专利名称：用于冷冻保藏的针叶树胚胎再生的方法和成分的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于冷冻保藏的针叶树胚胎再生的方法和成分。
背景技术：
为了生产木制产品，对于用针叶树如松木和冷杉的需求正不断增加。对于该问题的一个建设性解决方案是鉴别拥有所需特性如快速生长率的个体树木，并生成大量遗传上完全相同的通过体细胞克隆的优势树木的无性繁殖系。
体细胞克隆是从树木组织而非雌雄配子中产生遗传上完全相同的树木的方法。植物细胞悬浮培养物被广泛用于体细胞胚胎的再生。冷冻保藏使得这些培养物可能无限期地被保藏，最低限度地维持并将风险降低到最小程度。但是，需要一种冷冻的针叶树胚胎发生培养物再生的有效方法，该方法应该是自动的或半自动的方法。本发明就是用来满足这种需要的。
发明概述本发明提供了一种用于针叶树胚胎发生细胞再生的方法。该方法包括步骤(a)用液体转换培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞，和(b)在再生培养基中培养接触过的针叶树胚胎发生细胞使之再生。可以用液体转换培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞长达大约96小时。一般地，用液体转换培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞低于大约24小时，比如大约1小时。胚胎发生细胞一般在再生培养基中培养大约1周到大约10周的时间。
再生培养基可以是固体，半固体或液体培养基。在一些具体实施方式
中，转换培养基和再生培养基包含的主要糖源选自麦芽糖，葡萄糖或两者结组合。转换培养基或再生培养基可选择加入脱落酸。
优选实施方式的详细描述这里所使用的全部术语，除非特殊定义，具有本发明领域的技术人员所知的同样的含义。
除非另外规定，所有浓度值都是以重量体积百分比来表示的。
本发明提供了针叶树胚胎发生细胞再生的方法。该方法包括步骤(a)用液体转换培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞低于大约24小时，和(b)在再生培养基中培养接触过的针叶树胚胎发生细胞使之再生。在一些具体实施方式
中，用液体转换培养基接触针叶树胚胎发生细胞大约1小时。本发明中的方法可适用于松柏目中的任何一种，例如花旗杉，Norway云杉，冷杉属(例如Noble冷杉)和松属(genuspinus)，例如Loblolly松木(taeda松果松)。
这里使用的术语“胚胎发生细胞”是指任何细胞，包括来自松柏目的植物的具有机体结构以形成组织或器官的细胞，该细胞能够生产一个或多个针叶树的体细胞胚胎。因此，术语“胚胎发生细胞”包括了例如针叶树胚胎囊柄团(ESMs)。实施例1中描述了制备针叶树胚胎发生细胞的一个示范性的方法。
这里使用的术语“冷冻保藏”是指在极低的温度下保藏细胞，比如针叶树的胚胎发生细胞，通常是在液氮中(-196℃)。由于采用了冷冻保藏措施，细胞在保藏过程中自始至终保持其活力。实施例1中描述了示范性的冷冻防护和冷冻保藏的方法。
本发明方法的第一步是冷冻保藏的针叶树的胚胎发生细胞与液体转换培养基相接触。通常，针叶树胚胎发生细胞的冷冻保藏物很快就融化了，并被转移到固体支持物上排干液体。举个例子，如实施例1中所描述的，培养物可以被转移到置于干衬垫或吸墨纸上的滤纸上面。融化了的并被吸干的胚胎发生细胞随后与液体转换培养基接触。例如，如实施例1中所描述的，融化并被吸干的胚胎发生细胞可以转移到置于小碟子中被液体转换培养基浸透的衬垫上。
液体转换培养基一般含有无机盐和有机营养物质。例如，在诱导培养基中可以含有麦芽糖，蔗糖，葡萄糖，或者三者组合，作为主要糖源。糖的有效浓度是在大约1％到大约5％的范围内，比如大约3％。液体转换培养基的同渗重量摩尔浓度一般是大约100mM/kg到大约250mM/kg之间，比如是大约150mM/kg。液体转换培养基一般含有生长激素。液体转换培养基中可含有的激素的例子是茁长素(例如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和细胞激动素(如6-苄基氨基嘌呤(BAP))。举例来说，茁长素可采用从1mg/L到200mg/L的浓度。细胞激动素可采用从0.1mg/L到10mg/L的浓度。
转换培养基可选择加入激素脱落酸。脱落酸是一种倍半萜烯类(sesquiterpenoid)的植物激素，它涉及多种植物的生理过程(见例如，Milborrow(2001)J.Exp.Botany 521145-1164；Leung & Giraudat(1998)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49199-123)。本发明方法的一些具体实施方式
中，液体发育培养基中的脱落酸的浓度是从1mg/l到200mg/l之间，比如5mg/l到50mg/l。适宜的转换培养基的例子是实施例1所示的BM1-4中的成分。
一般而言，胚胎发生细胞与转换培养基接触的时间少于24小时，比如大约3小时，或大约1小时。但与液体转换培养基接触的时间也可以更长一些，比如长达大约96小时。
本发明方法的第二步中，冷冻保藏的胚胎发生细胞是培养在再生培养基之中或之上，以使针叶树的胚胎发生细胞再生。
再生培养基可以是固体的，半固体的或液体培养基。再生培养基一般含有无机盐和有机营养物质。例如，在再生培养基中可以含有麦芽糖，蔗糖，葡萄糖，或者三者组合，作为主要糖源。源的有效浓度是在大约1％到大约5％的范围内，比如大约3％。在一些具体实施方式
中，再生培养基含有的麦芽糖的浓度是在大约1％到大约5％的范围内，和/或蔗糖的浓度在大约1％到3％的范围内。
再生培养基的同渗重量摩尔浓度一般是在大约100mM/kg到大约250mM/kg之间，比如150mM/kg。再生培养基一般含有生长激素，比2，4-D，BAP或激动素，其浓度与液体转换培养基中所用的相同。再生培养基中可选择加入激素脱落酸。本发明的一些具体实施方式
中，固体再生培养基不含有脱落酸。
再生培养基的成分可以与转换培养基的成分完全相同。如实施例1所示，BM1-4的成分是适用的液体再生培养基的例子。如实施例1所示，BM5-8的成分是适用的固体再生培养基的例子。
冷冻保藏的胚胎发生细胞可以培养在再生培养基之中或之上大约1周到大约10周的时间，比如大约3到大约8周，温度从10℃到30℃，比如从15℃到25℃，或者从20℃到23℃。
本发明提供简单并可靠的用于针叶树胚胎发生细胞冷冻保藏后再生的方法。比如说，与用同等方法制备的相比，本发明方法得到的冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞胚胎的再生量是相同的或更高，在所述同等方法中，胚胎发生细胞首先是与和液体转换培养基完全不同的固体转换培养基接触。在一些具体实施方式
中，如实施例1和2所示，利用液体或固体的再生培养基得到了胚胎发生细胞相同的再生量。另外，在都不含脱落酸的液体转换培养基和再生培养基中得到了高再生率。例如，如实施例1和2所示，利用不含脱落酸的固体再生培养基得到了高再生率。
此外，根据本发明，使用液体转换培养基以及可任选的液体再生培养基，使得子叶胚胎的制备简单化，因为液体培养基更容易制备，保存，而且可用于自动制备过程。
下面的实施例仅仅是阐明上述的最佳模式，以此用来实施本发明，而不应该将其认做是限制本发明的。
实施例1本实施例显示的是本发明用于Loblolly松木体细胞胚胎冷冻保藏培养物再生的具代表性的方法。
方法从受精4到5周的8种基因型的种子中取出含有合子胚胎的雌性配子体。去掉种子外衣，除了切除珠心末端，不要再将胚胎从周围的配子体中剖出。球果保存在4℃直到被使用。先对种子进行消毒，采用初步的冲洗，以及15％的H2O2灭菌10分钟后用洗涤剂处理，随后立即取出未成熟的胚胎。每一次处理后都用无菌蒸馏水对外植体进行彻底地冲洗。
带有完整的胚胎的无菌配子体被放置到固体诱导培养基上并保持在22℃-25℃、24小时暗光周期的环境中3到5周。诱导培养基具有表1所示的BM1的成分，其中除了含有1600mg/l的GELRITE，以及2，4-D，BAP和激动素的浓度分别是3.3mg/l，0.4mg/l和0.4mg/l。时间的长短是根据被培养的特殊基因型而定。该时间结束时，形成的是与原始外植体结合的白色的粘性团块儿(胚胎囊柄团状物，ESM)。通常，显微镜检测显示的是与团块儿结合的许多早期的胚胎。
在诱导阶段产生的ESMs被放置到液体维持和增殖培养基上。该培养基与诱导培养基不同的是不含gellan树胶，而且2，4-D，BAP和激动素的浓度分别降低到1.1mg/l，0.1mg/l和0.1mg/l。温度和光周期也是22℃到25℃和24小时暗处理。
为了冷冻保护，7天的悬浮培养物沉淀15到20分钟，随后除去上清液。以1∶9的密度将5ml的沉淀细胞转移到25ml第一次冷冻保护培养基的250ml三角瓶中。除了添加0.2M的山梨醇外，第一次冷冻保护培养基的成分与维持培养基的成分相同。置于摇床24小时后(转速为100rpm)，5ml的沉淀细胞以1∶9的密度转移到第二次冷冻保护培养基中。除了将山梨醇的浓度提高到0.4M外，第二次冷冻保护培养基的成分与第一次冷冻保护培养基的成分相同。置于摇床24小时后(转速为100rpm)，将三角瓶置于冰上，在连续振荡过程中添加10倍的DMSO到终浓度为5％(v/v)，历时超过30分钟。
为了冷冻保藏，通过除去上清液浓缩细胞体积将细胞的密度调整到30％(v/v)。1.0ml细胞悬浮物的等分试样被分装到1.2ml的冷冻小瓶中。将冷冻小瓶放到容器里立在碎冰中。将该容器装入CryoMed可编程的冷冻机中，以每分钟0.4℃到1℃的制冷速率将温度降低到负35℃。随后将容器放置在冷冻保藏箱的架子上，该保藏箱是储存在液氮浸没相中的。
为了复苏冷冻保藏的培养物，冷冻小瓶被放入无菌水中，水浴使其温度达到37℃，并搅拌直到所有的ESM融化。然后将冷冻小瓶转移到室温放置的架子上。每支小瓶用70％的异丙醇溶液擦拭。将每支冷冻小瓶中的内容物倾倒在置于小Pall-Gelman吸墨盘上的无菌Whatman#2滤纸上。液体吸干后，将滤纸转移到陪氏培养皿中浸有液体转换培养基(成分为BM1，见表1)的衬垫上。室温下1小时后，滤纸既可被转移到新鲜的浸有液体再生培养基(成分为BM1)衬垫上，也可转移到固体的再生培养基上(成分为BM1，见表1)。
表1.用于冷冻保藏的胚胎发生培养物的培养基的成分
结果在再生培养基之中或之上培养8天后，所有小瓶的培养物正长成ESMs。18天后将样品称重。从带滤纸和ESMs的平板的重量中减去不带滤纸和ESMs的平板的重量得到ESMs的重量。在固体再生培养基之上或液体再生培养基之中再生而得到的ESMs平均重量是777.5mg。
实施例2本实施例显示了先用四种不同的液体转换培养基再用四种不同的液体或固体再生培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞后，Loblolly松木体细胞胚胎复苏的对照结果。
8种不同基因型的Loblolly松木胚胎发生培养物用实施例1中描述的方法制备和冷冻保藏。为了复苏冷冻保藏的培养物，每个基因型的8支冷冻小瓶被放入无菌水中，水浴温热到37℃，并且搅动直到所有的冰融化掉。然后将冷冻小瓶转移到室温放置的架子上。每支小瓶用70％的异丙醇溶液擦拭。
对每个基因型随机地选择2支小瓶，将其内容物放到四种液体转换培养基的一种上，每种的成分是BM1-4(见表1)。每种液体转换培养基上一小瓶中的ESMs被转移到液体再生培养基中，其成分与液体转换培养基完全相同，其它小瓶中的ESMs被转移到除了不含有脱落酸但含有1600mg/l gellan树胶以外，其余成分与液体转换培养基完全相同的固体再生培养基(成分为BM5-8，见表1)上，如表2所示。
将每支小瓶中的内容物以细流方式倾倒在置于无菌的陪氏培养皿中干燥衬垫上的无菌Whatman#2滤纸上。吸干培养物后，将滤纸转移到带有衬垫的新的陪氏培养皿上，衬垫用大约18ml的4种液体转换培养基之一的培养基浸透。1小时后，将滤纸转移到含有固体再生培养基的新鲜平板上或带有浸透了液体再生培养基的衬垫的新鲜平板上。将所有的平板包在封口膜(parafilm)中并放到保存盒中室温保持1周。
结果8天后，在再生培养基之中或之上的所有样品都长出了ESMs。18天后，对样品称重。从带滤纸和ESMs的平板的重量中减去不带滤纸和ESMs的平板的重量得到ESMs的重量。得到的综合了所有8种基因型的ESMs的平均重量显示在表2中。
表2.用不同的培养基得到的ESM的平均重量培养基成分 ESM重量(mg)转换培养基 再生培养基BM1BM1793.4BM2BM2764.0BM3BM3706.1BM4BM4662.9BM1BM5891.6BM2BM6876.5BM3BM7634.2BM4BM8890.9综合所有的基因型，在固体再生培养基BM5-8上生长而得到的ESMs的平均重量是823.2803mg，而在液体再生培养基BM1-4上生长而得到的ESMs的平均重量是731.6094mg。在液体再生培养基和固体再生培养基上生长的ESMs重量上的差别不具统计学上的意义。
在再生培养基中使用麦芽糖，葡萄糖或麦芽糖与葡萄糖结合使用(也就是BM1，BM2和BM4)而得到的再生量之差也没有统计学上的意义。但是，值得注意的是，再生培养基中使用蔗糖(也就是BM2)而得到的再生量显著低(p＝0.1325)。
当本发明优选的具体实施方式
被阐明和描述时，可以理解的是，在无需脱离本发明的法旨和范围的条件下能对其进行多种修改。
权利要求
1.一种用于冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞再生的方法，包含步骤(a)用液体转换培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞；和(b)在再生培养基之中或之上培养接触过的针叶树胚胎发生细胞以使针叶树胚胎发生细胞再生。
2.权利要求1的方法，其中针叶树胚胎发生细胞与液体转换培养基接触少于大约24小时。
3.权利要求1的方法，其中针叶树胚胎发生细胞与液体转换培养基接触大约1小时。
4.权利要求1的方法，其中再生培养基是固体培养基。
5.权利要求1的方法，其中再生培养基是液体培养基。
6.权利要求1的方法，其中再生培养基不含有脱落酸。
7.权利要求1的方法，其中液体转换培养基和再生培养基含有的主要糖源选自麦芽糖，葡萄糖或两者组合。
8.权利要求7的方法，其中再生培养基含有葡萄糖。
9.权利要求8的方法，其中葡萄糖的浓度是在大约10g/l到大约50g/l之间。
10.权利要求7的方法，其中再生培养基含有麦芽糖。
11.权利要求10的方法，其中麦芽糖的浓度是在大约10g/l到大约50g/l之间。
12.权利要求7的方法，其中再生培养基含有葡萄糖和麦芽糖。
13.权利要求12的方法，其中葡萄糖的浓度是在大约10g/l到大约30g/l之间，而麦芽糖的浓度是在大约10g/l到大约30g/l之间。
14.权利要求1的方法，其中针叶树胚胎发生细胞在再生培养基中培养大约1周到大约10周。
15.权利要求1的方法，其中针叶树胚胎发生细胞选自松属。
全文摘要
本发明提供针叶树胚胎发生细胞再生的方法。方法包括步骤(a)用液体转换培养基接触冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞，和(b)在再生培养基中培养接触过的针叶树胚胎发生细胞以使之再生。通常，冷冻保藏的针叶树胚胎发生细胞与液体转换培养基接触的时间少于大约24小时，比如大约1小时。
文档编号A01H4/00GK1576363SQ20041005564
公开日2005年2月9日 申请日期2004年7月30日 优先权日2003年7月30日
发明者普拉莫德·K·古普塔, 博尼·拉松, 多丽丝·巴德沃思 申请人:韦尔豪泽公司