专利名称：不同种类对虾三倍体的制备方法
技术领域：
本发明涉及不同种类对虾三倍体的制备方法，具体地说是用于不同种类对虾包括冷水性虾类和热带虾类三倍体的制备方法，属于水产养殖技术领域。利用此技术可以获得高诱导效率的不同种类对虾的三倍体。
背景技术：
对虾类的养殖在我国的水产养殖业中占有重要地位，近些年来，种质退化、种苗质量下降、病害严重等问题已经严重阻碍了其养殖生产的健康发展。通过生物技术改良种质，培育生长快或抗逆能力强的新品种已成为海水养殖发展的迫切需求。利用生物技术在细胞和染色体水平上对动物进行遗传改良，具有见效快、效率高、目的性强等特点，已在某些水产养殖动物如鱼类、贝类中得到了很好的应用。利用三倍体动物的不育性，一方面可以提高养殖产量，改良品质；另一方面，它可以作为水生生物转基因技术研究和利用的载体，从而解决转基因动物的安全性问题，避免因转基因动物逃逸引起的对野生种质的污染。针对对虾的种质质量下降、病害严重等问题日益突出，期望通过三倍体诱导技术来解决或缓解所面临的问题。2003年11月世界粮农组织召集有关专家在罗马召开的有关转基因生物安全性的咨询会议上，强调指出，转基因技术与三倍体结合将是减少对环境威胁的最有效方法。
由于对虾繁殖生物学上的特殊性以及其生殖生物学、繁殖调控等知识的缺乏，对虾三倍体批量诱导成功的例子只是近年来在中国对虾中有过报道(参见Li，F.H.，J.H.Xiang，L.H.Zhou，C.G.Wu，X.J.Zhang，2003.Optimization of triploid inductionby heat shock in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis.Aquaculture 219221-231)，由本发明人所在实验室完成，有关墨吉对虾、刀额新对虾等热带虾类三倍体诱导尚未见成功的报道。
发明内容
本发明针对不同种类的对虾其生态习性、繁殖特性的不同，筛选出用于不同对虾三倍体的最佳诱导方法，并通过实验操作程序的改进，设计了用于对虾第一极体三倍体的诱导方法。考虑到生产规模推广的可行性以及环境的安全性，开发新的用于虾类多倍体诱导的诱导剂，为对虾新品种的改良奠定基础。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种不同种类对虾三倍体的制备方法，对冷水性虾类利用热休克诱导第一极体三倍体，具体步骤如下1)收集受精卵控制对虾雌体的产卵温度在15-16℃，待虾产卵完毕后，将亲虾捞出，将对虾产卵的容器静置，使对虾卵自然下沉，之后将多余的水抽出，获得受精卵；2)热休克法在对虾产卵后8-12min，将含有受精卵的海水水温利用合适温度的海水快速调至30-31℃，在此温度下处理8-10分钟，获得对虾第一极体三倍体。
在冷水性虾类产卵结束后15-20分钟，用筛网将多余的水分滤去，并将盛有虾卵的筛网浸在海水中等待处理，在产卵后的30-34分钟，将筛网连同受精卵浸泡在重量百分比浓度为0.5-0.6％的诱导剂PC中处理15-18分钟，把筛网中的受精卵转移到孵化池中孵化，利用流式细胞仪检测倍性。
所述冷水性虾类主要指中国对虾。
一种不同种类对虾三倍体的制备方法，诱导热带虾类三倍体具体步骤如下1)收集受精卵控制对虾雌体的产卵温度在27-28℃，待虾产卵完毕后，将亲虾捞出，将对虾产卵的容器静置，使对虾卵自然下沉，之后将多余的水抽出，获得受精卵；2)将收集到的对虾受精卵，经由筛网过滤后，于产卵后的10-15分钟，将受精卵移至浓度为200-400μM的6-DMAP海水溶液中处理10-12分钟，产生热带虾类三倍体。
所述步骤2)为将收集到的对虾受精卵，经由筛网过滤后，通过冷休克抑制热带虾类受精卵的极体排放，于产卵后的10-15分钟，将受精卵浸在5-10℃的海水中处理15-20min，产生热带虾类三倍体。
所述热带虾类包括墨吉对虾或刀额新对虾。
1、中国对虾为冷水性种类，繁殖季节的雌性个体在14-20℃均可以产卵，因而利用热休克来诱导中国对虾三倍体会产生较好的效果。经实验验证，利用热休克诱导中国对虾三倍体确实是一条非常有效的途径。为了延长通过染色体组操作抑制第一极体释放的时间窗口，控制对虾雌体的产卵温度在15-16℃，可以有效地延长操作时间而不影响卵子的发育。对虾受精卵发育早期容易破碎，增加了抑制第一极体排放的操作难度，因而尽可能减少对受精卵的搅动可以保护受精卵的完整性，在此种情况下利用对虾受精卵自动沉降后将多余海水吸出的方法达到浓缩卵子的目的，并利用海水温度的调整通过热休克法达到抑制第一极体排放的目的，这也是其他诱导方法如化学诱导处理或静水压等方法无法做到的，因为此种情况下很难确定海水的体积，由此无法确定处理液的浓度，而静水压等方法对每次处理的卵子体积有严格的要求，同时也无法做到不搅动卵子。
2、在墨吉对虾和刀额新对虾等热带种类，若利用热休克处理，所需要的处理温度必须很高才能有效，在处理过程中尽管能抑制极体排放，但是处理后受精卵的孵化率很低，难以在生产上利用；利用6-DMAP可以有效地诱导这两种热带虾类的三倍体，诱导浓度为200-400μM，诱导起始时间结合产卵温度以及显微镜观察而定，诱导的持续时间依据诱导浓度的大小做相应改变；另外，通过冷休克抑制热带虾类受精卵的极体排放，将是产生热带虾类三倍体的最佳途径之一，在实验场地可以根据实际情况选择合适的诱导方法。
3、传统的化学诱导三倍体方法是利用细胞松弛素B抑制极体的排放；90年代初，利用6-DMAP诱导贝类三倍体首先获得成功。尽管6-DMAP同CB相比具有毒性低、价格便宜、操作简便等特点，但是这两种药品的毒性及安全性也是在生产上应用时不得不考虑的问题，因而开发新的无毒的虾类诱导剂也将对虾类三倍体技术的产业化起重要作用。本发明所筛选的虾类三倍体诱导剂PC为一种很常见的化学试剂，无毒、无味，价格相当低廉，操作简便，这种诱导剂能够有效地抑制对虾受精卵的极体排放，具有很好的应用前景。
本发明有如下优点1、本发明针对不同的对虾养殖种类，包括冷水性虾类和热带虾类三倍体的制备，确定了制备三倍体的最佳诱导途径和诱导方法，可以方便、高效地制备不同种类对虾的三倍体，使诱导率明显提高，并针对虾类制备第一极体三倍体的难点，提出了切实可行的用于诱导对虾第一极体三倍体的技术方案，在不破坏卵质的情况下，诱导效率明显提高。
2、本发明采用的诱导剂PC，首次用于虾类三倍体诱导，可以获得很高的诱导效率，最高诱导率达到90％以上，并增加了操作的安全性和对环境的安全性。由于诱导剂PC无毒、价格极低、操作方便、环境安全，并能够国产化，具有很好的推广应用前景。
3、本发明不仅解决了国际上虾类三倍体诱导的难题，而且可以获得批量的将近100％对虾三倍体幼体，为不同对虾三倍体的产业化及研究奠定了坚实的基础。
具体实施例方式
实施例1中国对虾第一极体三倍体的产生本发明针对对虾卵早期容易破碎，不易进行操作的特点，发展了一套针对中国对虾第一极体三倍体诱导的方法，既克服了对虾卵易破碎的缺点，又获得了高诱导率的对虾第一极体三倍体。其具体步骤如下
1、2003年4月从海区捕获的野生中国对虾亲虾，运回中国科学院海洋研究所水族楼实验室进行养殖，待其适应实验室养殖环境后，控制对虾产卵温度，使其维持在15℃，喂以沙蚕和蛤仔肉，促进亲虾卵巢的成熟。
2、为便于操作，把即将产卵的亲虾移至20升盛有海水的容器中，同时控制光线，使其在利于操作的白天在比较暗(用黑布遮挡光线)的环境下产卵。待虾产卵完毕后，将亲虾捞出，将对虾产卵的容器静置，使对虾卵自然下沉，之后将多余的水抽出。
3、在对虾产卵后8-12min(结合显微镜观察，在第一极体没有排放之前)，将含有受精卵的海水水温利用合适温度的海水快速调至30-31℃，在此温度下处理8-10min，可以成功地获得中国对虾第一极体三倍体，诱导率可达70％以上，最高达到100％，所孵化的对虾无节幼体可养至成体。
实施例2利用6-DMAP诱导墨吉对虾和刀额新对虾的三倍体控制对虾雌体的产卵温度在27-28℃，按实施例1的的方法收集对虾受精卵，经由筛网过滤后，于产卵后的10-15分钟(依据显微镜观察，在第一极体排放之后)，将受精卵移至300μM的6-DMAP海水溶液中处理10分钟，在墨吉对虾中三倍体诱导率可高达80％，在刀额新对虾中三倍体诱导率高达83％。
实施例3利用冷休克法诱导墨吉对虾的三倍体控制对虾雌体的产卵温度在27-28℃，按照实施例1的方法收集受精卵，经由筛网过滤后于产卵后的10-15min(依据显微镜观察，在第一极体排放之后)，将受精卵浸在5-10℃的海水中处理15-20min，所获得的墨吉对虾三倍体的最高诱导率为85％，此种方法在刀额新对虾三倍体诱导中也同样有效。
本发明利用冷休克和6-DMAP两种方法首次诱导获得了热带虾类的三倍体，既提高了三倍体的诱导率，又提高了三倍体的存活率。
实施例4利用无毒的诱导剂PC诱导中国对虾三倍体按照实施例1.1对中国对虾亲虾进行喂养和管理，使亲虾在15-16℃条件下产卵，对虾产卵后浓缩对虾的受精卵，大约于产卵结束后20分钟，用筛网将多余的水分滤去，并将盛有虾卵的筛网浸在海水中等待处理。在产卵后的34分钟左右，结合显微镜观察在受精卵第一极体排放之后，将筛网连同受精卵浸泡在重量百分比浓度为0.6％的诱导剂PC中处理15min，把筛网中的受精卵转移到孵化池中孵化。利用流式细胞仪检测倍性，发现最高诱导率可达97％，说明诱导剂PC是一种有效的虾类三倍体诱导剂。本发明采用无毒的对虾类三倍体的诱导剂PC，此诱导剂与传统的化学诱导剂CB以及6-DMAP相比，无毒性，操作安全、简便，诱导率比较高。
权利要求
1.一种不同种类对虾三倍体的制备方法，其特征在于对冷水性虾类利用热休克诱导第一极体三倍体，具体步骤如下1)收集受精卵控制对虾雌体的产卵温度在15-16℃，待虾产卵完毕后，将亲虾捞出，将对虾产卵的容器静置，使对虾卵自然下沉，之后将多余的水抽出，获得受精卵；2)热休克法在对虾产卵后8-12min，将含有受精卵的海水水温利用合适温度的海水快速调至30-31℃，在此温度下处理8-10分钟，获得对虾第一极体三倍体。
2.按照权利要求1所述不同种类对虾三倍体的制备方法，其特征在于在冷水性虾类产卵结束后15-20分钟，用筛网将多余的水分滤去，并将盛有虾卵的筛网浸在海水中等待处理，在产卵后的30-34分钟，将筛网连同受精卵浸泡在重量百分比浓度为0.5-0.6％的诱导剂PC中处理15-18分钟，把筛网中的受精卵转移到孵化池中孵化，利用流式细胞仪检测倍性。
3.按照权利要求1或2所述对虾三倍体的制备方法，其特征在于所述冷水性虾类主要指中国对虾。
4.一种不同种类对虾三倍体的制备方法，其特征在于诱导热带虾类三倍体具体步骤如下1)收集受精卵控制对虾雌体的产卵温度在27-28℃，待虾产卵完毕后，将亲虾捞出，将对虾产卵的容器静置，使对虾卵自然下沉，之后将多余的水抽出，获得受精卵；2)将收集到的对虾受精卵，经由筛网过滤后，于产卵后的10-15分钟，将受精卵移至浓度为200-400μM的6-DMAP海水溶液中处理10-12分钟，产生热带虾类三倍体。
5.按照权利要求4所述不同种类对虾三倍体的制备方法，其特征在于所述步骤2)为将收集到的对虾受精卵，经由筛网过滤后，通过冷休克抑制热带虾类受精卵的极体排放，于产卵后的10-15分钟，将受精卵浸在5-10℃的海水中处理15-20min，产生热带虾类三倍体。
6.按照权利要求4或5所述对虾三倍体的制备方法，其特征在于所述热带虾类包括墨吉对虾或刀额新对虾。
全文摘要
本发明涉及不同种类对虾三倍体的制备方法，具体地说是用于不同种类对虾包括冷水性虾类和热带虾类三倍体的制备方法；包括对第一极体三倍体的诱导；适用于不同对虾的三倍体诱导方法；对虾三倍体诱导剂的开发及利用。其中，冷水虾类三倍体的制备由收集受精卵、热休克法等步骤组成；热带虾类三倍体的制备由收集受精卵、加诱导剂或冷休克法等步骤组成。本发明的优点在于针对不同种类的对虾，确定了制备三倍体的最佳诱导途径和诱导方法，使诱导率明显提高；制定了制备虾类第一极体三倍体的最佳诱导方案，在不破坏卵质的情况下，诱导效率明显提高；本发明采用的诱导剂无毒，可以获得很高的诱导效率，并增加了操作的安全性和对环境的安全性。
文档编号A01K67/00GK1763180SQ20041005065
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月22日 优先权日2004年10月22日
发明者相建海, 李富花, 张晓军, 周岭华 申请人:中国科学院海洋研究所