靶向人蛋白二硫键异构酶基因的小干扰rna及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了靶向人蛋白二硫键异构酶基因的小干扰RNA，其核苷酸序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，根据人蛋白二硫键异构酶的蛋白编码基因序列为目的基因，选取3个21nt的靶序列，设计并合成包含各靶序列的互补DNA序列以及无义干扰DNA链，退火后插入pLVX-shRNA1表达载体，构建3个针对PDI的干扰质粒；实验表明，本发明所构建的RNA干扰表达载体对二硫键异构酶蛋白表达具有极强的抑制作用，并能够对HCV的复制产生一定影响；本发明在研究和/或鉴定基因功能、制备以宿主基因为靶点的抗HCV等病毒感染的基因药物方面具有较大的应用价值与前景。
【专利说明】靶向人蛋白二硫键异构酶基因的小干扰RNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学与生物医药【技术领域】，涉及人蛋白二硫键异构酶基因序列上用于RNA干扰的干扰靶点，以及针对这些靶点的以各种方式获得的小干扰RNA分子以及其在制备抗HCV感染的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎是发病率高、治疗难度大的一类主要经血液传播的疾病，是严重的社会和公共卫生问题。全球大约有1.5亿人慢性感染丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV),并且每年有超过35万人死于丙肝相关疾病。在我国，HCV慢性感染率为3.2%，是具有较高感染率的国家之一(WHO 2012)。丙型肝炎比较隐蔽，一般的检测方法很难检测出来。而且，与甲肝和乙肝不同的是，丙肝至今没有有效的疫苗，而有限的临床治疗方法仅在少数病人中获得成功。由于HCV作为RNA病毒发生变异的频率远远高于DNA病毒的变异速度，因此从病毒本身角度出发的疫苗研制变得异常困难，这就迫切要求我们进一步了解病毒与宿主细胞间的相互作用，阐明作用机制，从宿主的角度出发寻找关键性的宿主因子和新型干预途径，发现和验证潜在的分子标记物和药物靶点。
[0003]二硫键异构酶是内质网上的一种丰富成分，在各种分泌蛋白和细胞表面蛋白生物合成中催化二硫键的形成。已经证实细胞表面PDI的功能对于某些病毒和细菌的侵入是需要的，其中病毒包括HIV、新城疫病毒和辛德毕斯病毒等。蛋白二硫键异构酶介导的HIV糖蛋白gpl20 二硫键的还原对于病毒与细胞的融合是需要的。高度二硫键化的HIV gpl20分子与淋巴细胞表面的CD4和CXCR4受体结合，结合后其构象变化引起HIV与细胞的融合。淋巴细胞表面相关ΗΠ的抑制能够阻止HIV与细胞的融合，说明包膜蛋白Env的氧化还原变化是必要的。在稳定表达针对PDI的小干扰RNA的Hela细胞中，小鼠多瘤病毒的感染力出现与PDI表达水平同等程度的下降。但PDI并不影响病毒的吸附和吞入，而可能是在二硫键的还原和重排中发挥作用，以稳定病毒壳粒。猴病毒40侵入细胞包括了陷窝/脂筏介导的胞吞作用，囊泡运输至内质网，迁移至胞质，并引入核中。Mar1 Schelhaas等研究发现，SV40在侵入过程中利用硫基/ 二硫化物氧化还原酶——ERp57和TOI，以及Derlin-1和SellL。最近有研究证实细胞表达PDI通过引起整联蛋白的活化而参与登革热病毒的侵入，并且登革热病毒的感染在晚期进一步增加roi的表面表达。巯基/二硫键交换参与轮状病毒的入侵过程，并且细胞表面PDI至少可以成为抑制轮状病毒感染的潜在靶标。研究通过PDI干扰实验证实，二硫键和细胞PDI可能在人乳头瘤病毒16型的感染中发挥着一定的潜在作用。不难看出，由于其在新生蛋白和错误折叠蛋白在内质网上的折叠和再折叠中发挥着关键作用，宿主蛋白PDI在病原感染中的功能逐渐成为一个研究热点。目前通过基于活性的蛋白质组学研究，已知二硫键异构酶在HCV的感染过程中出现酶活性的显著上调，尽管其蛋白表达并未出现变化。因此，二硫键异构酶可以作为最有希望的药物靶点之一特异抑制HCV的感染和复制。本发明设计和构建PDI干扰载体用于高效干扰二硫键异构酶基因表达，进而抑制HCV的复制，以达到治疗和减轻丙型肝炎相关疾病症状的目的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供人蛋白二硫键异构酶的mRNA干扰靶点，针对该靶点设计人工序列，并将该序列在干扰载体中进行表达获得小干扰RNA分子。因此本发明的目的也在于提供针对人蛋白二硫键异构酶基因的小干扰RNA分子，包含该小干扰RNA分子的表达载体以及由其转化的慢病毒表达载体，此外，由表达载体产生的、作为小干扰RNA分子前体的短发夹结构RNA分子也包含在本发明之中。
[0005]本发明另一个目的在于提供人蛋白二硫键异构酶的RNA干扰靶点在制备抗HCV感染中的应用。
[0006]为实现上述目的，本发明通过实验验证得到靶向人蛋白二硫键异构酶基因的小干扰RNA片段，其选自下述核苷酸序列:
SEQ ID NO:1: GGAATATACAGCTGGCAGAGA ；
SEQ ID NO:2: CAGTGACGTGTTCTCCAAATA ；
SEQ ID NO:3: GCTGTTCTTGCCCAAGAGTGT。
[0007]根据上述靶片段序列设计ShRNA的转录模板的正义链和反义链，最终得到干扰人PDI基因的shRNA的正义链和反义链。对应于靶序列SEQ ID NO:1的正义链如SEQ ID NO:4所述，反义链如SEQ ID NO: 5所示；对应于靶序列SEQ ID N0:2的正义链如SEQ ID N0:6所示，反义链如SEQ ID NO:7所示；对应于靶序列SEQ ID N0:3的正义链如SEQ ID N0:8所示，反义链如SEQ ID N0:9所示。
[0008]干扰人蛋白二硫键异构酶基因的shRNA的转录模板为SEQ ID N0:4和SEQ IDNO: 5,SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO: 7、或 SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 退火形成的双链 DNA。
[0009]上述shRNA的制备方法如下:
(I)将上述的RNA干扰靶序列及其互补序列用环状结构序列连接形成正义链，在正义链两端引入接头序列；所述的环状结构序列为TTCAAGAGA，5’端引入的接头序列为GATCC，3’端引入的接头序列为TTTTTTG。
[0010](2)根据步骤(I)所述的正义链获得其反义链，同时在其两端加入相应的接头序列；
(3)将步骤(I)与(2)制备的序列在TE溶液中退火，从而形成短发夹结构RNA。
[0011]进一步，本发明提供抑制人蛋白二硫键异构酶基因表达的RNA干扰载体，命名为pLVX-shRNAl-PDI，包括骨架载体和上述干扰人二硫键异构酶基因的shRNA的转录模板。
[0012]所述的人蛋白二硫键异构酶基因表达的RNA干扰载体的验证方法包括如下步骤:
(1)合成DNA片段SEQID NO: 10和SEQ ID NO: 11，并作为引物从人293T细胞中抽提RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增，克隆人蛋白二硫键异构酶基因，构建二硫键异构酶基因的真核表达载体pCMV-Flag-PDI ；
(2)将步骤(I)得到的pCMV-Flag-PDI与上述的小干扰RNA表达载体pLVX-shRNAl-PDI共同转染至293T细胞中，培养48h ；
(3)收取步骤(2)共转染的细胞以PBS溶液洗两遍，以RIPA裂解液裂解细胞蛋白，以抗Flag标签抗体进行免疫印迹检测RNA干扰组和对照组中PDI蛋白的表达情况；结果表明，上述构建的RNA干扰载体可以在293T细胞中高效表达，使人蛋白二硫键异构酶基因表达量显著降低，达到抑制PDI基因表达的目的。
[0013]转染上述的人蛋白二硫键异构酶基因表达的RNA干扰载体进入真核细胞内(Huh7.5.1细胞)，并在真核细胞内表达相应的小分子干扰RNA，干扰二硫键异构酶基因的表达，24h后感染HCV病毒，再培养72h后，取培养上清，进行培养上中HCV滴度的TCID50测定;
结果表明:与转染对照质粒相比，转染人蛋白二硫键异构酶基因的RNA干扰质粒，使HCV的病毒滴度出现降低。从而可以将上述人蛋白二硫键异构酶基因表达的RNA干扰载体用于降低PDI表达，达到抑制HCV复制的目的。
[0014]本发明中所得到的三个干扰PDI基因表达的干扰质粒具有在细胞高效干扰PDI基因表达的能力，为进一步研究PDI基因的生物学功能提供有效和可罪的研究工具，同时为将来基于PDI基因的抗HCV治疗药物的开发提供了可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本发明中干扰组和对照组的Western blot检测结果示意图；图中:1为PDI+pLVX-shRNAl-CTRL ;2 为 PDI+ pLVX-shRNAl-Ι ;3 为 PDI+ pLVX-shRNAl-2 ;4 为 PDI+pLVX-shRNAl-3 ；5 为 Protein marker。
[0016]图2是本发明中HCV感染的二硫键异构酶RNA干扰组和对照组Huh7.5.1细胞的培养上清中的病毒滴度结果；图中:shPDI是指人蛋白二硫键异构酶的RNA干扰载体，即pLVX-shRNAl-PDI ；shCTRL 为对照干扰载体。
【具体实施方式】
[0017]以下结合附图和实施例来进一步阐述本发明的具体内容，本实施例是在人293T细胞和Huh7.5.1细胞中进行，利用同样的方法所构建的特异性靶向人PDI基因的小分子RNA干扰载体，及其在人丙型肝炎的抗病毒治疗中的应用，也应视为本申请的保护范围，本实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用试剂如无特殊说明的，均为常规市售试剂。
[0018]实施例1:针对PDI基因的RNA干扰质粒载体的构建
1.1表达PDI基因ShRNA的寡核苷酸序列的设计与合成
登录Genebank，检索PDI基因P4HB的mRNA编码序列全长，基因序列号为G1:121256637,将序列录入在线数据库siRNA Wizard v3.1寻找siRNA的祀位点，设计干扰发卡序列及对照序列，在序列两端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点，提交上海生工公司进行合成，三对 shRNA，暂命名为 pLVX-shRNAl-1、pLVX-shRNAl-2 和 pLVX-shRNAl-3。
[0019]1.2寡核苷酸序列的退火
将合成的RNA干扰寡核苷酸片段干粉在12000 rpm离心30 S，加入适量无菌超纯水进行溶解，并用TE溶液进行进一步的稀释，使寡核苷酸溶液浓度达到100 μ M，用于退火反应溶液。将配制好的退火反应缓冲液进行混合，短暂离心后放置PCR仪上，用以下程序进行退火:90°C 5 min,70°C 10 min,55°C 10 min,40°C 10 min,25°C 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用进行连接反应，或者在_20°C长期保存。
[0020]反应体系如下: 正义寡核苷酸(100 μ M) 5yL 反义寡核苷酸(100 μ Μ) 5μ L 加TE溶液补足至50 μ L
用水将退火后的寡核苷酸稀释100倍使用。
[0021]1.3寡核苷酸与载体的连接
用BamH I和EcoR I双酶切2 μ g pLVX-shRNAl载体质粒，酶切方法和体系参考说明书进行。将寡核苷酸与双酶切的PLVX-shRNAl载体按照以下体系进行16°C连接过夜。连接反应体系如下:
T4 DNA连接酶 5U 双酶切载体2 μ L
稀释后寡核苷酸 2yL 10 X 连接酶 Buffer I μ L 加水补足至1yL
1.4质粒的测序验证
连接产物的转化和挑斑均按常规方法进行，质粒转化菌送上海生工进行测序验证，完全符合设计要求，无碱基突变。shRNA编码序列和设计序列完全一致，表明已成功构建ΗΠ表达干扰shRNA表达载体pLVX-shRNAl-PDI。
[0022]实施例2:免疫印迹法检测PDI表达质粒与PDI基因的RNA干扰质粒共转染细胞中PDI的表达水平验证RNA干扰效果
2.1 PDI基因的克隆及真核表达载体构建
从NCBI数据库检索人PDI基因序列，以Primer Premier 5.0软件，设计引物，引入Hind III和I酶切位点。以Trizol对人源293T细胞进行裂解，抽提细胞RNA，再以随机引物Oligo(dT)进行反转录，获得cDNA。以合成的引物SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11进行 PCR 扩增 PDI 基因，扩增程序为:94°C 3min ；94°C 30s，62°C 50s，72°C 30s，30 个循环；72°C延伸7min。将PDI基因的PCR产物进行胶回收后，与pCMV_Flag质粒分别同时以III和I双酶切，线性化的质粒与PDI基因的双酶切产物均进行胶回收，再在16°C条件下连接过夜，转化感受态细胞，挑斑，放大培养，对菌液PCR阳性的克隆进一步送上海生工测序分析。结果表明序列无突变，无移码，成功将PDI基因克隆至载体pCMV-Flag，构建pCMV-Flag-PDI真核表达载体。以超纯质粒抽提试剂盒(Qiagen公司)提取不含内毒素的超纯质粒，备用。
[0023]2.2 PDI真核表达载体及其RNA干扰载体的共转染
转染前一天，以不含双抗的DMEM培养基将生长状态良好的293T细胞铺至六孔细胞培养板中，待细胞生长至融合度约80-90%时，参考Invitrogen产品说明，取2 μ gpCMV-Flag-PDI与2 μ g pLVX-shRNAl-PDI,以针对TLR3基因的RNA干扰载体同步以脂质体Lipofectamine 2000 Reagent转染,作为对照。转染6小时后，更换新鲜含1%新生牛血清的DMEM培养基进行维持培养48h。
[0024]2.3免疫印迹检测PDI表达情况
将转染后培养48h的细胞以PBS洗两遍，以RIPA细胞裂解液于冰上裂解细胞20min，再将蛋白裂解物以12000rpm离心15min，取上清以80V 40min和120V 1.5h进行SDS-PAGE电泳和转印NC膜。以5%脱脂奶将转印蛋白的NC膜封闭lh，再与抗Flag标签抗体孵育2h，洗涤后，与HRP标记的羊抗鼠二抗孵育lh，以PBST洗涤5遍后以高灵敏度化学发光底物SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce 公司)进行化学发光显色。结果表明，三个干扰载体均可较好的干扰PDI基因的表达，其中I和3效果最好。结果见图1。
[0025]实施例3:PDI基因干扰对HCV复制的影响
3.1 RNA干扰法分析
以含10%胎牛血清的DMEM培养Huh7.5.1细胞，提前一天以不含双抗的DMEM培养基将细胞接种至六孔细胞培养板中，使细胞密度达到106。次日将提取的不含内毒素的超纯质粒pLVX-shRNAl-PDI,以脂质体 Lipofectamine 2000 Reagent 转染 Huh7.5.1 细胞，具体步骤参考Invitrogen产品说明。转染6小时后，以MOI值=1的比例接入HCV病毒，培养72h，收集培养上清，采用TCID50法测定上清中病毒滴度。
[0026]3.2 病毒 TCID50 测定
病毒滴度采用96孔细胞培养板进行测定。将感染细胞培养上清以8000 rpm,5 min进行离心，以除去杂质和细胞碎片，以细胞维持液(含2%血清的DMEM培养基)进行10倍梯度稀释，接种于长至80-90%汇合度的Huh7.5.1单层细胞中，每个稀释倍数设6个重复孔，感染72 h后，弃去上清，以固定液(甲醇/丙酮=1:1)于-20° C固定20 min。HCV感染的Huh7.5.1细胞再以本实验室研制的HCV核心蛋白多克隆抗体(1:1000)进行标记，以FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗(1:200)进行间接免疫荧光测定，记录各孔的阴性和阳性情况，按照Reed-Muench法进行计算，得到培养上清中HCV感染性病毒粒子的TCID50数量。结果表明，PDI基因的RNA干扰，使得HCV的复制受到一定程度的下降。结果见图2。
[0027]上述结果说明，本发明中涉及到的三个针对PDI基因的干扰质料载体均能够有效抑制PDI基因的表达，这为进一步研究_■硫键异构酶基因的生物学功能提供了有力的研究手段，同时也为将来针对PDI基因的相关基因治疗药物的开发，特别是抗HCV感染提供了可倉泛。
【权利要求】
1.靶向人蛋白二硫键异构酶基因的小干扰RNA，其选自下述核苷酸序列:
SEQ ID NO:1: GGAATATACAGCTGGCAGAGA ；
SEQ ID NO:2: CAGTGACGTGTTCTCCAAATA ；
SEQ ID NO:3: GCTGTTCTTGCCCAAGAGTGT。
2.针对人蛋白二硫键异构酶基因的shRNA，其为:SEQID N0:4和SEQ ID NO: 5,SEQ IDNO:6 和 SEQ ID NO:7、或 SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 退火形成的双链。
3.含有权利要求2所述shRNA的小干扰RNA表达载体。
4.权利要求1所述的小干扰RNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3所述的小干扰RNA表达载体在制备抗HCV感染的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/7088GK104388430SQ201410595604
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】张金阳, 叶承金, 宋玉竹, 韩芹芹, 夏雪山 申请人:昆明理工大学