸腺DNA及10%硫酸葡聚糖(只用于杂交)中预杂交和杂交(各试剂已在Maniatis等(1982)上述文献中述及)。在1×SSC、0.1%SDS中洗30分钟並在0.1×SSC、0.1%SDS中于55℃洗两次。
放射自显影结果表明有两条大约3.3和3.2Kb的带杂交到得自四株植物之DNA的EcoRⅠ消化产物中，因为3.3和3.2KbEcoRⅠ片段是存在于pCGN948的T-DNA区内，所以当用ACP基因(pCGN945)探查时，即判定了菠菜叶ACP构建物在植物基因组中的适当整合。用napin5′序列探查时，正如由测得的植物DNA-构建物DNA边缘区片段之序列的序数所确定的，基因构建物存在于不同植物之单一或多个座位中。
Northern吸印分析资料经Northern吸印分析法检测自napin启动子整合之菠菜叶ACP基因的表达，结果表明在已转化植物之一的种子中而不是叶子中含有构建物DNA。开花后21天由转化的种子收集发育中的种子。自种子内切除胚胎並冷冻于液氮中。按Crouch等人(1983，上述文献)的方法由已转化之植物的种子胚胎和叶子中分离总RNA，按已知方法(Shewmaker等，Virology(1985)140281-288)在含甲醛的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并吸印到硝酸纤维素滤膜上(Thomas，Proc.Natl.AcadSciUSA(1980)775201-5205)。按上述方法对印迹预杂交、杂交並洗涤。该探针为一自pCGN945(只含有以缺口翻译法标记的菠菜叶ACP序列)分离的PstⅠ/BamHⅠ片段。在已转化之植物的胚胎材料中而不是叶子材料中检测到～0.8KbRNA带，这就证明菠菜叶ACP基因的种子特异性表达。
虽然在ACP部分是大肠杆菌ACP时，亦显示较高等植物脂肪酸生物合成基因可识别酰基-ACP底物，但不同来源的不同形式的ACP仍有可能影响体内脂肪酸合成的效率和/或终产物。例如，菠菜(Ohlrogge与Kuo，Biol.Chem.(1985)2608032-8037)和大麦(Hoj与Svendsen，Carlsberg.Res.Commun.(1984)49483-492)即含有不止一种形式的ACP。为了力求使用不同形式的ACP提高油料种子作油的价值，故分离並定性了见于油料种子作物芜菁油菜(BrassicaCampestris)中之ACP基因的cDNA拷贝。
以下是使用得自油菜而不是甘蓝型油菜的napin启动子将ACP基因整合到嵌合基因(Chimericgene)内的方法。
自油菜(BrassicaCampestris)变种“R-500”(芜菁油菜的一种自身兼容性变种)收集未成熟的种子。在相当于大约开花后14至28天时收集整个种子。依照上述分离菠菜ACPcDNA克隆的方法，分离RNA並制备cDNA库。为了探查cDNA文库，用380A型AppliedBiosystemsDNA合成仪，依照厂商推荐的方法合成寡核苷酸(5′)-ACTTTCTCAACTGTCTCTGGTTTAGCAGC-(3′)。该合成的DNA分子以低严格程度杂交到编码氨基酸序列(ala-ala-lys-pro-glu-thr-val-glu-lys-val)的DNA或RNA序列上。据报导，自甘蓝型油菜(Brassicanapus)的种子分离的ACP(Slabas等，7thInternationalSymposiumoftheStructureandFunctionofPlantLipids，UniversityofCalifornia，Davis，CA，PlenumPress，N.Y.1987)与来自油菜(B.Campestris)种子之ACP的氨基酸序列是高度同源的。使用菌落杂交技术(Taub和Thompson，Anal.Biochem.(1982)126222-230)及相当于Wood等人(Proc.Natl.Acad.Sci(1985)821585-1588)所述之杂交条件下分析大约2200个不同的cDNA克隆。对两个显示与寡核苷酸探针产生明显杂交之cDNA克隆的DNA序列分析结果表明，其中一个克隆，定名为pCGNIBcs，其所编码的氨基酸序列与前述得自甘蓝型油菜之ACP蛋白的氨基酸序列(Slabas等，上述文献)具有显著的同源性(相类性)，故证明其为编码ACP-前体蛋白的克隆。pCGN1Bcs(亦称为AGB1)的DNA序列如下所示
为了使油菜(BrassicaCampestris)种子ACP在转换基因之甘蓝型油菜(B.napus)得以高水平的胚胎特异性表达，按前述制备pCGN946的方法使用编码菠菜ACP的DNA序列，制成一相似于胚胎特异性嵌合基因的嵌合型基因。将pCGN1BcsACP编码区装配到存在于pCGN1803(见下述)中的油菜napin型启动子元件内。
油菜(B.Campestris)napin启动子暗盒的构建使用已建立的方法(Maniatis等，(1982)上述文献)在λ载体Charon35中制得油菜DNA的BglⅡ部分的基因组文库。经放大之文库的滴度为～1.2×109个噬菌体/ml。使40万个重组噬菌体于37℃经20分钟吸附于DH1大肠杆菌细胞(Hanahan D.，J.Mol.Biol.(1983)166557)后，于NZY+10mM MgSO4+0.9%琼脂糖中以每个9×9吋平皿105个噬菌体的密度在NZY平皿(NZYM如Maniatis等人(1982)在上述文献中所述)铺板。平皿于37℃保温～13小时，于4℃冷却2.5小时，並通过在平皿上铺敷预切割的滤膜约1分钟，並剥脱之，以使噬菌体吸附到基因滤网附加物(Gene Screen Plus)(New England Nuclear)上。使滤膜在1.5M Nacl、0.5M NaOH上漂浮1分钟;在1.5M Nacl、0.5MTris-Hcl(pH8.0)中中和2分钟，並在2×SSC中漂浮3分钟以固定已吸附的噬菌体DNA。将滤膜风干直到稍为潮湿，按前述Southern吸印分析的方法，于42℃进行预杂交和杂交。使用cDNA克隆BE5的XhoⅠ/SalⅠ片段(该片段是使用探针pN1(Crouch等，1983，上述文献)自上述油菜(B.Campestris)种子cDNA文库中分离的)，探查滤膜上含napin的克隆。有三个噬斑杂交在成对的滤膜上，並按前已述及的方法(Maniatis等(1982)上述文献)纯化噬斑。
以下是BE5CDNA序列。
BE5CDNA长度＝734
制作其中一个定名为λCGN1-2之克隆的限制性酶切图(基因图)，napin基因被定位到与2.7KbXhoⅠ和2.1KbSalⅠ交搭的两个限制性片段上。将这两个片段由λCGN1-2DNA再克隆到pCGN789(为一相同于pUC119的pUC基载体，其中正常多聚连接子被合成的连接子-5′GGAATTCGTCGACAGATCTCTGCAGCTCGAGGGATCCAAGCTT3′-〔其代表多聚连接子EcoRⅠ、SalⅠ、BglⅠ、PstⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ〕所取代)中。通过序列分析，进一步证实此亚克隆即napin。测定了整个编码区以及伸延之5′上游和3′下游序列。
λCGN1-2NCG-186长度＝4325线形序列
λCGN1-2napin基因为编码相对应于BE5cDNA的mRNA者，经测定证明它们的核苷酸序列是准确匹配的。
按照构建pCGN944的相似方法，自λCGN1-2napin基因的5′末端和3′末端构建表达暗盒。经用SalⅠ酶切並再连接删除pCGN940的大部分napin编码区，以产生pCGN1800。使用合成的寡核苷酸5′-GCTTGTTCGCCATGGATACTTGTGTATGTTC-3′，将得自pCGN1800的单股DNA用于体外诱变反应(Adelman等，DNA(1983)2183-193)。该寡核苷酸在napin基因的启动子区与ATG起始密码子的连接处插入了一个EcoRⅠ和NcoⅠ限制性酶切位点。通过与用于诱变的寡核苷酸杂交以鉴定出一适用的突变体，分析其核苷酸序列並定名为pCGN1801。
经用EcoRⅠ部分消化並连接到用EcoRⅠ切断的pCGN786(为一pCGN566氯霉素抗性基载体，其中以上述合成的连接子代替正常多聚连接子)上以再克隆一得自pCGN1801的1.7Kb启动子片段，再用DNA聚合酶ⅠKlenow片段填成平头，产生pCGN1802。经连接于用XhoⅠ和HindⅢ酶切的pCGN941将来自λCGN1-2napin基因的3′序列加到XhoⅠ/HindⅢ酶切的pCGN1802上从而完成暗盒的构建。所得到的表达暗盒，即pCGN1803含有1.725Kbnapin启动子序列以及1.265Kbnapin3′序列，其间具有独特的克隆位点SalⅠ、BglⅡ、PstⅠ和XhoⅠ。
用XhoⅠ和EcoRⅠ双重切断来自pCGN1Bcs的ACP-前体编码区並连接到预先用SalⅠ和EcoRⅠ酶切的克隆载体pUC18上。将已连接的DNA转化到适当的大肠杆菌宿主中，並使用pUC载体的青霉素抗性、兰-白筛选系统(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268)筛选即产生含有一位于ACP前体编码区终止密码子下游之唯一Dra3位点的质粒。用Dra3消化之后与PstⅠ连接子连接产生一个其中编码区作为BglⅡ至PstⅠ片段被整齐地切断的质粒，其中所说的片段被克隆到pCGN1803的PstⅠ和BglⅡ位点中，且该ACP前体编码区至pCGN1803编码的胚胎特异性表达信息之napin启动子和终止子有着适宜的定向。之后将所得的嵌合基因引入双载体中並转移到土壤杆菌内，以使用上述适于pCGN946中菠菜ACP嵌合基因的同样条件与甘蓝型油菜下胚轴碎片共培养。
根据本主题发明，提供了编码功能性酰基载体蛋白特别是植物酰基载体蛋白的序列，其可作为探针用于检测酰基载体蛋白基因的存在、自植物和细菌材料中筛选基因组或cDNA文库、以及用于某些分析法中以检测酰基载体蛋白基因的存在等。此外，编码序列可被用于制备表达构建物，编码序列与转录和翻译起始及终止调节区结合用以在适当宿主(即调节区在其中是有功能活性的)中完成表达。本发明特别涉及到使用ACP编码序列连同在植物中有功能活性的、特别是处于调节下的转录起始区，以实现在种子中的表达。以这种方法可提高种子油的生产並适于调节其脂肪酸组成。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请体现了本发明所属领域内熟练技术人员的技术水平。列为本文参考文献的所有出版物和专利申请与特别指出的各个出版物或专利申请有着同样的参考意义。
虽然为了清楚理解本发明之目的，前面已通过阐述和实施例较为详细地描述了发明的内容，但应明确指出的是，在本发明待批权利要求
的范围内可以实践某些改动或改进。
权利要求
1.编码植物酰基载体蛋白的cDNA序列。
2.根据权利要求
1的cDNA序列，其中所说的植物是菠菜。
3.根据权利要求
1的cDNA序列，其中所说的植物是芸苔属植物。
4.根据权利要求
3的cDNA序列，其中所说的芸苔属植物是油菜。
5.根据权利要求
3的cDNA序列，其中所说的芸苔属植物是甘蓝型油菜。
6.包含编码植物酰基载体蛋白之开放读码的DNA构建物，所说的开放读码结合于在细胞宿主中有功能活性的转录和翻译起始及终止调节区並在其调节控制之下，其中至少有一种所说的调节区不同于所说开放读码的野生型区。
7.根据权利要求
6的DNA构建物，其中所说的开放读码编码菠菜或芸苔属植物酰基载体蛋白。
8.根据权利要求
6的DNA构建物，其中所说的调节区是在植物宿主中有功能活性的。
9.根据权利要求
8的DNA构建物，其中所说的转录起始区是在细胞分化期间被调节的。
10.根据权利要求
9的DNA构建物，其中所说的调节适于调节发育中的胚胎内的转录过程。
11.根据权利要求
10的DNA构建物，其中所说的转录起始调节区是napin调节区。
12.包含根据权利要求
6至11中任一项之DNA构建物的Ti或Ri质粒。
13.包含根据权利要求
6至11中任一项之DNA构建物的植物细胞。
14.根据权利要求
13的植物细胞，其中所说的植物细胞是胚胎细胞及种子的一部分。
15.根据权利要求
14的植物细胞，其中所说的植物是芸苔属植物。
16.一种提高植物种子油生成的方法，其包括，使植物由小植物成长生出种子，其中所说的植物的细胞内含有根据权利要求
8的构建物，收获所得到的提高了植物油含量的种子。
17.根据权利要求
16的方法，其中所说的植物是芸苔属植物。
18.根据权利要求
16或17中任一项的方法，其中所说的转录起始调节区是napin区。
专利摘要
本发明提供了编码酰基载体蛋白的DNA序列，该序列可用于生产作为终产物的酰基载体蛋白或在植物种子中提高种子油产量。还提供了被调节的启动子，其基本上可限定酰基载体蛋白在种子组织中的表达。
文档编号C07K14/415GK87106119SQ87106119
公开日1988年4月27日 申请日期1987年7月31日
发明者让·C·克里, 维·C·克瑙夫 申请人:加利福尼亚基因公司