专利名称：一种获得裸子植物脱外壁花粉的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得植物脱外壁花粉的方法，特别涉及一种获得裸子植物脱外壁花粉的方法。
背景技术：
由于花粉粒具有结构简单、群体数量大、易于离体操作等特征，因而被认为是生物技术领域理想的细胞体系。植物花粉粒的壁通常分为两层，即由纤维素、果胶质等组成的内壁和孢粉素组成的外壁，其中内壁可通过酶解的方法去除，而外壁中的孢粉素则缺乏有效的可使之降解的酶。脱外壁花粉是一种介于完整花粉粒与花粉粒原生质体之间的结构单位，它是一种独特的花粉形态学与生理学研究材料，可用其研究整个花粉粒内壁的表面结构、剥离的花粉粒外壁的结构与成分以及外壁在花粉萌发和花粉管生长中的作用。此外，脱外壁花粉还可导入外源基因，它比完整花粉粒少一层外壁，又比花粉原生质体更坚固，因而有潜力成为植物基因工程领域中遗传转化的受体。
目前，已成功制备了多种被子植物的脱外壁花粉，如芸苔属及烟草脱外壁花粉的分离技术已经相当成熟。研究发现，有些裸子植物的花粉在溶液中水合后外壁会自动脱落，如红豆杉的花粉落入受粉珠上水合以后，外壁便自动脱落，并以脱外壁的形式萌发出花粉管进行下一步受精过程。由此可见，对脱外壁花粉进行研究有助于进一步了解裸子植物受粉机制，而这一研究需要分离出完整的、具有活性的脱外壁花粉。但是迄今为止还没有分离裸子植物脱外壁花粉的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的生物学研究相对被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是提供一种较快速获得裸子植物脱外壁花粉的方法。
本发明所提供的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，是用含1-2％纤维素酶和0.5-1.5％离析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒1.5-2小时后，轻压酶解后的花粉粒，得到裸子植物脱外壁花粉；所述百分数为质量百分含量。
为了获得更好的酶解效果，所述酶解液是以含0.01％硼酸和含0.01％-0.03％氯化钙的10-15％蔗糖溶液配制的。
所述裸子植物花粉粒与酶解液的质量比可为1∶5-1∶10。
所述酶解的温度可为24-27℃。
为了加快酶解速度可将加入裸子植物花粉粒的酶解液在100-200rpm的摇床上振荡。
酶解1.5-2小时后，通过离心法收集酶解后的花粉粒；所述离心的转速可为1000-2000r/min。
所述纤维素酶可为市售的各种纤维素酶，但尤以cellulase R-10(Yakult HonshaCo.Ltd)效果最佳，所述离析酶可为市售的各种离析酶，尤以macerozyme R-10(YakultHonsha Co.Ltd)效果最佳。
本发明特别适用于松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的裸子植物，其中松杉纲中效果较突出的有白皮松、青扦、红松、油松、云杉、冷杉等松科裸子植物，银杏纲的代表是银杏，苏铁纲的代表为苏铁。
上述百分比浓度均为质量百分比浓度。
本发明的获得裸子植物脱外壁花粉的方法中，纤维素酶和离析酶可以削弱花粉内壁与外壁之间的连接，蔗糖用于维持溶液的渗透压，硼酸及氯化钙可以保持脱外壁花粉的活性。该方法快速、简单易行，可获得大量具有活性的裸子植物的脱外壁花粉，具有较大的实际应用价值。
图1为获得的白皮松脱外壁花粉在明场显微镜下的观察结果图2为获得的青扦脱外壁花粉在明场显微镜下的观察结果具体实施方式
以下实施例中的百分比浓度均为质量百分比浓度。
实施例1、获得白皮松脱外壁花粉包括以下步骤1)将成熟的白皮松花粉粒室温下进行干燥后，-20℃保存备用；2)配制含0.01％硼酸(H3BO3)和0.01％CaCl2的15％蔗糖溶液；3)用步骤2)的溶液配制含1％纤维素酶cellulase R-10(Yakult Honsha Co.Ltd)和0.8％离析酶macerozyme R-10(Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液；4)将步骤1)的白皮松花粉粒1-2mg在室温下回温后，置于2mL步骤3)的酶解液中，25℃ 120rpm的摇床上振荡酶解2小时；5)1000-2000rpm/min离心，收集沉淀，弃上清，换之以步骤2)的蔗糖溶液并用此离心的方法清洗沉淀2-3次；6)将步骤5)收集的花粉粒置于玻片上，用平头玻棒轻压，释放出脱外壁花粉，再用步骤2)的蔗糖溶液将脱外壁花粉清洗进离心管中得到含有白皮松脱外壁花粉的悬浮液；7)镜检向步骤6)的悬浮液中加入0.5mL浓度为0.1g/L的FDA溶液(将0.1gFDA(Sigma F 7378)溶于1L丙酮)，在明场用显微镜进行镜检，结果如图1所示。经统计，白皮松脱外壁花粉的分离率高达60％，其中有活性的脱外壁花粉占90％以上，表明该方法可快速有效地得到白皮松脱外壁花粉。
实施例2、获得青扦脱外壁花粉1)将成熟的青扦花粉粒室温下进行干燥后，-20℃保存备用；2)配制含0.01％硼酸(H3BO3)和0.03％氯化钙(CaCl2)的12％蔗糖溶液；3)用步骤2)的溶液配制含1.5％纤维素酶(Yakult Honsha Co.Ltd)和1.2％离析酶(Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液；4)将步骤1)的青扦花粉粒500μg在室温下回温后，置于步骤3)的酶解液20ml中，25℃ 120rpm的摇床上振荡酶解1.5小时；5)1000-2000rpm/min离心，收集沉淀，弃上清，换之以步骤2)的蔗糖溶液并用此离心的方法清洗沉淀2-3次；6)将步骤5)收集的花粉粒置于玻片上，用平头玻棒轻压，释放出脱外壁花粉，再用步骤2)的蔗糖溶液将脱外壁花粉清洗进离心管中得到含有白皮松脱外壁花粉的悬浮液；7)镜检向步骤6)的悬浮液中加入0.5mL浓度为0.1g/L的FDA溶液(将0.1gFDA(Sigma F 7378)溶于1L丙酮)，在明场用显微镜进行镜检，结果如图2所示。经统计，青扦脱外壁花粉的分离率高达60％，其中有活性的脱外壁花粉占90％以上，表明该方法可快速有效地得到青扦脱外壁花粉。
权利要求
1.一种获得裸子植物脱外壁花粉的方法，是用含1-2％纤维素酶和0.5-1.5％离析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒1.5-2小时后，轻压酶解后的花粉粒，得到裸子植物脱外壁花粉；所述百分数为质量百分含量。
2.根据权利要求1所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于所述酶解液是以含0.01％硼酸和含0.01-0.03％氯化钙的10-15％蔗糖溶液配制的；所述百分数为质量百分含量。
3.根据权利要求1或2所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于所述裸子植物花粉粒与酶解液的质量比为1∶5-1∶10。
4.根据权利要求1或2所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于所述酶解温度为24-27℃。
5.根据权利要求1或2所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于所述酶解1.5-2小时后，通过离心法收集酶解后的花粉粒；所述离心的转速为1000-2000r/min。
6.根据权利要求1或2所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于所述裸子植物为松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的裸子植物。
7.根据权利要求6所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于所述松杉纲为松科裸子植物；所述银杏纲裸子植物为银杏；所述苏铁纲裸子植物为苏铁。
8.根据权利要求7所述的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其特征在于述松科裸子植物为白皮松、青扦、红松、油松、云杉、冷杉。
全文摘要
本发明公开了一种获得裸子植物脱外壁花粉的方法，其目的是提供一种较快速获得裸子植物脱外壁花粉的方法。本发明的获得裸子植物脱外壁花粉的方法，是用含1－2％纤维素酶和0.5－1.5％离析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒1.5－2小时后，轻压酶解后的花粉粒，得到裸子植物脱外壁花粉；所述百分数为质量百分含量。本发明的获得裸子植物脱外壁花粉的方法快速、简单易行，可获得大量具有活性的裸子植物脱外壁花粉，具有较大的实际应用价值。
文档编号A01H7/00GK1778170SQ20041008897
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者林金星, 房克凤 申请人:中国科学院植物研究所