一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法

专利名称：一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法
技术领域：
本发明涉及贝类的制种技术，特别提供了一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法。
背景技术：
贝类多为雌雄异体型，少数种类为雌雄同体型，也有一些种类的性别是不稳定的。雌雄异体型贝类在物种水平上表现为雌雄异体，即正常情况下一个个体仅拥有雌性或雄性中的一种类型的生殖腺，生殖腺发育成熟后一个个体仅能产生雌性(卵子)或雄性(精子)中的一种配子；雌雄同体型贝类在物种水平上表现为雌雄同体，即每一个个体在生殖腺发育阶段均同时具有雌性和雄性等两种类型的生殖腺，生殖腺发育成熟时每一个个体都可以产生雌性与雄性两种配子。
在瓣鳃纲中，仅扇贝属中的大扇贝、海湾扇贝等少数种类为雌雄同体型物种，瓣鳃纲中的绝大多数贝类为雌雄异体型，如魁蚶、贻贝、虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎、菲律宾蛤仔等均为雌雄异体型贝类。腹足纲中雌雄同体型贝类相对较多，但行体外受精的大多数种类也是雌雄异体型动物，如所有的鲍科动物均为雌雄异体型。
雌雄异体型贝类中偶尔可发生雌雄两种生殖腺组织同时出现于一个个体的特殊现象，即雌雄同体的特殊现象。具体表现为在生殖腺发育成熟时，在同一个个体的生殖腺中既有雄性的生殖细胞也有雌性的生殖细胞。在雌雄异体型贝类中出现上述雌雄同体的特殊个体的概率依物种不同而有较大的差异其中牡蛎、贻贝、珍珠贝出现雌雄同体的概率相对较高，在其他雌雄异体型贝类中则很少见，在皱纹盘鲍、栉江珧、虾夷扇贝、栉孔扇贝、西施舌、波纹巴非蛤等物种中虽有报道，但雌雄同体现象均作为相应物种的非正常的特例进行讨论。同时，所有这些在雌雄异体型贝类中发现的具雌雄同体现象的个体都是在处死研究对象后通过组织学方法观察到的。目前在所有雌雄异体型贝类中均未见在活体情况下发现雌雄同体个体的报道。
目前，理论上有两种方法可用于生物纯合体的快速培育其中基因纯化速率最快的是雌核发育或雄核发育，只需要一代就可以达到基因组的高度纯合，但目前对贝类的雄核发育研究尚无报道，对贝类的雌核发育虽有一些研究，但在技术方面难度很大，目前尚不能在实际研究中进行应用。
另外一种方案是近亲繁殖，包括自交、全同胞交配、半同胞交配、回交等多种交配策略。其中，近亲繁殖中亲缘关系最近的交配方式是自交，生物每自交一代可以使目标基因的纯化速率达到50％，只需自交六代就可以使目标基因的纯合性达到0.984。自交的基因纯化速率远远快于其它的近交方式，因此自交技术可以实现基因的快速纯化、在生物育种中具有非常重要的作用。然而按现有的技术，自交只能应用于雌雄同体型生物。
考虑到海水贝类为低等生物，即便是雌雄异体型的贝类也可能会发生性逆转或雌雄同体等特殊情况，如此就有可能将自交的策略应用于这些物种的雌雄同体特殊个体中。
在可能发生性逆转的雌雄异体型贝类中，使用配子(精子或卵母细胞)冷冻保存的方案建立自交系是可以尝试的一种方案。即在某个体达到性成熟时，对其进行催产并使用配子冷冻技术保存其配子，然后对该个体继续进行培育，当自然发生、或通过人工的方法进行物理或化学的诱导使其成为不同于配子冷冻时性别的另一种性别并达到性成熟时，则再次设法获得其配子(卵母细胞或精子)，使新获得的配子与冷冻保存的另一种性别的配子受精，则可以建立自交系，在该方案中需要使用配子冷冻保存和解冻技术，并且人工定向控制的性逆转目前还没有实现，所以实施这种方案尚需要解决相当多的技术难题。
在雌雄异体型贝类中，如果可在活体情况下事先发现雌雄同体的特殊个体，则可以通过有计划的人工繁殖和培育方案，使同一个亲本的雌、雄配子受精而建立和培育自交系，实施该方案的关键在于需要事先在活体情况下发现这些物种中雌雄同体的特殊个体。因为除部分牡蛎和珍珠贝外，其余的贝类只有通过亲本在活体条件下产卵的过程所获得的卵子才有活力，才有与同种的精子受精的能力并正常发育；换言之大多数贝类通过解剖的方法获得的卵子没有受精或正常发育的能力。因此只有在活体情况下发现的雌雄同体个体才有可能实现自体受精而建立自交系。但是，目前在所有雌雄异体型贝类中均未见在活体情况下发现雌雄同体个体的报道。
皱纹盘鲍、虾夷扇贝和栉孔扇贝等都是典型的雌雄异体型贝类，尚没有性别逆转的报道，也没有发现雌雄同体活体的报道。通过BA和ASFA检索，在皱纹盘鲍中，仅我国刘永峰等报道于1982年发现一例雌雄同体个体；在栉孔扇贝中，仅我国廖承义等报道从241个标本中发现一个雌雄同体的个体；在虾夷扇贝中，日本的丸邦义等也发现了雌雄同体现象。上述三个物种所报道的雌雄同体现象均未能在对生殖腺的外观进行肉眼观察而发现，均是在以石蜡切片为手段进行的组织学研究中发现和证实的。
正常情况下，雌雄异体型贝类的每一个个体中仅具有雌性或雄性生殖腺中的一种，并且发育成熟的生殖腺色调均匀、手感柔软。大多数雌雄异体型贝类的生殖腺在雌性与雄性两种不同性别的个体之间存在十分显著的、肉眼可见的颜色差异，当生殖腺发育到一定程度后从外观上用肉眼即可分辨其为雌性或雄性个体。贝类雄性个体的生殖腺一般为乳白色，而雌性个体的生殖腺则颜色较多。比如双壳纲的贻贝目、珍珠贝亚目中雌雄异体种类的雌性生殖腺成熟后依不同物种可呈现橘红色、橙黄色、褐红色、粉红色等颜色，另外一些物种如腹足纲的鲍科动物中，比如皱纹盘鲍的雌性生殖腺则为墨绿色、九孔鲍的雌性生殖腺为紫褐色，上述贝类的雄性生殖腺全部为乳白色。
近年来本发明申请人在皱纹盘鲍、虾夷扇贝和栉孔扇贝中陆续发现了生殖腺异常的个体，其生殖腺形态正常，外观饱满、手感柔软，但特殊之处在于生殖腺的颜色不均一，即同一个体的生殖腺表面同时具有该物种的雌性与雄性两种生殖腺的颜色，该现象与上述物种雌雄异体的正常个体中的生殖腺显著不同，本发明申请人经研究发现上述生殖腺异常的个体是雌雄同体的特殊个体，这是在上述三个物种中通过肉眼对生殖腺的外观进行观察后首次获得的雌雄同体的活体。但没有发现有人利用上述物种中所获得的雌雄同体的活体建立自交系，本发明申请人经多年研究后，终于成功研发完成本件雌雄异体型贝类中建立自交系的方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种在雌雄异体型贝类中建立自交系的方法。
本发明的技术方案如下本发明建立雌雄异体型贝类自交系的策略为从雌雄异体型的贝类中选择出同时具有雌雄两种生殖细胞的、即雌雄同体的特殊个体，采用自交的策略建立和培育自交系；其中所述雌雄异体型贝类指其生殖腺的颜色或形态在同一物种的雌性与雄性之间具有可在活体情况下通过肉眼观察分辨其性别的差异；所述同时具有雌雄两种生殖细胞的雌雄异体型贝类中的特殊个体指其生殖腺发育后，从生殖腺的外观上由肉眼可辨认出该个体同时具有雌、雄两种颜色或形态的生殖腺。通过对生殖腺表面颜色的观察，选择以雌性生殖腺为主、雄性生殖腺面积较小的个体用作本发明的亲本以表面积计，雄性生殖腺占生殖腺总面积的比例小于、等于30％，至少在肉眼观察中可见具有雄性生殖腺即可。本发明所用雌雄同体的亲本是通过如下方法筛选出来的在雌雄异体型贝类的生殖腺发育至成熟期后，逐个检查每个贝的生殖腺，仔细观察生殖腺表面的颜色，如果一个个体的生殖腺表面同时出现该物种的雌性与雄性两种生殖腺的颜色，则初步确定该个体为雌雄同体的特殊个体，将该个体取出进行单独培育，按生殖腺发育情况对选出的雌雄同体个体继续培育至生殖腺发育成熟后用于建立自交系。上述具有雌雄同体特征的亲本可以从自然生活的、未经人工诱导处理的贝(包括海区野生和人工养殖的贝)中查找，也可以通过人工的物理或化学处理而诱导其产生雌雄同体现象。
所述采用自交的策略建立和培育自交系是指将每个亲本在相互隔离的条件下独立催产并使同一个亲本所产的雌雄配子进行自体受精，然后按该物种的常规技术进行胚胎孵化、幼虫培育及养成，在操作过程中采取常规的隔离措施，避免自交系以外的个体混入其中。
其操作步骤如下采用阴干刺激、温度刺激和紫外线刺激等方法进行催产在亲本阴于20～40分钟后将每个亲本单独放入一个容器中进行催产，每个容器中事先加入比亲本的原培育水温提高3～5℃、经过紫外线照射处理的过滤海水。密切观察亲本排放雌雄配子的情况，如果亲本入水后30分钟内尚未排放性产物，则每30分钟左右更换1次催产的海水，直至有性产物排出。使同一个亲本的卵子与精子受精，避免其他亲本的配子混入。
针对雌雄两种生殖腺的相对比例在不同亲本之间差异悬殊的具体情况，本发明在催产和受精过程中采取下述措施人为增加或减少精子数量以对水体中雌、雄两种配子的相对比例进行人工干预和调节对于雄性生殖腺比例过低的亲本在正常催产后采取局部解剖的方法增加水体中的精子量以提高受精率；反之，对于雄性生殖腺比例过大的亲本则注射5-羟色胺促使大部分的精子先行排出体外以降低与卵子同步排放的精子量。具体为雄性生殖细胞过少的情况如果一个个体的雄性生殖腺表面积小于、等于该个体生殖腺表面积总和的0.5％，则雄性生殖腺的相对面积过小，催产时排放的精子总量较少。按照常规方法催产后用显微镜观察，如果超过10％的卵母细胞周围没有观察到有精子附着在卵膜外，则卵子周围的精子数量不足。当确认精子数量不足时，在常规催产结束后对亲本雄性生殖腺所在部位进行局部解剖，然后将通过解剖方法获得的精液适量加入到该个体通过常规催产正常排放的性产物中用新鲜海水将精液稀释至较淡的乳白色(每毫升含精子107～108个)，然后分数次、每次取10～50毫升稀释精液加入到含相同亲本的卵子及受精卵的水体中，加入精液时同步小心搅动水体，3～5分钟后取样于显微镜下观察，到98％以上的卵子外周可观察到至少有一个精子时停止加入精液。该方法同样适用于有些在催产时精子的排放量较少以至水体中精子数量不足的亲本。
雄性生殖细胞过多的情况雄性生殖腺的表面积超过该个体生殖腺表面积总和15％的个体，是雄性生殖腺相对面积过大，催产后水体中的精子将严重过量，显微镜下观察一固定焦距平面上每个卵母细胞周围的精子数可达到数十个甚至上百个，在这种情况下必须降低水体中的精子量。本发明采用注射5-羟色胺的方法解决精子过量的问题在亲本阴干刺激后给每个种贝注射5-羟色胺溶液100～200μl，5-羟色胺溶液用经孔径0.22μ的微孔滤膜过滤的无菌海水配制，浓度为20～500μmol/L。然后在比原培育水温提高3～5℃的紫外线照射海水中催产，亲本在入水20～40分钟左右开始排放精子，但是在该阶段不排放卵子。将每个亲本的精液分别用烧杯保留200～500毫升备用，使用时用新鲜海水稀释活化，放弃其余的精液并对亲本和催产容器反复进行换水和冲洗以尽量去除精子。亲本在入水后2.5～9个小时内有2～4次呈脉冲式排放卵子的过程，同时有精子排出但数量显著减少。在每次排出卵子后迅速收集排放的性产物，立即观察卵子周围的精子数量，如果水体中的精子数量不足，可分批加入预先保留的精液的稀释液；当显微镜下平均每个卵母细胞周围一个焦面的精子数量超过10～12个时须立即用大量的干净海水稀释或洗卵。对于雄性生殖腺的表面积为该个体生殖腺表面积总和10～15％的个体，则采用上述注射5-羟色胺的方法可以获得比自然催产法更好的效果，可以显著降低卵子周围的精子数量。
除上述两种解决方案外，也可依照雌性与雄性生殖腺表面积之比值情况，通过控制催产和受精的水体、受精时间等措施小范围调节每个亲本所产的卵子与精子间的相对比例，及时用显微镜观察水体中的精子量，尽量将一固定焦面上每个卵母细胞周围的精子数控制在10个以内。其基本原则如下当生殖腺表面的白色区域(雄性生殖腺)面积较小(雄性生殖腺的表面积占该个体生殖腺表面积总和的3％以内)，则采取较小的水体(10～20升)进行催产、受精，并使用较长的受精时间(20～40分钟)；白色区域的表面积较大(雄性生殖腺的表面积超过该个体生殖腺表面积总和的6％)，则采用较大(60～150升)的催产和受精水体、配子排出后尽快稀释或洗卵。
本发明具有如下优点本发明利用雌雄异体型贝类中的特殊变异个体建立自交系，可加快雌雄异体型贝类的基因纯化速度，快速淘汰隐性致死基因，大大加快雌雄异体型贝类的品种选育速度。本发明操作简便、不使用特殊的化学试剂、不需要特殊的设施，容易推广应用。本发明可应用于雌雄异体型贝类中所有在活体情况下能通过肉眼观察直接识别确认为雌雄同体的个体。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1虾夷扇贝是典型的雌雄异体型贝类，其生殖腺发育后呈牛角状，雌性生殖腺为橘红色、雄性则为乳白色，虾夷扇贝的性别从生殖腺的外观上很容易分辨。
某年2月对大连长海县海域生殖腺发育成熟的养殖12230个虾夷扇贝进行调查，从中发现了81个具有雌雄同体特征的虾夷扇贝。这些虾夷扇贝壳高10～13cm并且具有一个共同的特征即每一个个体的生殖腺中均同时存在橘红色与乳白色两种颜色的区域，其中乳白色区域的表面积之和在生殖腺表面积总和中所占的比例变动范围很大，从0.1％到80％左右不等，两种颜色的生殖腺组织彼此相嵌，但两种颜色之间界限清晰、分明。选择雄性生殖腺表面积比例不同的个体为亲本进行人工催产、授精、培育等繁殖操作，具体操作过程如下1)亲本暂养对上述具有雌雄同体特征的虾夷扇贝的壳表面进行清理，小心去除壳表面的附着物并洗刷干净后于5℃水温(自然水温)暂养3小时，于当天建立自交系。
2)亲本选择从性腺发育成熟的雌雄同体虾夷扇贝中，根据雄性生殖腺(乳白色区域)比例不同选取十个个体作亲本进行催产并自体受精，建立十个自交系H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10。其中H10自交家系的亲本生殖腺中乳白色区域所占比例最大，达到50％，即生殖腺表面一半的区域为乳白色，其余部分为红色；H2亲本次之，乳白色面积占生殖腺面积总和的15％；其余亲本生殖腺中乳白色区域所占比例较低，均低于3％(见表1)。H10和H2亲本的乳白色区域散布于整个生殖腺的各个部位，其他八个亲本的精巢分布则有一个共同特点即乳白色区域主要分布在扇贝靠近腹缘部位的生殖腺中，即分布于生殖腺角状部的尖端或离尖端附近不远处的侧缘部位。
3)催产、受精、孵化用过滤海水刷净种贝的壳表面、在室温条件下阴干30分种，每个亲本单独放入到一个20升的塑料桶中催产，每个桶之间的距离保持在一米以上。桶中事先加入15升、预热至10℃的紫外线照射过滤海水，在入水后30分钟更换1次紫外线升温海水。亲本入水后密切注意配子排放情况，尤其注意观察并记录精子的排放量，按照水体中的精子量及时采取措施。入水后一个小时内，所有十个亲本均大量排放配子，每个亲本排放的配子中都同时含有卵子(卵母细胞)和精子，卵子在排出后很快与相同个体的精子受精。显微镜下观察所有十个雌雄同体虾夷扇贝所排放的生殖细胞，外观上与雌雄异体虾夷扇贝的配子无显著差异，精子活力强、活泼运动，卵子细胞质内卵黄颗粒大而明显，分布均匀，卵细胞直径约75μm。
其中，除H10和H2外的八个亲本的性产物中精子浓度较低，每个卵子周围的精子数少于5个，因此操作较简单，在2次脉冲式排放卵子后即结束催产，将亲本从桶中取出即可。排放的性产物在催产的水体中维持40分钟，期间小心搅拌5次以使卵子处于悬浮状态并有充分的机会与精子接触。然后将受精卵直接用新鲜海水稀释后进行孵化培育，孵化水温8℃、密度控制在每毫升40个，中间不采取洗卵等措施。
对于H10和H2等雄性生殖腺面积比例较大的两个亲本而言，催产时采取一些如下措施即利用贝类的配子呈脉冲式排放的特点，对每次的排放产物分批收集、处理，在每次配子排放后，立即将排放产物转移到一个预先做好标记的干净的120升大桶中用新鲜海水进行稀释，在形成受精膜后立即洗卵以除去水体中多余的精子，同时用新鲜海水冲洗亲本和催产容器后重新加入紫外线照射的升温海水使其继续排放。注意标记每个亲本的排放产物，视受精情况决定各批受精卵的弃留，最后将保留的同一个亲本所产的各批卵子进行合并。其中共收集H2亲本的五批排放产物，第一、三批性产物在显微镜下可见一个焦面上平均每个卵母细胞周围的精子数分别是12个和15个，第二、四、五批的平均精子数则达到20、35和31个。收集其中精子数量相对较少的第一和第三次排放产物，合并后稀释到每毫升40个进行孵化培育。H10亲本共排放了三次，各次排放产物均主要是精子，每次排放后水体均呈乳白色，精子密度特别大，运动非常活跃，卵子数量较少，三次排放的卵子总和不到9万，显微镜下可见每个卵母细胞均被大量精子紧密包围，每一个固定焦面上的精子数都达到百个以上，精子在卵母细胞外排成三层，所有的卵子均因精子太多而使卵膜溶失，无法统计受精率。经洗卵后合并三次排放产物，在每毫升40个的密度下进行孵化培育后H10家系未检到D形幼虫，说明生殖腺中乳白色(精巢)部分的面积过大则精子产量过多，卵子无法正常孵化。其中将H10的精子对一个雌雄异体的正常的雌性虾夷扇贝F1的卵子进行人工授精，则受精率和孵化率分别为100％和85.28％(表1)，说明H10亲本的精子具有正常受精和孵化的能力，即H10所产配子在功能上是正常的。
各自交家系所获卵量在120～400万之间，当受精卵发育至二细胞时，统计受精率，结果见表1，其中H10家系的受精率无法统计、孵化率为零，H2家系的受精率和孵化率分别为68.91％和24.26％，其余八个家系的受精率在92.4％～100％之间，在D形幼虫阶段统计孵化率在5.86％～76.25％之间。
4)幼虫培育、采苗和稚贝培育当胚胎发育到D形幼虫上浮后，用200目筛绢选出。培育密度每毫升8个幼虫，培育水温15℃，各家系培育条件完全相同。用金藻作开口饵料，培育五天后加投硅藻，日投饵4次，喂饵时，轻轻将饵料投入，避免培育水体溅出。每天全量换水一次，每5天倒池一次，在换水过程之中，严格做好每个家系之间的隔离工作，避免其他家系的幼虫混入。在40％幼虫出现眼点时，投放聚乙烯网帘作附着基进行采苗。变态后的稚贝按照摄食情况增加投饵量，每日分别半量和全量换水一次。在变态后第10天开始从网帘上取样观察测定稚贝的数量和生长速率，结果自交家系H1～H9均获得了一定数量的稚贝，投附着基30天时统计的稚贝数见表1。
表1 虾夷扇贝各自交家系的培育参数乳白色 卵量受精率孵化率稚贝数家系区域面积(％) (万个)(％) (％) (个)H10.7220 94.4076.25 24000H215 120 68.9124.26 8600H30.8260 93.4773.19 14100H40.9350 96.6736.23 86000H50.6180 92.4213.33 7900H60.8260 100.029.03 20900H72.6400 95.8311.74 16000H80.8360 95.675.86 3800H91.5210 100.021.74 11300H1050 8.7 /0 /F1×H10/ 300 100.085.28 /P / 500 92.1240.25 182000注P组是以雌雄异体的、生殖腺外观正常的虾夷扇贝进行群体催产和人工授精建立的对照组；稚贝数量是投附着基后30天统计的数据。
上述繁殖实验证明，所有生殖腺表面同时具有橘红色和乳白色两种颜色区域的虾夷扇贝均为雌雄同体，而所有雌雄同体的虾夷扇贝所排放的配子均有正常受精和发育的能力，即其精子和卵子在功能上均正常，证明雌雄同体的虾夷扇贝通过自交的途径可以建立和培育自交家系。
实施例2具雌雄同体特征的、乳白色区域面积较大的虾夷扇贝从海上取回后，小心去除壳表面的附着物并洗刷干净，用沙滤海水暂养12天，期间投喂三角褐指藻等单细胞藻类为饵料，每天换水两次，每次1/2，每三天全量换水一次，暂养水温6℃。
H2、H23、H24、H10是乳白色区域面积较大的雌雄同体的虾夷扇贝，其乳白色区域表面积占生殖腺表面积之和的比例分别是15％、20％、30％、50％，其中的H2和H10与实施例1相同，经过促熟培育后备用，培育水温6℃。建立自交家系的操作过程与实施例1基本相同，其主要的不同点在于本实施例对亲本注射5-羟色胺以促使大量的精子先于卵子排放出去，如此有效减少了水体中的精子数量，较好地解决了水体中精子数量过多的问题。具体操作过程如下在阴干处理30分钟后，分别对上述四个雌雄异体的虾夷扇贝注射20～500μmol/L的5-羟色胺100～200μl(见表2)，然后在升温至10℃的紫外线照射海水中催产，催产容器为60升水桶。入水后20～40分钟内四个亲贝相继开始排放精子，分别用烧杯保留500毫升每个亲本第一次排放的精液以备后用，放弃其余的精液并对亲本和催产容器反复进行换水和冲洗，此后每次排放精液后均冲洗亲本和容器。四个亲本排放精子的时间分别持续40～60分钟，入水后2个小时，均未再见单独排放精子的情况；此后，每30分钟更换一次新鲜海水并冲洗亲本和容器，在入水后的2.5～9.0小时内，上述四个亲本分别出现脉冲式排放卵子的现象，但精子数量显著减少。分批收集各次排放的卵子，视精子数量决定是否立即洗卵或需要补加精液，当精子数量过多、平均每个卵子周围可观察到10个或更多的精子时需要尽快稀释或洗卵；当精子数量过少，即平均每个卵子周围可见精子仅1～2个时，需补加相同个体的稀释精液。其中H2的亲本2次排卵，第一次排放的产物因水体中精子数不足，故补加一次H2亲本排放的精液取事先保存的精液用新鲜海水稀释10倍后取10ml加入到受精水体中，合并两次排放的卵子进行孵化；H23共排卵四次，第四次排出的性产物中精子过量，放弃该批卵子，合并前三批卵子进行孵化；H24排出的三批卵子均精子过量，分别稀释至150升，然后进行洗卵后合并保留前两批卵子进行孵化，放弃第三批。H10共排卵三次，显微镜下可见平均每个卵母细胞外的精子数量分别为15～22个，分别进行洗卵后合并三批的卵子进行孵化。
合并同一亲本的受精卵进行孵化与培育，孵化和培育条件与实施例1相同，结果四个亲本排放的雌雄配子都顺利完成自体受精、除H10外的其余三个亲本都获得了平均壳高600μm的稚贝。
H10排放的卵子总数不足5万个，每个卵子周围的精子数量三批分别是22、15、20个，卵周围的精子量比未注射5-羟色胺而直接催产时显著减少。H10因卵子数量不足，获得D形幼虫量很少，无法继续培育而放弃。
表2 虾夷扇贝注射5-羟色胺及配子排放情况精巢面积5-羟色胺浓度 注射 排精时间 排卵时间排卵每批卵精子数家系(％)(μmol/L) 用量(μl) (分钟)(小时) (批)1 2 3 4H21550200 404.52 2 4H232020200 353.04 8 6 9 14H243050100 202.53 12 14 18H1050500 100 309.03 22 15 20注排精和排卵时间均为精子和卵子的首次排出时间；精子数指显微镜下每一个卵母细胞周围的一个固定焦面上的精子数。
多数的海水贝类行体外受精。在现有技术中，体外受精时水体中精子数量过少将影响受精率；反之受精时卵子周围的精子数量过多则将严重影响孵化，可显著增加畸形胚胎和幼虫的比例，甚至导致卵膜溶破。受精时雌雄两种配子间的适宜比例在不同贝类之间有所不同，但一般以显微镜下观察平均一固定焦面上卵母细胞周围有3～6个精子为宜，皱纹盘鲍的卵子对精子数量相对不敏感，可容忍较多的精子，以一个卵子外周一个焦面上见到5～8个精子较为合适、10～15个精子也不至于影响孵化。本发明实施例1中，在未采取注射5-羟色胺时，从H2亲本收集的五批排放产物其平均每批卵子周围的精子数分别达到12～35个，而本实施例采取注射5-羟色胺后，平均每个卵子外的精子数仅为2个和4个(表2)。本实施例说明采用注射5-羟色胺的方法有效地促使精子先行排出体外，使与卵子同步排放的精子数量显著减少，同时采用注射5-羟色胺的技术后，乳白色区域占生殖腺总面积大于该个体生殖腺表面积总和的15％、小于等于30％的亲贝可以获得自交后代。而乳白色区域达到50％的H10未获得稚贝是因为其排出的卵子数量过少，因此雄性生殖腺比例在30～50％范围内的亲本如果排卵量能达到30万以上，则通过注射5-羟色胺的方法也有希望获得自交后代。对于雄性生殖腺的表面积为该个体生殖腺表面积总和10～15％的个体(本实施例为15％)，则以采用注射5-羟色胺的方法效果为佳。
用流式细胞仪、电子显微镜、和石蜡切片技术对实施例1和2中的亲本H2、H10的生殖腺组织的不同部位分别进行了分析。所有分析结果都证明，其中的橘红色区域为雌性生殖腺组织、乳白色区域为雄性生殖腺组织，结构分别与正常的雌雄异体的雌性或雄性虾夷扇贝的生殖腺相同，在乳白色与橘红色区域的交界部位，可以观察到雌雄两种生殖细胞同时存在。
其中，用流式细胞仪检测雌雄同体虾夷扇贝的生殖腺中乳白色区域出现单倍体、二倍体、四倍体等三个峰，分别指示了成熟精子、次级精母细胞和初级精母细胞，与雌雄异体的、生殖腺外观正常的雄性虾夷扇贝的流检结果相同；雌雄同体虾夷扇贝的生殖腺中橘红区域的流检结果出现二倍体和四倍体等两个峰，分别指示了成熟的卵母细胞和卵原细胞，与雌雄异体的生殖腺外观正常的雌性虾夷扇贝的流检结果相同。对雌雄同体的虾夷扇贝生殖腺中乳白色区域的组织进行扫描电镜观察，发现精子结构与雌雄异体的生殖腺外观正常的雄性虾夷扇贝生殖腺中的精子结构无差异。用石蜡切片技术对雌雄同体的虾夷扇贝生殖腺中的橘红色、乳白色及两种颜色交界处的区域进行分析，发现其中的橘红色部位与正常的雌性个体的生殖腺组织完全相同、乳白色部位与正常的雄性个体的生殖腺组织完全相同、两种颜色的交界处则可以同时观察到雌雄两种生殖细胞。上述结果表明，外观同时具有虾夷扇贝的正常雌性(桔红色)和雄性(乳白色)两种生殖腺颜色的虾夷扇贝，是雌雄同体的个体，生殖腺中与该物种正常雌性个体生殖腺相同颜色(橘红色)的区域是卵巢所在部位，而与正常雄性个体生殖腺相同颜色(乳白色)的区域是精巢所在的部位，其雌雄两种生殖细胞共存并正常、同步发育。因此可以通过生殖腺外观颜色识别、确认出雌雄同体的虾夷扇贝特殊个体。
实施例3虾夷扇贝H30和H31是雄性生殖腺区域面积很小的虾夷扇贝，H30仅在生殖腺牛角状的尖端有一个乳白色斑点，雄性生殖腺面积占生殖腺表面积总和的0.1％，H31则在生殖腺的侧缘部位有一个近圆形的乳白色斑块，占生殖腺表面积总和的0.5％。常规催产的方法与实施例1基本相同，阴干30分钟后在10升预热的紫外线海水中催产，H30和H31分别在入水30和55分钟后开始排放配子。入水1.5小时后将种贝取出，小心搅动水体使卵子悬浮并有充分的机会和精子结合，10分钟后取样镜检发现H30仅50％的卵子周围可见到精子、H31则有85％的卵子周围可见到精子。
用解剖刀片小心将H30和H31生殖腺的白色斑点部位分别划开，用海水小心冲洗伤口部位并将冲出的精子分别接收在200毫升的烧杯中，反复重复上述步骤获得了肉眼可见略带乳白色的精液。将H30的精液分四次全部加入到含亲本H30正常排放的性产物中，每两次之间相隔3分钟，加入精液前后均需搅拌受精水体以免精子在水体中分布不均匀。H31的精液则稀释5倍后分三次每次取20毫升加入到H31正常排放的性产物中，每次间隔5分钟。在四细胞阶段统计H30和H31自交系的受精率分别为为96.7％和98.3％。
根据现有技术，贝类的卵子在完成受精后将会形成受精膜，在形成受精膜后则对水体中的精子不敏感，因此本实施例采取分批增加精液的措施可以避免精子过量造成的胚胎畸形等问题。
实施例4栉孔扇贝的生殖腺特征与虾夷扇贝非常接近，即生殖腺发育后呈牛角状，雌性生殖腺为橘红色、雄性则为乳白色，从生殖腺的外观上很容易区分其性别。同时栉孔扇贝的雌雄同体现象十分罕见。
某年5月在一个人工促熟的栉孔扇贝群体中发现了一个生殖腺颜色异常的个体，其生殖腺总体颜色为橘红色，整个生殖腺中散布星星点点的白色小点，点的直径在0.1mm左右，估算白色部分占生殖腺总面积的0.2％。将该亲本在阴干20分钟后，用23℃的紫外线照射海水催产，入水30和50分钟后分别更换1次紫外线海水，在后一次换水后10分钟开始排放配子。将该种贝所产的性产物均分成A、B两组，其中A组进行自体受精，不加入外源精液，显微镜下仅60％的卵子周围见到精子，精子数量严重偏低；B组则加入一个雌雄异体的雄性栉孔扇贝通过正常催产排放的精液，使平均每个卵子周围的精子达到4个。结果四细胞阶段镜检知A组的受精率为82.1％，B组则达到98.6％。上述结果说明生殖腺中同时含橘红色和乳白色两种颜色的栉孔扇贝是雌雄同体的特殊个体，而栉孔扇贝的雌雄同体个体所产的精子与卵子可以自体受精，并且其雌雄配子在功能上均正常。
实施例5皱纹盘鲍的生殖腺在发育后为牛角状，正常情况下雌雄个体可通过生殖腺的颜色很容易进行区分，其中雌性个体的生殖腺为墨绿色，雄性则为乳白色。
在经过人工培育达到性成熟的2300个皱纹盘鲍种鲍中共发现一个生殖腺发育良好、形态正常但生殖腺表面颜色不均一的个体，该个体编号为231号。231号皱纹盘鲍的生殖腺绝大部分区域为墨绿色，但在鲍体后端右侧部位的生殖腺中出现小面积的乳白色斑块，该乳白色块状组织呈近长方形，表面积占生殖腺表面积总和的5％。该种鲍采自日本宫城县海区，经人工促熟培育积温达1400°D时进行催产，时体长10.8cm、生殖腺丰满。种贝的促熟培育水温为20℃。
按常规生产方法对该亲本进行人工催产阴干40分钟后，将231号种鲍单独置于一个鲍鱼产卵槽中，加入20升预先升温至23℃并经过紫外线照射600mW.h/L的海水中，40分钟后更换一次紫外线照射的23℃海水。在种鲍入水50分钟后开始排放卵子和精子，排卵时间持续1.5小时，共排放卵子3万粒。取出种鲍，在此后1小时内每10分钟轻轻搅动一次水体使卵子处于漂浮状态，然后按常规步骤进行孵化和幼虫培育。
共获得后期匍匐幼虫400个，在显微镜下观察取出其中的42个形态正常、健康活泼的幼虫进行采苗。采苗在10升的鲍鱼孵化缸中进行，在孵化缸的壁上事先附着上底栖硅藻，将选出的42个后期匍匐幼虫转入到此缸中，以孵化缸的壁为采苗器直接采苗。此缸置于20℃室温下，静水培养，每日全量换水1次。三个月后获得成活幼鲍三个，将其剥离下来转到黑色波纹板上在一个单独的网箱中按照常规方式养殖。该三个个体培育至次年4月，壳长分别达到1.6、1.7和2.1cm。说明，生殖腺外观同时具有墨绿色和乳白色两种颜色的皱纹盘鲍是雌雄同体的个体，其雌雄配子可以通过人工催产而同步排出，并且雌雄同体的鲍可以通过自体受精而培育自交后代。
根据本发明所提供的一种通过对生殖腺的外观进行观察而发现雌雄异体型贝类中的雌雄同体个体然后建立和培育自交系的途径，还可以实施通过解剖法获卵的雌雄异体型贝类的自交系建立方法，即牡蛎是雌雄异体型贝类，发生雌雄同体的频率较高，但是其雌雄个体的生殖腺均为乳白色，因此不能通过肉眼对生殖腺颜色的观察而发现雌雄同体的个体。但是牡蛎可以通过解剖的途径获得有活力的雌、雄两性配子并且其结合形成的受精卵可以正常发育，因此通过显微镜逐个检查每个牡蛎的生殖腺组织，一旦发现同时具有卵子和精子的个体即将该个体单独解剖获取其配子并使来自同一个亲本的雌、雄配子受精，培育自交系。该思路适用于任何可以通过解剖获卵的贝类，比如牡蛎、珍珠贝等。
权利要求
1.一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于从雌雄异体型贝类中选择出同时具有雌雄两种生殖细胞的、即雌雄同体的特殊个体，采用自交的策略建立和培育自交系。
2.按照权利要求1所述雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于所述雌雄异体型贝类，其生殖腺的颜色在同一物种的雌性与雄性之间具有可在活体情况下通过肉眼观察分辨其性别的差异。
3.按照权利要求1所述雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于所述同时具有雌雄两种生殖细胞的雌雄异体型贝类中的特殊个体，其生殖腺发育后，从生殖腺的外观上由肉眼可辨认出该个体同时具有雌、雄两种颜色的生殖腺；并且其生殖腺须以雌性为主，具体为以表面积计，雄性生殖腺占生殖腺总面积的比例小于、等于30％，至少在肉眼观察中可见具有雄性生殖腺即可。
4.按照权利要求1所述雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于所述采用自交的策略建立和培育自交系的方法，具体为将每个亲本在相互隔离的条件下独立催产并使同一个亲本所产的雌雄配子进行自体受精，然后按该物种的常规技术进行孵化、培育、和养殖；所述独立催产和自体受精是指每个亲本单独在一个容器中用人工刺激的方法促使其排放雌性和雄性配子，然后使同一个个体的卵子和精子受精，在催产和受精过程中按亲本雌雄两种生殖腺的相对比例情况，采取措施人为增加或减少精子数量以对水体中雌雄两种配子的相对比例进行人工干预和调节；具体为对于雄性生殖腺的表面积大于该个体生殖腺表面积总和的15％、小于等于30％的个体，在亲本阴干刺激后注射5-羟色胺，然后在比原培育水温提高3～5℃的紫外线照射海水中催产。
5.按照权利要求4所述雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于所述对水体中雌雄两种配子的相对比例进行人工干预和调节的方法可以是对于雄性生殖腺的表面积小于、等于该个体生殖腺表面积总和0.5％的亲本，在常规催产结束后对亲本雄性生殖腺所在部位进行局部解剖，然后将通过解剖方法获得的精液加入到该个体通过常规催产正常排放的性产物中。
6.按照权利要求4所述雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于所述对水体中雌雄两种配子的相对比例进行人工干预和调节的方法可以是对于雄性生殖腺的表面积为该个体生殖腺表面积总和10～15％的个体，则以采用注射5-羟色胺的方法为佳。
7.按照权利要求4或6所述雌雄异体型贝类自交系的建立方法，其特征在于所述注射5-羟色胺的用量为每个亲本注射100～200μl浓度为20～500μmol/L的5-羟色胺溶液。
全文摘要
本发明涉及贝类的制种技术，特别提供了一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法。从雌雄异体型贝类中选择出同时具有雌雄两种生殖细胞的、即雌雄同体的特殊个体，采用自交的策略建立和培育自交系；所述雌雄异体型贝类，其生殖腺的颜色在同一物种的雌性与雄性之间具有可在活体情况下通过肉眼观察分辨其性别的差异。本发明利用雌雄异体型贝类中的特殊变异个体建立自交系，可加快雌雄异体型贝类的基因纯化速度，快速淘汰隐性致死基因，大大加快雌雄异体型贝类的品种选育速度，操作简便、不使用特殊的化学试剂、不需要特殊的设施，容易推广应用。本发明可应用于雌雄异体型贝类中所有在活体情况下能通过肉眼观察直接识别确认为雌雄同体的个体。
文档编号A01K67/033GK1628505SQ200410050568
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月10日 优先权日2004年10月10日
发明者刘晓, 张国范 申请人:中国科学院海洋研究所