种子特异性转录调节的制作方法

专利名称:种子特异性转录调节的制作方法
为种子特异性转录提供植物材料的遗传修饰。可以调节内源性产品的生产或提供新的生产能力。
在遗传修变中的主要重点已经对准原核生物细胞或哺乳动物细胞。业已证明，由于种种原因，植物细胞比原核生物细胞更难于进行遗传操作。其部分原因是由于其包括了不同的目的，迄今大部分植物修变已经针对改变整个植物或活体植物的特定部分，而不同于改变培养的细胞。
从多方面的应用出发，人们期望能提供在植物的特殊部分或植物生长周期的特定时间进行转录。为此目的，目前已将注意力集中在修变某些内源性植物产物，而这些产物的转录或表达是以一种有利的方式被调节的。在鉴定这类产品时，首先必须寻找那些出现于细胞生长周期的特定时间或出现于特定植物部分的产物，证明其不存在于其它时间或其它部分，确定与该产物相联系的核苷酸序列，之后鉴定植物基因组中的序列，以得到与转录相关的5′非翻译的序列。为此必须首先鉴定特定序列，之后确证其为正确序列并分离预期的转录调节区域。之后则须制备适当的构建物，进而证明该构建物是可以以预期的方式发挥效能的。
鉴定这样的序列是一个富于挑战性的课题，其主要困难是在于测定易于出现错误而且不易确定。然而，现已更多地注意到能够遗传修变植物，为此付出大量的研究经费并在鉴定转录序列和对其进行遗传操作以确定其实用性方面作了大量工作。
相关文献
Crouch等人(MolecularFormandFunetionofthePlantGenome，eds、vanVloten-Doting，GrootandHall，PlenumPublishingCorp.1985，pp555～566)、Crouch和Sussex(Planta(1981)15364～74)、Crouch等人(J.Mol.Appl.Genet.(1983)2273～283)以及Simon等人(PlantMolecularBiology(1985)5191～201)描述了甘蓝型油菜(Brassicanapus)储存蛋白的各个方面。Beachy等人(EMBOJ.(1985)43047～3053)、Sengupta-Gopalan等人(Proc，Natl.Acad.Sci.USA(1985)823320～3324)、Greenwood和Chrispeels(PlantPhysiol(1985)7965～71和Chen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)838560～8564)描述了有关种子储存蛋白和遗传操作的研究。Eckes等人(Mol.Gen.Genet.(1986)20514～22)和Fluhr等人(Science(1986)2321106～1112)描述了对光诱导的植物基因的遗传操作。
本发明提供的DNA构建物可用于操纵植物细胞，以使之为产生种子特异性转录提供保证。特别是，将储存蛋白转录区域连接于野生型基因以外的片段上并引入植物基因组内，进而提供种子特异性转录。该构建物提供了对内源性产物的调节以及异源性产物的产生。
提供新的DNA构建物，可用于对种子转录的修变，特别是种子成熟期间胚胎内的转录的修变。该DNA构建物包含一与种子生成有关的，特别是与胚胎形成及种子成熟有关的调节的转录起始区。其中特别有用的是与储存蛋白，如napin，cruciferin，β-conglycinin和云扁豆蛋白等有关的转录起始区。可由任何方便易得的宿主，特别是芸苔属(Brassica)，例如甘蓝型油菜(napus)或油菜(Campestris)，大豆(Glycinemax)，菜豆(PhaseolusVulgaris)，玉米(Zeamays)，棉花(GossypiumSP.)，红花(Carthamustinctorius)，蕃茄(Lycopersicanesculentum)和萼距花属(Cuphea)等植物宿主得到转录起始区。
在种子特异性区域的下游并处于种子特异性区域的转录起始调节下的是一个有用序列，该序列将可以提供通过调节内源性产物，依据其其量，相对分布等以改变种子的表型，或者通过产生外源性表达产物为种子提供新的功能和产物。该DNA构建物也将提供一终止区，进而提供可向其中引入某一基因的表达暗盒(expressioncassette)。通过具有一个或多个限制性位点连接子或多聚连接子，可以方便地提供在转录之方向上分离的转录起始区和终止区，以使基因的插入处于调节区的转录调节下。连接子通常有1至10个，较好是大约有1至8个，最好是2至6个限制性位点。连接子一般为不足100bp，常常少于60bp，而通常至少为大约5bp。
转录起始区可以是宿主所固有的或同源于宿主的，或者是外来的或异源于宿主的。所谓外来的是指该转录起始区并不见于野生型宿主，而是向其中引入了转录起始区。
特别有用的转录起始区是与甘蓝型油菜(Brassicanapus)或油菜(B.Campestris)napin基因，酰基载体蛋白相关联的转录起始区，这些基因自大约第7至40天在种子中表达，特别在大约第10天至20天具有最大表达，此时被表达的基因并不见于叶子中，而在种子中大量见到已表达的产物。
转录暗盒包括呈5′-3′的转录方向的转录和翻译起始区，有用的序列以及在植物中有功能活性的转录和翻译终止区。DNA序列可具有任何编码有用肽如一种酶的开放读码，或一个互补于基因组序列的序列，该基因组序列可以是一个开放读码，一个内含子，一个非编码的前导序列，或任何其它序列，其中互补序列可抑制转录、信使RNA加工(如裂接)或翻译。此有用的DNA序列可以是合成的，天然衍生的或以此两种方式结合得到的。根据此有用DNA序列的性质，可望使用植物优选的密码子，以合成该序列。植物优选的密码子可根据在特殊有用植物品种中以最大量表达的蛋白中有最高频率的密码子来确定。
在制备转录暗盒中，可以操作各种DNA片段，以便提供在适当方向上的，并且如果顺利且处于适当读码中的DNA序列。为此目的，可使用接合物或连接子连接该DNA片段，或使用其它操作法以提供方便的限制性位点，除去多余的DNA或限制性切点等。为此，可以使用体外诱变、引物修复，限制，退火，切除，连接等方法，其中可包括插入，缺失或置换(如转换和颠换)。
所用的终止区应是便于使用的，因为终止区似乎是相对可互变的。终止区可以是连同转录起始区固有的，可以是有用DNA序列固有的，或者是可以由其它来源得到的。常用的终止区是由根癌病土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒可得到，如章鱼碱合成酶和nopaline合成酶终止区。
借助于适当的遗传操作，如限制性切断，切掉伸长部分或充填悬突部分，以制成平头，连接上连接子或类似物，以提供用于接合和连接的片段的互补末端。
在完成各步骤中，可使用克隆方法以扩增DNA的量和允许分离该DNA，以确保以适当方式进行操作。有多种克隆载体均可利用，所用的克隆载体包含一种在大肠杆菌中有功能的复制系统以及一个可用于选择已转化之细胞的标志。作为举例的载体包括PBR332，puc系列，M13mp系列，PACYC184等。从而可将序列在适当的限制性位点插入载体，用所得的质粒转化大肠杆菌宿主，使该大肠杆菌生长于适当营养培养基中，收获、并溶解细胞，从中回收质粒。分析可以包括序列分析，限制性酶切分析，电泳或类似的分析。每次处理后，将被用于最终构建物中的DNA序列可得以限制并连接于下一个序列，而其中每一部分构建物则可在相同或不同的质粒中克隆。
除转录构建物外，根据转录构建物引入植物中的方式不同，尚需要其它一些DNA序列。例如，当使用Ti或Ri质粒进行植物细胞转化时，如下所述，至少须将Ti和Ri质粒之T-DNA的右侧边缘序列，更多是右侧和左侧边缘序列作为侧接区，连接到转录构建物上。业已就T-DNA在植物细胞的转化方面的应用作了广泛的研究，并已在欧洲专利申请(EPA)120，516号、Hoekema(TheBinaryPlantVectorSystemOffsetdrukkerijKantersB.V.Alblasserdam，1985，ChapterV)和Fraley等人(Crit.Rev.PlantSci.，41-46)以及An等人(EMBOJ.(1985)4277～284)的文献中作了充分的描述。
另外，为了提高向植物基因组内的整合作用，可以将易位子的末端重复序列用作与易位酶相联系的边缘区序列。在这种情况下，易位酶的表达将是可诱导的，或者易位酶是被失活的，这样，一旦转录构建物被整合到基因组内，它便是相对稳定地整合了的，并且可避免跳跃现象。
转录构建物正常是与可用于在植物细胞中进行选择的标志相连接的。标志物可以是对生物杀伤药剂，特别是抗生素如卡那霉素，G418，博来霉素，潮霉素，氯霉素等抗生素有抗性的。所用的特定标志物应是可与缺乏该DNA的细胞相比较，以选择那些已转化了的细胞。
可使用多种不同的技术，将DNA引入植物细胞宿主内。这些技术包括使用根癌病土壤杆菌或发根病土壤杆菌(A.Rhizogenes)作转化剂用Ti-DNA转化，原生质体融合，注射及电穿孔等。在用土壤杆菌转化时，可由大肠杆菌内制备质粒，该质粒含有与Ti质粒同源的DNA，特别是T-DNA。该质粒能够或不能在土壤杆菌中复制，即它可具有或没有广谱的原核生物复制系统，如RK290，此将部分地依赖于是否转录构建物将被整合到Ti质粒中或被保留在某独立的质粒上。借助于辅助质粒，可使转录构建物转移到根癌病土壤杆菌内，并将所得到的已转化的生物体用于转化植物细胞。
可用根癌病土壤杆菌或发根病土壤杆菌，简便地培养外植体，以使转录构建物转移到植物细胞，使植物细胞分散于用于选择的适当选择性培养基中，生长成愈创组织，发芽并在生根培养基中由幼苗再生成为小植物。土壤杆菌宿主将包含一个具有Vir基因，并可能有或没有T-DNA的质粒，其中Vir基因是使T-DNA转移到植物细胞内所必须的。为进行注射和电穿孔处理，可将失去攻击能力的Ti质粒(缺乏肿瘤基因，特别是T-DNA区域)引入植物细胞内。
可以以多种方式使用构建物。特别是这些构建物可用于修变种子内的脂肪酸组成，即从链长、不饱和程度等方面改变各种不同脂肪酸的比例和/或量。因此对脂肪酸组成的改变可包括，较之16至18碳原子的脂肪酸，提高了10至14碳原子之脂肪酸的量，增加或降低20至24碳原子之脂肪酸，提供用于提高饱和或未饱和之脂肪酸的比例等。这些结果可通过产生互补于固有基因之转录产物的转录产物，从而抑制转录产物的成熟和/或表达，以降低一种或多种内源性产物，特别是酶或辅助因子的表达而达到的，或者是通过提供与脂肪酸合成有关的某一基因(内源性或外源性的)的表达而达到的。与脂肪酸合成有关的表达产物包括酰基载体蛋白，硫酸酶，乙酰转酰基酶、乙酰辅酶A羧化酶，酮酯酰基合成酶，丙二酸单酰转酰基酶，硬脂酰-ACP去饱和酶及其它去饱和酶。
此外，可望由包括哺乳动物的其它来源制得各种产品，如血液因子、淋巴细胞活素、菌落刺激因子、干扰素、纤维蛋白溶酶原活化剂、酶(如过氧化物歧化酶、凝乳酶等)、激素、大鼠乳腺硫酯酶2、参与Cicosapentaenoiaacid，合成中的磷脂酰基去饱和酶及人血清白蛋白等。另一个目的是增加种子蛋白特别是突变之种子蛋白的水平，包括改善其氨基酸分配，以便好地保障种子的营养价值。在这种情况下，可以通过生产与固有编码区或非编码区互补的DNA序列来抑制固有种子蛋白，此时互补系列将不能与突变的序列进行有效地杂交，或使固有转录能力失活。
可依照常规方法，使已经转化的细胞进入植物内生长。例如，可参见McCormick等人(PlantCellReports(1986)581～84)。之后培养这些植物，并与同一已转化株或不同的植株授粉，鉴定具有预期之表型特征的杂种。可以繁殖两代或两代以上，以使该表型特征得以稳定地保留和遗传，之后收获种子以确保得到预期的表型或其它性质。
作为宿主细胞，可以使用提供有种子的任何品种的植物。因此，对于可选择的大部分植物来说，应是可大量生产种子的，或者可收获到有价值之种子特异性产品的。有价值的种子包括油料种子，如芸苔属(Brassica)种子，棉花种子，大豆，红花，向日葵等;谷物种子，如小麦，大麦，稻，三叶草，玉米等。
可以以多种方法鉴定有用的转录起始区。在已经分离了种子蛋白后，即可部分地测定其序列，这样也就能够设计出用于鉴定对种子特异之mRNA的探针。为进一步提高与种子特异相关之mRNA的浓度，可制备CDNA，并用mRNA“扣除”CDNA，或者由非种子相关细胞制备CDNA。之后即可使用由植物细胞制备的适当DNA文库，用残留的DDNA探查基因组的互补序列。进而可分离，操作与CDNA杂交的序列，分离与编码区相关的5′非翻译区，并用于表达构建物中以鉴定5′非翻译区的转录活性。
在有些情况下，可使用直接筛选基因组文库的探针，并鉴定与探针杂交的序列，以进一步缩短研究工作。可按上述方法操纵该序列以鉴定5′-非翻译区。
可按前面已描述的方法，将使用5′-非翻译区制得的表达构建物转化到植物细胞内，以检测其发挥异源性结构基因(但不是与5′非编码区相关的野生型开放读码)功能及种子特异性的能力。以这种方法，可鉴定特异性序列作为种子特异性转录之序列的使用。特别有价值的表达暗盒包括来自napin基因特别是芸苔属napin基因、更具体地说是甘蓝型油菜(Brassicanapus)或油菜(Brassicacampestris)基因的转录调节区、与脂类产生，特别是与脂肪酸产生有关的调节结构基因，包括酰基载体蛋白(其对特殊植物可以是内源或外源性的)如波菜酰基载体蛋白，芸苔属酰基载体蛋白，(如甘蓝型油菜或油菜、萼距花属(Cuphea)等的酰基载体蛋白)，乙酰转酰基酶、丙二酰转酰基酶、β-酮酯酰合成酶Ⅰ和Ⅱ、硫酯酶，特别是植物、哺乳动物或细胞来源的硫酯酶Ⅱ(例如大鼠硫酯酶Ⅱ)，酰基ACP或磷酯酰基去饱和酶。
下列实施例旨在进一步阐明本发明，但不构成对本发明的限制。
实验材料和方法克隆载体使用的克隆载体包括pUC载体，即pUC8和pUC9(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268);pUC18和pUC19(Norrander等人，Gene(1983)26101～106;Yanisch-Perron等人，Gene(1985)33103～109)，以及用氯霉素抗性(CAM)交换上述pUC质粒之氨苄青霉素抗性作为标志物的类似载体(pUC-CAM)〔pUC12-Cm，pUC13-Cm〕Buckley，K.，Pn.D.Thesis，U.C.S.D.，CA1985)。PUC18和pUC19载体的多克隆位点与pUC-CAM的克隆位交换以建成具有CAM抗性的pCGN565和pCGN566。亦使用了PUC118和pUC119，其分别是具有M13之基因间区的pUC18和pUC19，该基因间区自5465处的HgiAⅠ位点至5941处的AhaⅢ位点，是在PUC的NdeⅠ位点插入的。(可自VieiraJ，和Messing处得到，J.WaksmanInstitute，RutgersUniversity，Rutgers，N.J.)材料自Bethsda研究实验室得到的末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)、RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶，T4激酶和限制性内切酶，得自New England Biolads的大肠杆菌DNA连接酶;得自Life Sciences有限公司的逆转录酶;得自Amtrsham公司的同位素;得自Bachem有限公司(Torrance，CA)的X-gal。
实例1Napin启动子的构建在pg N1克隆之有napin基因之ATG起始密码子的298核苷酸上游，将含有napin基因之甘蓝型油菜(B.napus)基因组DNA的3.3Kb Eco RⅠ汽段克隆到pUC8(得自Marti Crouch，University of Indiana)中。用Eco RI和Sst Ⅰ酶切pg N1 DNA并连接到Eco RⅠ/SstⅠ酶切的PCGN706上。(pCG706是一个含有3′和另一个在Sal Ⅰ和Pst Ⅰ位点克隆到pCGN566中之Napin CDNA克隆pN2(Crouch等，1983，上述文献)的聚腺苷酸化序列。)用Sal Ⅰ酶切所得的克隆PCGN707，并用Bal 31酶处理以除去napin基因的某些编码区。于Bal 31处理后用Sma Ⅰ酶切所得切断了的DNA并重新连接之。将按大小选择的克隆之一，即pCGN713通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切再克隆到EcoRⅠ/BamHⅠ酶切的PEMBL18(Dente等人，NucleicAcidsRes.(1983)111645～1655)和pUC118中，以分别得到E418和E4118。用Sanger二脱氧法检测E418模板的碱基序列，以进一步检实Bal31酶切的范围。对启动子区的Bal31删除只扩展到起始密码子的57核苷酸下游区，因此含有napin编码序列的5′末端和5′非编码区的大约300bp。依照Zoller和Smith方法(NucleicAcidsRes.(1982)106487-6500)。使用一寡核苷酸引物5′-GATGTTTTGTATGTGGGCCCCTAGGAGATC-3′，经体外致突变，剪裁E4118，以缺失包括ATG起始密码子之napin的所有编码区域。经两次转化到大肠杆菌JM83菌株中(MessingJ.，RecombinantDNATechnicalBulletin，NIHPublicationNo.79～99，2No、2，1979，pp43-48)并对假定的转化体进行SmaⅠ酶切以筛选适当的突变体。所得napin启动子克隆为pCGN778，并含有由pgN1的EcoRⅠ位点到恰在napin的ATG起始密码子之间之A核苷酸的298个核苷酸。用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切并连接到EcoRⅠ/BamHⅠ酶切的pCGN565上，使启动子区再克隆到氯霉素抗性本库材料中，以得到pCGN779C。
Napin启动子克隆的延伸pCGN779C只含有潜在之5′-调节序列的298个核苷酸。用见于原始λBnNa克隆上5′-EcoRⅠ位点之上游区的1.8Kb片段延伸napin启动子。将包含napin区的λBnNa(得自M.Crouch)的～3.5KbXhoⅠ片段再克隆到SalⅠ酶切的pUC119中，得到pCGN930。利用紧接着5′XhoⅠ位点的HindⅢ位点使pCGN930的HindⅢ/EcoRⅠ片段再克隆到HindⅢ/EcoRⅠ酶切的Bluescript+(载体克隆系统，SanDiego，CA)中，得到pCGN942。将用EcoRⅠ和PstⅠ酶切的pCGN779C与用EcoRⅠ和PstⅠ酶切的PCGN942相连制成延伸了的napin启动子，得到pCGN943。该启动子含有包含在λBnNa上之napin基因原始ATG的～2.1Kb上游序列。图1中显示了启动子区的部分序列。
Napin暗盒(Cassettes)使延伸的napin启动子与napin3′调节区结合，即得到表达种子特异性基因的napin暗盒。所用的napin3′区来自于含有XhoⅠ/EcoRⅠ片段的质粒pCGN1924，上述片段则是将pgNⅠ(XhoⅠ位点位于距napin基因之终止密码18个核苷酸处)再克隆到EcoRⅠ/SalⅠ酶切的pCGN565中得到的。连接HindⅢ/PstⅠ酶切的pCGN943和pCGN1924，得到napin暗盒pCGN744，其具有用于插入基因的独特的克隆位点SmaⅠ、SalⅠ和PstⅠ。
得自菠菜叶之CDNA文库的构建依顾Facciotti等人(Biotechnology(1985)3241～246)所述的方法，在4M硫氰酸胍缓冲液内，从嫩菠菜叶中提取总RNA。依照Maniatis等人(1982)(MolecularCloningALaboratoryManual，(1982)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)所述的方法使总RNA经两次Oligo(dT)-纤维柱层析，以得到poly(A)+RNA。依照稍加改进的Gubler和Hoffman方法(Gene(1983)25263-269)在pUC13-Cm中构建cDNA文库。在合成第一股cDNA时须将RNasin删除，如果不完全除去，它将干扰第二股的合成，同时如文献中所述用dCTP接尾载体DNA并用dGTP接尾双股cDNA以防止倒转。接Hanahan所述的方法(J.Mol.Biol.(1983)166557-580)将已退火的cDNA转化到足够的大肠杆菌JM83(Messing(1979)上述文献)细胞内，并散布于含有50微克/毫升(氯霉素和0.005%X-Gal的LB琼脂平皿上(Miller，(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
菠菜ACP-ⅠcDNA的鉴定通过Southern吸印法(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)并与得自各代表200个cDNA克隆的40份储集品的克隆分析DNA(见下述)进行斑点印迹(见下述)杂交，筛选出总共大约8000个cDNA克隆。与菠菜ACP-Ⅰ的16氨基酸区至少有66%同源性5′末端标记的合成寡核苷酸(ACPP4)(5′-GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCCACATTGATACCAAACTCCTCCTC-3′)互补于能够编码16氨基酸肽glu-glu-glu-phe-gly-ile-asn-val-asp-glu-asp-lys-ala-gln-asp-ile，菠菜ACP-Ⅰ的残基49-64(KuoandOhlrogge，Arch.Biochem.Biophys.(1984)234290-296)的DNA序列被用作ACP探针。
用于Soufhern或斑点吸印杂交的克隆分析DNA是按下述方法制备的。将转化体由琼脂板上转移到含50微克/毫升氯霉素的LB培养中，按每10毫升培养基含10个克隆进行分配。培养物于37℃震荡孵箱内保温过夜，之后用等体积培养基稀释并使之生长5小时以上。混合20份样品的内容得到各含200个cDNA克隆的储备品。按Birnboim和Doly所述的方法(NucleicAcidsRes、(1979)71513-1523)，由这些细胞内提取DNA。在用苯酚和氯仿提取后用乙醇沉淀以纯化DNA，使之能够用限制内切酶消化。将DNA重新悬浮于无菌的蒸馏水中，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切40份储集的每份各1微克的DNA样品，并通过0.7%琼脂糖凝胶电泳分离。用Southern的印迹杂交技术将DNA转移到硝酸纤维素滤膜上。
依照厂商提供的说明中所述的方法用r-32P dATP和T4激酶标记ACPP4的5′末端。依照Berent等人的方法(Bio Techniques(1985)3208-220)对来自Southern印迹转移克隆分析DNA的硝酸纤维素滤膜进行杂交(24小时，42℃)并洗涤。将各1微克DNA储集物加至0.5MNaOH中的尼龙滤膜上，制备同一组DNA储集物的斑点印迹。将这些印迹于42℃在50%甲酰胺/1%SDS/1M NaCl中与探针杂交24小时，并与室温下在2×SSC/0.1%SDS(1×SSC＝0.15M NaCl;0.015M柠檬酸钠;SDS＝十二烷基磺酸钠)中洗涤。按上述方法将被ACPP4寡聚核苷酸探针杂交的储集物的DNA转移到JM83细胞内并铺极以得到个别的转化体。将DNA加到已与ACPP4寡聚核酸探针杂交的硝酸纤维素滤膜上制得这些个别cDNA克隆的斑点印迹，并使用与作储集DNA样品之Southern印迹相同的条件分析之。
核苷酸序列分析用限制性内切酶消化，以分析阳性克隆pCGN1SOL，得到如下的部分酶切图。
＊前面的pstⅠ位点被接尾破坏＊＊具有所示可利用的限制性酶切位点的多聚连接子使用限制性切断、连接、转化和分析等标准实验技术(Maniatis等，(1982)上述文献)将cDNA克隆再克隆到pUC118和pUC119中。制备单股DNA模板，并使用Sanger二脱氧技术(Sanger等人，(1977)Proc.Nat.AcadSciUSA745463-5467)测定DNA序列。使用Intelli-Genetics有限公司的程序设备(sofftwarepackage)进行序列分析。
pCGN1SOL含有(近似于)700bpcDNA插入片段，该片段在3′末端包括A残基的延伸部分，其代表了mRNA的、poly(A)尾部。推定61位上的ATG密码子为编码MET的翻译起始密码子。该密码子是411核苷酸开放读码的起始，其中核苷酸229-471编码一个其氨基酸序列几乎完全与Kuo和Ohlrogge所述的ACP-Ⅰ之氨基酸序列相符的蛋白质。除成熟蛋白质外，pCGN1SOL还编码-56残基转换肽序列，可望其为核编码的叶绿体蛋白。
Napin-ACP构建物将用HindⅢ/BamHⅠ酶切的pCGN1SOL、用HindⅢ和BamHⅠ酶切的pUC8和用BamHⅠ酶切的pUC118相连接而构建成pCGN796。用BamHⅠ酶切pCGN796并与BamHⅠ酶切的pCGN565连接，使来自pCGN1796的ACP基因转移到氯霉素本底中。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切所得的pCGN1902，并连接到EcoR1/SmaⅠ酶切的pUC118上，得到pCGN1920。在Nco1位点上切断pCGN1920中的ACP基因，经用Klenow片段处理充填之，用SmaⅠ酶切并再连接以得到pCGN1919。这样便由ACP基因除掉了5′编码序列并重新产生了ATG。用EcoRⅠ酶切pCGN1919，用Klenow片段填入此位点，并连接一PstⅠ连接子，即使这-ACP基因侧接以PstⅠ位点。该克隆被称为pCGN945。
pCGN945的ACP基因作为BamHⅠ/PstⅠ片段移到用BamHⅠ和PstⅠ酶切的pUC118上，即产生出pCGN945a，致使SmaⅠ位点(由pUC118提供的)处于ACP序列的5′末端从而有利于克隆到napin暗盒pCGN944中。将用SmaⅠ和PstⅠ酶切的pCGN945a连接到用Sma1和PstⅠ酶切的pCGN944上，以产生napinACP暗盒PCGN946。之后通过自HindⅢ位点克隆，将napinACP暗盒转移到双载体pCGN783中，以产生pCGN948。
双载体pCGN783的构建pCGN783是含有根癌病土壤杆菌之左和右T-DNA边缘区(Barker等人，PlantMol.Biol，(1983)2335-350);pPH1JI之庆大霉素抗性基因(Hirsch等人，Plasmid(1984)，12139-141)，花椰菜镶嵌病毒(CaMV)(Gardner等，NucleicAcidsRes.(1981)92871-2890)之35S启动子、Tn5(Jorgenson等，下述文献和Wolff等人，上述文献(1985)13355-367)之卡那霉素抗性基因和来自pTiA6之转录产物7之3′区(Barker等上述文献(1983))的双质粒。
为得到庆大霉素抗性标志，自pPHIJ1的3.1KbEcoRⅠ-PstⅠ片段分离庆大霉素抗性基因，并克隆到产生pCGN549的pUC9中。用含有庆大霉素抗性基因的HindⅢ-BamHI片段取代产生pCGN594之pCGN587的HindⅢ-BglⅡ片段。
按下述方法制备pCGN587将含有APHⅡ之完整结构基因的Tn5(Jorgenson等人，Mol.Gen.Genet.(1979)17765)的HindⅢ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira和Messing，Gene(1982)19259)，因有一个EcoRⅠ位点直接与Sma1位点相邻故可将该片段转化到HindⅢ-EcoRⅠ片段中，之后使含有APH基因之3′部位的PstⅠ-EcoRⅠ片段与EcoRⅠ-BamHⅠ-SalⅠ-PstⅠ连接子结合到pUC7的EcoR1位点(PCGN546W)。因为该构建物并不给出卡那霉素抗性，故须将APHⅡ基因的BglⅡ-PstⅠ片段插入到BamHⅠ-PstⅠ位点(pCGN546X)以得到卡那霉素抗性。该方法重新装配了APHⅡ基因，以使EcoR1位点侧接于基因上。一个ATG密码子是来自带有APHⅡ之ATG起始密码子的读码以外的上游。将来自APHⅡ之5′末端的Sau3A-PstⅠ片段，(该片段缺乏不必要的ATG)插入到pCGN546W的BamHⅠ-Pst1位点，以得到质粒pCGN550，即可避开不需要的ATG。
之后将含有APHⅡ基因的EcoR1片段克隆到pCGN451的含有表达章鱼碱合成酶的暗盒唯一的EcoR1位点，以提供pCGN552(1ATG)。
PCGN451包含章鱼碱暗盒，其包括通过EcoRⅠ连接子融合于pTiA6之章鱼碱合成酶基因3′编码区的约1556bp5′非编码区。PTi等同物是如Barker等人(PlantMol.Biol.(1983)2325)所定义的3′区的11，207至12，823bp片段和5′区的13，643至15，208bp片段。
依照下述方法制得5′区。将含有编码区之5′末端的小的再克隆的片段作为BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆到作为质粒pCGN407的pBR322中。BamHⅠ-EcoRⅠ片段在编码区有-XmnI位点，而pBR322有两个XmnⅠ位点。用XmnⅠ酶切pCGN407，用Bal31核酸酶切断并将EcoRⅠ连接子加到该片段上。用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，按大小分离各片段，克隆各部分并分析其序列。一种情况是使整个编码区和5′非翻译序列的10bp脱离5′非翻译区被除去，而mRNA帽位点和5′非翻译区的16bp(至BamHⅠ位点)是完整的。在7%聚丙烯酰胺凝胶上按大小分离得到该小片段并洗脱出大约130bp的片段。
将这个按大小分离的DNA连接到M13mp9中，并分析几个克隆的核苷酸序列，此序列与章鱼碱合成酶基因的已知序列差不多。M13构建物被定名为P14，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切其质粒提供小的片段，该小片段被连接于含有PTiA6(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)之上游5′序列的XhoⅠ至BamHⅠ片段以及含有3′序列的EcoRⅠ至XhoⅠ片段上。
将所得的XhoⅠ片段克隆到pUC8衍生物的XhoⅠ位点中(定名为pCGN426)。该质粒因具有用DNA聚合酶Ⅰ填入的单一EcoRⅠ位点，并且因HinCⅡ限制性核酸内切酶的核酸酶污染致使丢失PstⅠ和HindⅢ(此时XhoⅠ连接物被插入到pUC8的唯一HinCⅡ位点中)，故不同于pUC8。所得到的质粒pCGN451具有一个在5′非编码区(其含有1550bp5′未翻译的序列，该序列包含T-DNA的右侧边缘区，mRNA帽位点和16bp5′未翻译的序列)和3′区(其含有267bp编码区、终止密码子、196bp3′未翻译的DNA，polyA位点及1153bp3′未转录的序列)之间插入蛋白编码序列的单一EcoRⅠ位点。pCGN451也提供了右侧T-DNA边缘区。
用EcoRⅠ酶切得到在适当方向上具有OCS5′和OCS3′的质粒pCGN451，并将得自含完整卡那霉素抗性其因之PCGN551的EcoRⅠ片段插入到EcoRⅠ位点中，以提供在适当方向上有卡那霉素抗性基因的pCGN552。
该OCS/KAN基因被用于为反式双载体pCGN587提供一个可选择的标志。
工程化章鱼碱合成酶启动子暗盒的5′部分在bp15208-13644(Barker的序列编号)始自XhoⅠ的pTiA6DNA组成，该DNA也含有卷入T-DNA转移的T-DNA边界序列(边缘区)。在质粒pCGN587中，来自pCGN552的OCS/KAN基因提供一个可选择的标志以及右侧边缘区。首先将左边缘区作为-HindⅢ-SmaⅠ片段(pCGN502)(碱基对602-2213)，克隆到M13mp9中，再作为为Kpn1-EcoRⅠ片段克隆到pCGN565中以得到pCGN580。pCGN565是一个基于pUC8-Cm的克隆载体，但含有pUC18连接子。用BamHⅠ酶切使pCGN580成为线性的，并用于取代pVCK102(Knauf和Nester，Plasmid(1982)845)的较小的BglⅡ片段，建成pCGN585。用来自含OCS/KAN基因之pCGN552的XhoⅠ片段置换pCGN585的较小SalⅠ片段，得到pCGN587。
用得自pUC18的HindⅢ-BamHⅠ多聚连接子区取代含有5′-OCS-卡那霉素-OCS-3′片段的pCGN594HindⅢ-BamHⅠ区(OCS是具有5′标示之启动子区和3′终止信号区的章鱼碱合成酶基，见美国专利申请775，923号，申请日为1985年9月13日)。
pCGN566含有插入到PUC13-Cm之EcoRⅠ-HindⅢ位点之pUC18的EcoRⅠ-HindⅢ连接子。将含有ORF1和pTiA6之-2的PNW31C-8，29-1(Thomashow等人，Cell(1980)19729)的HindⅢ-BglⅡ片段再克隆到pCGN566的HindⅢ-BamHⅠ位点得到pCGN703。
将含有转录产物7之3′区(相当于pTiA6(Barker等人，(1983上述文献)的碱基对2396-2920)的pCGN703的Sau3A片段再克隆到pUC18的BamHⅠ位点中得到pCGN709。用pCGN587的EcoRⅠ-SmaⅠ片段(其含有卡那霉素抗性基因(APH3-Ⅱ))取代pCGN709的EcoRⅠ-SmaⅠ多聚连接子区，得到pCGN726。
以pCGN726的EcoRⅠ-SalⅠ片段接加pCGN734的BglⅡ-EcoRⅠ片段，之后插入到pUC8-Cm的BamHⅠ-SalⅠ位点，得到pCGN738。pCGN726C是通过自pCGN738缺失900bpEcoRⅠ-EcoRⅠ片段而得到的。
为构建pCGN167，将用AluⅠ酶切得到CaMV(bp7144-7735)(Gardner等人，Nud.AcidsRes.(1981)92871-2888)的AluⅠ片段，并克隆到M13mp7(Messing等人，Nucl.AcidsRes.(1981)9309-321)的HinCⅡ位点中，建成C614。用EcoRⅠ酶切C614，产生出含有35S启动子的得自C614的EcoRⅠ片段，将其克隆到pUC8(Vieira和Messing，Gene(1982)19259)的EcoRⅠ位点得到pCGN146。
为了修剪启动子区，用BglⅡ处理BglⅡ位点(bp7670)并用Bal31切断，之后将-BglⅡ连接子接到Bal31处理的DNA上，得到pCGN147。
用BglⅡ酶切pCGN528并插入到pCGN147的BamHⅠ-BglⅡ启动子片段中，制得含有启动子区、可选择标志(有2个ATG的KAN)和3′区的pCGN148a。将该片段克隆到pCGN528的BglⅡ位点中，从而使BglⅡ位点紧接于pCGN528的卡那霉素基因的旁侧区。
依照下述方法制备用于这一构建物的穿梭载体。用HindⅢ-BamHⅠ酶切含Tn5(其中包含一卡那霉素基因)的质粒(Jorgenson等人，Mol.Gen.Genet.(1979)17765)，并将含有卡那霉素基因的HindⅢ-BamHⅠ片段插入到pACYC184(Chang和Cohen，J.Bacteriol.(1978)1341141～1156)之四环素基因中的HindⅢ-BamHⅠ位点内制得pCGN525。将用XhoⅠ连接子插入到SmaⅠ位点内经修饰的pTiA6(Thomashow等人，Cell(1980)19729-739)的BamHⅠ片段19插入到pCGN525的BamHⅠ位点中，制得pCGN526。经用XhoⅠ酶切并再连接，以删去pCGN526的小的XhoⅠ片断，得到pCGN528。
将pMB9KanⅩⅩⅠ的BamHⅠ-卡那霉素基因片段克隆到pCGN148a的BamHⅠ位点，得到pCGN149a。
pMB9KanⅩⅩⅠ是一种pUC4K变异体(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268)，其有XhoⅠ位点缺失但含有来自Tn903的功能性卡那霉素基因，以允许在土壤杆菌中进行有效的选择。
用BglⅡ和SphⅠ酶切pCGN149a。用BamHⅠ和SphⅠ酶切MI(见下述)，并分离得到BamHⅠ-SphⅠ片段，再用该片段置换上述pCGN149a的小的BglⅡ-SphⅠ片段。这样得到pCGN167，该构建物含有全长CaMV启动子，1ATG-卡那霉素基因，3′末端和细菌的Tn903型卡那霉素基因。MI是来自pCGN546X(见pCGN587的构建)的EcoR1片段，并以一种使1ATG-卡那霉素基因中的PstⅠ位点邻接于M13mp9的多聚连接子区的方式被克隆到M13mp9的EcoR1克隆位点中。
将含有CaMV-35S启动子、1ATG-卡那霉素基因和pTiA6之BamHⅠ-片段19之pCGN167中的HindⅢ-BamHⅠ片段克隆到pUC19的BamHⅠ-HindⅢ位点内，制得pCGN976。将pCGN976的0.7KbHindⅢ-EcoR1片段(35S启动子)和pCGN709的0.5KbEcoRⅠ-SamⅠ片段(转录本7∶3′)克隆到pCGN566的HindⅢ-SalⅠ位点，建成pCGN766C。
将pCGN766C的0.7KbHindⅢ-EcoRⅠ片段(CaMV-35S启动子)连接到pCGN726C中的1.5KbEcoRⅠ-SalⅠ片段(1ATG-KAN3′区)上，之后插入到pUC19的HindⅢ-SalⅠ位点中得到pCGN778。用含有CaMV-35S启动子和1ATG-KAN-3′区的pCGN778的2.2Kb区即HindⅢ-SalⅠ片段取代pCGN739的HindⅢ-SalⅠ连接子区，以得到pCGN783。
双载体pCGN948转移到土壤杆菌内通过转化作用将pCGN948引入根癌病土壤杆菌EHA101(Hood等人，J.Bacteriol.(1986)1681291-1301)内。将2毫升EHA101的培养物在MG/L液体培养基中于30℃保温过夜。取0.5毫升接种于100毫升MG/L液体培养基(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732-743)中，并使之在振荡孵箱中于30℃生长5小时。于7K离心沉淀细胞，再悬浮于1毫升MG/L液体培养基中并置于冰上。将大约1微克pCGN948DNA加入已加了200微升(μl)EHA101悬液的100微升MG/L液体培养基内;将含有DNA-细胞混合物的试管立即放入干冰/乙醇浴中5分钟。在37℃水浴中将试管内容快速融溶5分钟，加入1毫升新鲜MG/L培养基后于30℃振荡2小时。离心收集细胞沉淀并分散于含有100毫克/升庆大霉素的MG/L平皿(1.5%琼脂)上。自各自独立的庆大霉素抗性菌落分离质粒DNA，转化回到大肠杆菌内，并使用限制性内切酶作定性分析，以确证卡那霉素抗性EHA101含有pCGN948的完整拷贝。收集单个菌落并通过在含有100毫克/升庆大霉素的平皿上作两次以上划线而纯化之。
甘蓝型油菜(B.Napus)的转化与再生将甘蓝型油菜(Wester变种)的种子在95%乙醇中浸泡4分钟。浸于每100毫升无菌溶液含50微升“Tween20”表面活性剂的1%次氯酸钠溶液中灭菌。浸泡45分钟后，用无菌蒸馏水将种子洗涤4次。将其植于宽7厘米，长7厘米，高10厘米，含50毫升MS(Murashige最小量有机物培养基，Gibco)的无菌塑料盒(Magenta)内，其中MS的浓度为1/10，加有吡哆素(500微克/升)、烟酸(50微克/升)、甘氨酸(200微克/升)，并且是已用0.6%琼脂固化了的。种子于22℃在16小时-8小时光-暗循环(光强度约为65μEm-2S-1)条件下发芽并生长。5天后于无菌条件下取出籽苗，切掉下胚轴，并切成长约4毫米的碎片。将下胚轴碎片放在饲养平皿上，或者在固化的B50/1/1或B50/1/0培养基上之滤纸的顶上而没有饲养层。B50/1/0培养基含有B5盐和维生素(Gamborg，Miller和Ojima，Experimental Cell Res.(1968)50151-158)、3%蔗糖、2，4-二氯苯氧基乙酸(1.0毫克/升)，PH调至5.8，且培养基是用0.6%Phgtagar固定的;B50/1/1除了含上述成分外，另外加有1.0毫克/升激动素。在B50/1/0或B50/1/1培养基上吸移1.0毫升静止期烟草悬浮培养物(按Fillatti等人，Molecular General Genetics(1987)206192-199中所述方法维持的将饲养皿预制备24小时。切掉下胚轴碎片并在作土壤杆菌处理之前于饲养皿上放置24小时。
于30℃在MG/L液体培养基中孵育土壤杆菌的单个菌落，制备根癌病土壤杆菌(菌株EHA101×948)。16小时后收获细菌并在MG/L液体培养基中制成每毫升108细菌的细菌悬液。将下胚轴碎片放入土壤杆菌悬液内，并使之静置30-60分钟以用细菌接种下胚轴碎片，之后移出并转移到含有B50/1/1或0/1/0培养基(0/1/1是指1毫克/升，2，4-二氯苯氧基乙酸和1毫克/升激动素，而0/1/0是指没有激动素)之培养皿内。于22℃低光照下温育培养皿。细菌与下胚轴碎片共保温24-48小时。移去下胚轴碎片并放在含有500毫克/升羧苄青霉素(有时是加浓度为10、25或50毫克/升的硫酸卡那霉素)的B50/1/1或0/1/0上，于22℃连续光照(大约65μEm-2s-1)下温育7天。将碎片转移到含1%蔗糖、3毫克/升苄氨基嘌呤(BAP)和1毫克/升玉米素的B5盐培养基内，该培养基添加有500毫克/升羧苄青霉素，10、25或50毫克/升硫酸卡那霉素、并用0.6%Phytagar(Gibco)固化。此后，每两周给外植体换一次新鲜培养基。
一个月后由已在含卡那霉素培养基上选择的绿色愈创组织长出绿色幼芽。幼苗继续发育三个月。当其至少有1厘米长时，由愈创组织上切掉嫩芽并置于含1%蔗糖，不加生长物质，含300毫克/升羧苄青霉素，并用0.6%Phytagar固化了的B5培养基上。使幼苗继续生长并取几片叶试验新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT Ⅱ)活性。将得有NPT Ⅱ活性阳性结果的幼苗放在装有含1%蔗糖，2毫克/升吲哚丁酸，200毫克/升羧苄青霉素，并用0.6%Phytagar固化之B50/1/1培养基的Magenta盒子内。几周后幼苗长出根，并被移到土壤中。该植物在生长室(growth chamber)内，于22℃，在16-8小时光-暗循环(光强度为220μEm-2s-1)条件下生长并于几周后移入温室内。
Southern吸印分析资料试验了自含pCGN948之根癌病土壤杆菌EHA101与甘蓝型油菜(B.napus)下胚轴之混合细胞培养(cocultivatious)所再生的甘蓝型油菜植物的适当整合及菠菜叶ACP基因的胚胎特异性表达。Southern分析是依照Dellaporta等人的方法(PlantMol.Biol.Rep.(1983)119-21)，使用由再生之植物的叶子分离的DNA进行的，并通过在CsCl梯度中成带而一次离心纯化的。用限制性内切酶EcoRⅠ切断DNA(10微克)，在0.7%琼脂糖凝胶上电泳并吸印转移到硝酸纤维素滤膜上(见Maniatis等人，(1982)上述文献)。用含有1.8Kb菠菜ACP序列的pCGN945DNA，或用自含有32p-dCTP标记之napin5′序列的pCGN936C(其为将pCGN930的HindⅢ/EcoRⅠ片段转移到pCGN566中制得的)分离的EcoRⅠ/HindⅢ片段(按照制造商所述的缺口翻译方法，使用BRL缺口翻译试剂盒〔BethesdaResearchLaboratories，Gaithersburg，MD.〕完成上述标记)探查印迹。将印迹于42℃在50%甲酰胺，10×Denhardt′s试剂，5×SSC、0.1%SDS、5mMEDTA、100微克/毫升牛胸腺DNA及10%硫酸葡聚糖(只用于杂交)中预杂交和杂交(试剂已在Manitis等人(1982)上述文献中述及)。在1×SSC、0.1%SDS中洗30分钟并在0.1×SSC，0.1%SDS中于55℃洗两次。
放射自显影表明有两条大约3.3和3.2Kb的带杂交到得自四株植物之DNA的EcoRⅠ消化产物中，因为3.3和3.2KbEcoRⅠ片段是存在于pCGN948的T-DNA区内，所以当用ACP基因(pCGN945)探查时，即证明了菠菜叶ACP构建物在植物基因组中的适当整合。用napin5′序列探查时，正如由测得的植物DNA-构建物DNA边缘区片段之序列的序数所判定的，基因构建物是存在于不同植物之单一或多个座位中。
Northern吸印分析资料经Northern吸印分析法检测自napin启动子整合的菠菜叶ACP基因的表达，结果表明在已转化植物之一的种子中而不是叶子中含有构建物DNA。开花后21天由转化的种子收集发育中的种子。自种子内切除胚胎并冷冻于液氮中。按Crouch等人(1983，上述文献)的方法由已转化之植物的种子胚胎和叶子中分离总RNA，按已知方法(Shewmaker等人，Virology(1985)140281-288)在含甲醛的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并吸印到硝酸纤维素滤膜上(Thomas，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1980)775201-5205)。按上述方法对印迹预杂交、杂交并洗涤。该探针是一自pCGN945分离的PstⅠ/BamHⅠ片段，而该pCGN945只含有以缺口翻译法标记的菠菜叶ACP序列。
在已转化的植物的胚胎材料中而不是叶子材料中，检测到～0.8KbRNA带，这就证明了菠菜叶ACP基因的种子特异性表达。
实施例Ⅱ油菜(B.Campestris)Napin启动子暗盒的构建使用已建立的方法(Maniatis等人，(1982)上述文献)在λ载体Charon 35中制得油菜(B.Campestris)DNA的Bgl Ⅱ部分基因组文库。经放大的文库的滴度为～1.2×109个噬菌体/毫升。使40万个重组噬菌体于37℃经20分钟吸附于DH1大肠杆菌细胞(Hanahan，Mol.Biol.(1983)166557)后，于NZY+10mM MgSO4+0.9%琼脂糖中以每9×9吋105个噬菌体的密度在NZY平面(NZYM，如Maniatis等人(1982)上述文献中所述)上铺板。平皿于37℃保温～13小时，于4℃冷却2.5小时，通过在平皿上铺敷预切割的滤膜约1分钟并剥脱之，以使噬菌体吸附到基因滤网附加物(GeneScreenPlus)(NewEnglandNuclear)上。使滤膜在1.5MNaCl、0.5MNaOH上漂浮1分钟，在1.5MNaCl，0.5MTris-HCl(PH8.0)中中和2分钟，并在2×SSC中漂浮3分钟，以固定已吸附的噬菌体DNA。将滤膜风干直到潮湿为止，按前述作Southern分析的方法，于42℃进行预杂交和杂交。使用CDNA克隆BE5的XhoⅠ/SalⅠ片段(该片段是使用探针PN1(Crouch等人，1983，上述文献)自上述油菜(B.Campestris)种子CDNA文库分离的)，探查滤膜上含napin的克隆。三个噬斑强杂交在成对的滤膜上，并按前已述及的方法(Maniatis等人，1982，上述文献)纯化之。
制作其中一个定名为λCGN1-2之克隆的限制性酶切图，napin基因被定位到与2.7KbXhoⅠ和2.1KbSalⅠ交搭的限制性片段上。将这两个片段由λCGN1-2DNA再克隆到pCGN789(与pUC119相同的pUC基载体，其中正常多聚连接子被合成的连接子-5′GGAATTCGTCGACAGATCTCTGCAGCTCGAGGGATCCAAGCTT3′(其代表了多聚连接子EcoR1，SalⅠ，BglⅡ，PstⅠ，XhoⅠ，BamⅠ，HindⅢ)所取代)中。通过序列分析进一步肯定了对napin亚克隆的鉴定。测定了整个编码区序列以及伸延之5′上游和3′下游序列(图2)。λCGN1-2napin基因为编码相对应于BE5CDNA之mRNA者，经测定证明它们的核苷酸序列是准确匹配的。
按构建pCGN944的相似方法，自λCGN1-2napin基因的5′末端和3′末端构建表达暗盒。经用SalⅠ酶切并再连接删除pCGN940的大部分napin编码区，以形成pCGN1800。使用合成的寡核苷酸5′-GCTTGTTCGCCATGGATATCTTCTGTATGTTC-3′，将得自pCGN1800的单股DNA用于体外诱变反应(Adelman等人，DNA(1983)2183-193)。该寡核苷酸在napin基因的启动子区与ATG起始密码子的连接处插入了一个EcoRⅤ和NcoⅠ限制性酶切位点。通过与用以诱变的寡核苷酸杂交以鉴定出一适用的突变体，分析其核苷酸序列并定名为pCGN1801。
经用EcoRⅤ部分消化并连接到用EcoRⅠ酶切的pCGN786(为-pCGN566氯霉素抗性基载体，其中以上述合成的连接子代替了正常多聚连接子)上以再克隆-pCGN1801的1.7Kb启动子片段，再用DNA聚合酶ⅠKlenow片段填充使成平头得到pCGN1802。将来自λCGN1-2napin基因的3′序列加到XhoⅠ/HindⅡ酶切的pCGN1802上即完成暗盒的构建。所得的表达暗盒即PCGN1803含有1，725Kbnapin启动子序列和1，265Kbnapin3′序列，在其中间含有独特的克隆位点SalⅠ，BglⅠ，PstⅠ和XhoⅠ。需要在芸苔属(Brassica)中进行种子特异性转录或表达任何序列，即脂肪酸基因可以以与实施例Ⅰ中所述插入菠菜叶ACP及甘蓝型油菜(B.napus)napin暗盒的相似方法被插入到该暗盒中。
实施例Ⅲ
可以自编码参与种子三酰基甘油合成之蛋白质(如芸苔属种子的酰基载体蛋白)的基因分离其它种子特异性启动子。自油菜(Brassicacampestris)变种“R-500”(芜菁油菜(turniprape)的一种自身兼容性变种)收集未成熟的种子。在相当于开花后的大约14至28天时收集整个种子。依照上述分离菠菜ACPCDNA克隆的方法，分离RNA并制备CDNA库，不同的是使用PCGN565作载体。为探查CDNA库，使用380A型AppliedBiosystemsDNA合成仪，依照厂商推荐的方法合成寡核苷酸(5′)-ACTTTCTCAACTGTCTCTGGTTTAGCAGC-(3′)。这一合成的DNA分子以低严格程度杂交到编码氨基酸序列(ala-ala-lys-pro-glu-thr-val-glu-lys-val)的DNA序列上。已报导了自甘蓝型油菜(Brassicanapus)的种子分离的ACO的氨基酸序列(Slabas等人，7thInternationalSymposiumoftheStructureandFuctionofPlantLipids，UniversityofCalifornia，Davis，CA，1986)与自油菜(B.Campestris)种子分离的ACP是高度同源的。使用菌落杂交技术(Taub和Thompson，Anal，Biochem.(1982)126222-230)及相当于Wood等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(1985)821585-1588)所述的杂交条件分析大约2200个不同的CDNA克隆。对两个显示与寡核苷酸探针产生明显杂交的CDNA克隆的DNA序列分析表明，一个定名为PCGN1Bcs的克隆确实编码ACP前体蛋白，因其编码的氨基酸序列与上述得自甘蓝型油菜(Brassicanapus)的ACP蛋白(Slabas等，1980，上述文献)具有显著的同系性。与实施例Ⅱ相似，可使用ACPCDNA克隆分离基因克隆，而该克隆即可以以连接相类似于制备油菜(B.Campestris)napin暗盒的方式，由之制成-表达暗盒。
其它实施例通过miniprepDNA在基因滤网附加物(GeneScreenPlus)尼龙滤膜上的斑点印迹杂交，由开花后14-28天的油菜(B.Campestris)种子CDNA文库(如前面的实施例中述及的)筛选出96个克隆。所用的探针是由开花后14-28天的mRNA或由油菜(B.Campestris)叶mRNA制得的放射活性标记之第一股链合成CDNA。将与种子CDNA产生强杂交，且很小或完全不与叶CDNA杂交的克隆列入编目。经与PN1(Crouch等人，1983，上述文献)的XhoⅠ/SalⅠ片段(为-甘蓝型油菜napinCDNA)交叉杂交将许多克隆鉴定为种子储存蛋白。上述BE5可用于鉴定作为胚胎特异性启动子之来源的油菜(B.Campestris基因组克隆。
其它种子特异性基因亦可作为启动子来源。已鉴定了cruciferin，甘蓝型油菜(B.napus)的另一主要种子储存蛋白的CDNA克隆(Simon等人，1985，上述文献)并可用于筛选启动子的基因组文库。
在没有了解其特异性功能的情况下，仍可根据其在种子组织中表达的水平，其表达时间(即它们于开花后被表达)及其在油菜(B.Campestris)基因组中的大约重现数(拷贝数)来对其它CDNA克隆进行分类。为表达与脂肪酸合成或其它种子功能有关之基因所必需的标准的克隆，可被用来筛选含有表达所必需之5′和3′调节区之基因组克隆的基因组文库。可以以前述实施例中描述适于napin基因的一般方法操作非编码调节区域，以制得组织特异性表达暗盒。
CDNA克隆的一个例子是EA9。其可在油菜的种子，而不是叶子中得以高表达。经用斑点印迹杂交法，与得自文库的7个其它CDNA作交叉杂交，表明其可提供高度丰富的mRNA。使用EA9的700bpEcoRⅠ片段作为探针，对从14天种子以及开花后21、28天胚胎分离的mRNA所作Northern印迹分析结果表明EA9可在14天时高度表达，而在21和28天时则以极低水平表达。对EA9聚腺苷酸化信号及3′末端polyA接尾序列的鉴定进一步肯定了CDNA克隆的定向以及mRNA的转录方向。这里提供的克隆EA9的部分序列(图3)，可被用于合成鉴定特定类芸苔属种子特异性启动子的探针。
上述结果表明，可在种子中获得特定地转录或表达，以致可以调整种子，特别是胚胎产品的表型或改变产品性质。业已发现，可以使用与种子中序列的转录有关的转录起始区，结合使用正常序列以外的其它序列，以产生内源性或外源性蛋白或调节核酸序列的转录或表达。以这种方法，种子可以产生出新的产物，用以改善蛋白质组成，修变脂肪酸的分布等。
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请均体现出本发明所属领域内熟练技术人员的技术水平。列为本文参考文献的所有出版物和专利申请与特别指出的每一个别出版物或专利申请都有着同样的参考意义。
虽然为了清楚了解之目的，前于已通过阐述和实施例的方式较详细地描述了本发明，但应明确的是在本发明待批权利要求
范围内可以实践某些改动或改进。
权利要求
1.包含表达暗盒的种子，所说的暗盒含有一个种子特异性转录起始区，一个处于所说之起始区转录调节下的有用序列，以及一个转录终止区，所说的表达暗盒于所说的转录起始区天然位点以外的位点插入到所说之种子的基因组中。
2.根据权利要求
1的种子，其中所说的有用序列是编码某种内源性蛋白或其突变体的开放读码。
3.根据权利要求
1的种子，其中所说的有用序列是编码某种外源性蛋白的开放读码。
4.根据权利要求
1的种子，其中所说的有用序列，编码一种互补于所说种子之转录产物的序列。
5.根据权利要求
1的种子，其中所说的种子是芸苔属植物的种子。
6.包含一个种子特异性转录起始区，一个具有至少两个用来在所说起始区的转录控制下插入某DNA序的限制性位点的少于大约100bp的多聚连接子，以及一个转录终止区的表达构建物，其中所说多聚连接子的序列不同于天然处于所说起始区转录控制下之基因的序列。
7.根据权利要求
6的表达构建物，其中所说的转录起始区是得自于芸苔属植物种子基因。
8.根据权利要求
7的表达构建物，其中所说的基因是napin基因。
9.包括一个种子特异性转录起始区，一个有用的DNA序列，一个处于所说起始区转录控制下并连接到所说起始区之与天然序列不同的有用序列，以及一个转录终止区的表达暗盒。
10.根据权利要求
9的表达暗盒，其中所说的转录起始区是一芸苔属植物基团起始区。
11.根据权利要求
10的表达暗盒，其中所说的基团是napin基团。
12.根据权利要求
10的表达暗盒，其中所说的有用序列是结构基团。
13.根据权利要求
12的表达暗盒，其中所说的结构基因编码一种在生物合成途径中调节脂肪酸生产的蛋白质。
14.根据权利要求
13的表达暗盒，其中所说的蛋白质是酰基载体蛋白。
15.含有根据权利要求
9至14中任一项之表达暗盒，原核生物复制系统，以及用于选择含所说标誌的已转化原始细胞之标誌的载体。
16.修变种子之基因型的方法，其包括繁殖产生种子的植物，其中所说植物的细胞含有根据权利要求
9至14的表达暗盒，由之产生物变了基因型的种子。
专利摘要
提供了完成种子特异性转录的核苷酸序列及其使用方法，用以调节修变在种子，特别是胚胎细胞内的表达。转录起始区是由植物细胞中鉴定并分离的，并被用于制备可转化到植物细胞内完成种子特异性转录的表达暗盒。该方法特别适用于改变植物组织内的脂肪酸产生。
文档编号C07K14/415GK87106120SQ87106120
公开日1988年6月22日 申请日期1987年7月31日
发明者让·C·克里, 维·C·克瑙夫 申请人:加利福尼亚基因公司