细小裸藻的ter基因的制作方法

专利名称：细小裸藻的ter基因的制作方法
概述本发明涉及核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的用途，当所述核苷酸序列表达时可增加转基因生物体产生的脂类总量(如三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸)。
更加具体而言，本发明描述了细小裸藻(Euglena gracilis)来源的编码反-2-烯酰CoA还原酶(TER-E.C.1.3.1.44)的核苷酸序列SEQ ID NO1的鉴定。
在另一个实施方案中，本发明指向了包含如SEQ ID NO2、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所显示的氨基酸序列的蛋白质或其功能性片段、衍生物、变体或直向同源物。
本发明还包括如SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8或SEQ ID NO10所显示的核酸序列，同样也包括其基因组序列、cDNA序列、等位基因变体、合成变体及突变体部分。这些序列包括能用作探针、转化用载体或克隆中间体的序列。
SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQID NO11是可读框SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8或SEQ ID NO10的推导氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及那些与SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有至少60％同一性的多肽。
本发明进一步涉及用于在植物、优选在植物种子表达编码TER基因的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的表达构建体、表达TER基因的转基因植物以及所述转基因植物用于生产食物、饲料、种子、药物制剂或精细化学药品、具体而言用于生产油类的用途。
在油料作物如油菜、向日葵、油棕榈等中，油(即三酰甘油)是种子或果实中最有价值的产物，而其它化合物如淀粉、蛋白质和纤维则被认为是价值较小的副产物。因此，在油料作物中，以其它化合物为代价提高基准重量的脂类数量将增加农作物的价值。如果将促进还原碳分配进入脂类产物的蛋白质通过过表达上调，则细胞在消耗其它产物的情况下将积累更多的脂类。此方法不仅能用来提高已经为油类高产生物例如油料作物中的脂类含量，而且还可以导致在中等或低含油量农作物如大豆、燕麦、玉米、马铃薯、甜菜和芜箐以及微生物中产生相当量的脂类产物。
增加植物中、特别是植物种子中的脂类含量，对于传统和现代植物的种植、尤其对于植物生物技术具有很大的价值。由于用于营养或工业应用的植物油消耗的增加，增加或改善蔬菜油类的可能性日益成为当前研究的目标(例如Tpfer等人(1995)Science 268681-686)。其目的特别是增加种子油类中的脂肪酸含量。
从植物油中获得的脂肪酸也具有特殊的价值。例如，它们可用作增塑剂、润滑剂、表面活性剂、化妆品等等的主要成分，而且用作食品和饲料工业中有价值的主要成分。因此，例如，既然在生产表面活性剂特别需要具有中等链长度脂肪酸的菜籽油，那么提供此种菜籽油具有特殊的价值。关于医学方面，许多种子油类中的长链脂肪酸(18碳及更长)与高胆固醇血症或与冠心病相关的其它临床病症的降低有联系(Brenner 1976，Adv.Exp.Med.Biol.8385-101)。因此，食用脂肪酸水平增加的此类植物可以减少患心脏病的危险。种子油类含量水平的提高也大规模地增加种子油类的产量，并因此降低此种油类的成本。
通过重组方法对植物代谢途径进行靶向调节，能够以有利的方式对植物代谢进行修饰，当使用传统种植方法时只有在复杂过程之后才能实现此种代谢或者根本无法实现此种代谢。因此，稀有脂肪酸，例如特殊的多不饱和脂肪酸，只在特定植物中合成或者在植物中根本不合成，因此其只能在转基因植物中通过表达相关基因产生(例如Millar等人(2000)TrendsPlant Sci 595-101)。
三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和其它脂类从脂肪酸合成。脂肪酸的生物合成和三酰甘油的生物合成由于区室化作用被认为是各自独立的生物合成途径，但考虑到终产物它们被认为是单一生物合成途径。脂类合成可被分成两部分机制，一种可称为“原核”机制而另一种称为“真核”机制(Browse等人(1986)Biochemical J 23525-31；Ohlrogge和Browse(1995)Plant Cell 7957-970)。原核机制定位于质体并且包括游离脂肪酸的生物合成，游离脂肪酸输出至胞质溶胶，并在其中以脂肪酸酰基辅酶A酯的形式进入真核机制。在此途径中，脂肪酸分别被甘油-3-磷酸酰基转移酶和溶血磷酯酸酰基转移酶在3-磷酸甘油sn-1和sn-2位置上发生酯化产生磷脂酸(PA)。PA是其它极性和中性脂类的前体，后者在Kennedy途径中形成(Voelker 1996，Genetic Engineering编者Setlow 18111-113；Shanklin和Cahoon 1998，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49611-641；Frentzen 1998，Lipids 100161-166；Millar等人2000，TrendsPlant Sci.595-101)。
已经表明三酰甘油合成的最后一步通过两种不同的酶促反应进行，它们是由酰基辅酶A二酰甘油酰基转移酶催化的酰基辅酶A依赖性反应(Cases，S等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 95，13018-13023；Lardizabal，等人，2001)和由磷脂二酰甘油酰基转移酶催化的酰基辅酶A非依赖性反应(Dahlqvist等人，2000)。
在高等植物中，蜡酯由从质体输出的脂肪酸及其衍生物、特别是非常长链脂肪酸及其衍生物合成(Dusty Post-BeittenmillerBiochemistry andmolecular biology of wax production in plants.在Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.(1996)；编者Jones，R L.，第47卷，第405-430页)。
当细小裸藻在厌氧条件下生长时产生蜡酯。将裸藻从需氧条件转移至厌氧条件，导致在消耗储备多糖副淀粉的情况下快速形成蜡酯。蜡酯的厌氧形成伴随着ATP的净合成(Inui，H.等人(1982)FEBS Lett.15089-93)，照此此现象称为蜡酯发酵。
脂肪酸在裸藻中合成的四种系统已有描述1)包括胞质溶胶中的多功能脂肪酸合成酶，2)叶绿体中的酰基-载体-蛋白质依赖系统和3)包括微粒体中的脂肪酸合成酶(Kitaoka，S.(1989)Enzymes and their functionallocation.第2-135页，在D.E.Buetow编，The biology of Euglena，第4卷.Subcellular biochemistry and molecular biology.Academic Press，SanDiego)。
此外，发现了第4种新系统(见


图1)发现在细小裸藻的线粒体中，脂肪酸的从头合成系统不同于胞质溶胶中的系统(FAS I)和叶绿体中的系统(FAS II)(Inui等人.1982，1984)。此反应是用反2-烯酰辅酶A还原酶(TER)(E.C.1.3.1.44)取代降解系统中的酰基辅酶A脱氢酶的脂肪酸β-氧化机制的逆过程(Inui，H.等人Eur.J.Biochem.142(1984)121-126)。既然反2-烯酰辅酶A还原酶(TER)催化循环的最后一步并产生终产物脂肪酰辅酶A，那么它是该脂肪酸生物合成途径的关键酶。尽管Inui和同事测定了TER的酶活性而且实现了蛋白质的部分纯化，但没有得到蛋白质序列。由于没有关于肽和核苷酸序列的信息，关于此酶的多肽链、基因和mRNA仍然未知。到目前为止，在任何其它生物体中没有描述具有此种功能的酶。
本发明的目标是提供增加植物中脂类含量的另外的方法。
我们已经发现通过本发明实现了此目标。
本发明中显示，细小裸藻中存在多核苷酸SEQ ID NO1、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10，并且当在植物中过表达时可增加三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸在植物中积累的数量。
如实施例1所描述，对来自细小裸藻Z株的反-2-烯酰CoA还原酶(TER)进行生物化学纯化。进行一系列层析纯化步骤，见表4。这些步骤包括离子交换层析(DEAE-Fraktogel)、疏水性相互作用(phenylsapharose)、亲和层析(Reaktive Red 120)和羟磷灰石色谱法。相应的纯化水平见表4。而且，完备的纯化方案还包括另外的离子交换层析(Mono Q)，经制备型凝胶纯化以及通过Superdex 200的最终凝胶过滤。此方案达到1600倍以上的纯化。当使用标准方法进行SDS-PAGE时，最终的酶制剂显示为在44kDa左右非常接近的一条主带和一条细的次带，见图2。如Inui和同事所描述(Inui等人，1984)测定酶活性，并且活性与上面的主带相关。
从凝胶中分别切下主带和次带，并根据标准方法用胰蛋白酶消化。从凝胶中提取所得到的肽并根据标准方法用ESI-Q-TOF MS/MS分析。表明两个条带产生了完全一样的肽，这证实与Inui和同事的描述(Inui，H.等人，(1986)J.Biochem.100995-1000)相比，TER作为单一亚单位酶被完全纯化。
按照实施例2所描述的方法从细小裸藻细胞中分离出RNA。
如实施例3所描述构建细小裸藻的cDNA文库。
使用ExAssist辅助噬菌体通过体内切除从cDNA库产生pBluescript噬菌粒(phagemides)用于进一步分析。
根据这些肽(见实施例4)设计简并引物，并以cDNA作为模板进行PCR。使用下面的引物扩增出一个837bp的片段5’-GGITGGTAYAAYACIGTIGC-3’(参照肽7)和5’-GTYTCRTAICCIGCRAARTC-3’(参照肽9)。将此片段克隆入pBluescript SK+/HincII并进行测序(SEQ ID NO3)。所翻译序列包括纯化蛋白质的几种肽，因此837bp片段用作杂交探针来筛选由裸藻细胞的mRNA构建的cDNA文库。筛选250,000个重组噬菌体后产生了6个独立克隆。cDNA插入片段的变化范围在1600bp和1900bp之间。对所有6个克隆从两端测序表明所有克隆代表同一转录本，而仅在长度上有所变化。最长的克隆经核酸外切酶III删除进行双链完全测序。此克隆长1912bp，并且包含可编码539个氨基酸的1620bp的可读框(SEQ ID NO1和SEQID NO2)。在克隆两端具有含NotI和EcoRI限制性酶切位点的接头，并将该克隆插入载体pBluescript SK+的EcoRI位点，见图3。
使用EcoRI从pBluscript SK+释放此克隆。使用绿豆核酸酶(Roche)根据厂商提供的方法去除5’悬突，并使用标准方法与双元载体pSUN 300或ST593进行钝末端连接。
从细小裸藻TER在大肠杆菌(E.coli)中的表达研究结果(见实施例6)可以认为cDNA克隆的N-末端部分构成了线粒体靶向信号，必须切除该靶向信号以产生成熟的活性TER蛋白质。尽管如此仍不能排除cDNA克隆的N末端部分构成跨膜结构域的可能性。该可能的跨膜结构域在细小裸藻TER的纯化过程中可能会丢失(见实施例1)。如果在大肠杆菌中表达，此结构域由于错误卷绕或缺少膜连接可能破环使用C4-底物进行的活性测定(见实施例1)。
本发明的第一个主旨包括增加植物生物体或者组织、器官、部分、细胞或其繁殖材料中总脂类含量的方法，所述方法包括a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10在上述植物生物体或组织、器官、部分、细胞或其繁殖材料中的转基因表达，和b)选择植物生物体，其中与起始生物体对比或相比总脂类含量在上述植物生物体或组织、器官、部分、细胞或其繁殖材料中有所增加。
产生与SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所显蛋白质作用相同的其它蛋白质可从本文提供的特异性序列获得。而且，很明显人们能够获得天然的和合成的TER，包括那些具有修饰氨基酸序列的TER以及用于人工样式蛋白质的起始物质，所述人工样式蛋白质是从例证性TER和从使用此种例证性序列得到的TER得到的。经修饰氨基酸序列包括已经突变、截短、增加等等的序列，而不管此序列是否是部分或完全合成的。
另外，来自本发明SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8或SEQ ID NO10的核酸探针(DNA或RNA)可用来筛选和回收多种植物和微生物来源的同源序列或相关序列。
SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQID NO10在酵母或植物中过表达会增加总脂类的含量，并且与野生型酵母或植物相比还能提高所积累的三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸的量。
本发明的特征在于以下方面实施例1描述了反-2-烯酰CoA还原酶从细小裸藻中的生物化学纯化。
实施例2描述了从细小裸藻细胞中分离总RNA和poly-(A)+RNA。
实施例3描述了细小裸藻cDNA文库构建。
实施例4描述了通过相应cDNA的肽指纹和亚序列克隆鉴定TER蛋白质序列。
实施例5描述了三酰甘油在表达TER基因的酵母细胞中的积累。
实施例6描述了反-2-烯酰CoA还原酶在大肠杆菌中的功能性表达。
实施例7描述了用于在拟南芥(Arabidopsis)中过表达的TER构建体。
实施例8描述了用于植物转化的质粒。
实施例9描述了拟南芥的转化。
实施例10描述了转基因植物中TER基因功能的体外分析。
实施例11描述了过表达TER基因的转基因拟南芥植物中的脂类含量。
实施例12描述了基于序列比较的反烯酰活性的氨基酸特点。
本发明的特征还有编码蛋白质SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的用途，所述序列能增加三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸的产量；具有上述序列的产油生物体的遗传转化以便在该生物体中表达，得以产生可增加生物体中脂类含量的活性蛋白质。
核苷酸序列来自SEQ ID NO1中所显示的细小裸藻TER基因(基因组克隆或cDNA)的序列，或者来自包含这样一种核苷酸序列的核酸序列或cDNA，其中所述核苷酸序列编码具有与SEQ ID NO2中所示氨基酸序列具有60％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质。
我们称作反-2-烯酰CoA还原酶(TER)的基因产物不能自我催化三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂和/或蜡酯的合成，但是它的存在可增加所合成脂肪酸的数量。
本发明涉及包含本发明所述核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的基因构建体，其与异源核酸有效连接。
术语“有效连接”指如启动子、编码序列、终止子和/或更多调控元件的一系列组织，由此每一元件能够在核苷酸序列表达过程中实现其最初功能。
另外，本发明考虑了包含本发明的所述核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的载体。载体还包括含有选择标记基因和/或用于在宿主细胞中复制和/或整合到宿主细胞基因组中的核酸序列的表达载体。
此外，本发明涉及经细胞内构建体表达而在宿主细胞或其后代(包括遗传工程化油类种子、酵母和霉菌或任何其它积累油类的生物体)中产生由核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所编码TER的方法。特别感兴趣的是，本发明的核苷酸序列从优选在植物种子组织中表达的转录起始区表达。进一步考虑合成编码TER的人造基因序列，特别是提供植物优选密码子。由于TER编码序列的表达而包含TER的转基因细胞也考虑在本发明的范围内。
另外，本发明涉及包含所述核苷酸序列和/或所述基因构建体和/或所述载体的转基因细胞或生物体。本发明的进一步目标是真核细胞或真核生物体的转基因细胞或生物体。优选地，转基因细胞或生物体是酵母细胞、植物细胞或植物。本发明还涉及具有增强的用于三酰甘油合成所用底物产生的生物合成途径的所述转基因细胞或生物体。具有增加的脂类含量的转基因细胞或生物体也考虑在本发明的范围内。
再者，本发明涉及转基因细胞或生物体，其中由核酸序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所编码TER的活性在所述细胞或生物体中是增加的。TER活性的增加以基因表达、催化活性和/或酶活性调节的改变为特征。而且，本发明包括转基因细胞或生物体，其中用于三酰甘油合成所用底物产生的增强的生物合成途径是以例如增加的脂肪酸生物合成代谢前体的供应为特征。
在不同的实施方案中，本发明还涉及使用核酸序列SEQ ID NO1、SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10增加不同生物体细胞中脂类含量的方法。
此外，本发明使提高三酰甘油产量的方法成为可能，其包括在核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10表达的情况下使转基因细胞或生物体生长，以便在这些细胞中产生TER蛋白质从而使三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸产量增加。
编码TER的相应基因可以从其它生物体，特别是从裸藻门、裸藻目、裸藻属和/或裸藻亚属、Calliglena亚属或Discoglena亚属中分离。属于Calliglena亚属的种例如血红裸藻(Euglena sanguinea)、易变裸藻(Euglenamutabilis)、洁净裸藻(Euglena clara)、Euglena velata、敏捷裸藻(Euglenaagilis)、尾裸藻(Euglena caudate)、多形裸藻(Euglena polymorpha)、颗粒裸藻(Euglena granulata)、Euglena rostrifera、Euglena repulsans、Euglenaanabaena和Euglena satelles。属于裸藻亚属的种例如绿裸藻(Euglenaviridis)、Euglena stellata、膝曲裸藻(Euglena geniculata)、三星裸藻(Euglenatristella)和Euglena chadefaudii。属于Discoglena亚属的种例如梭形裸藻(Euglena acus)、Euglena texta、三棱裸藻(Euglena tripteris)、静裸藻(Euglena desces)、尖尾裸藻(Euglena oxyuris)、旋纹裸藻(Euglenaspirogyra)、Euglena helicoidea、近轴裸藻(Euglena proxima)和带形裸藻(Euglena ehrenbergii)。
编码TER的相应基因可以从密切相关的的属如柄裸藻属(Colacium)、变体裸藻属(Eutreptia)、Eutreptiella、扁裸藻属(Phacus)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、双板藻属(Cryptoglena)、囊裸藻属(Trachelomonas)、陀螺藻属(Strombomonas)、囊胞藻属(Ascoglena)、Klebsiella、变胞藻属(Astasia)、杆胞藻属(Rhabdomonas)、弦月藻属(Menoidium)、袋鞭藻属(Peranema)、异鞭藻属(Anisonema)、Tetreutreptia、Hyalophacus、克氏藻属(Khawkinea)、多形藻属(Distigma)、Cyclidiopsis、内管藻藻(Entosiphon)、Ploeotia、螺肋藻属(Gyropaigne)、Notoselenus、瓣胞藻属(Petalomonas)、Parmidium中分离。
本发明还涉及在其基因组或质体中包含根据上面由重组DNA技术转移的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的转基因生物体。本发明涵盖的一种重要类型的转基因生物体是其中所述核酸序列优选在贮藏器官特异性启动子控制下表达的商业相关植物。备选地，核酸序列也可以在种子特异性启动子控制下表达，或在适于在植物中进行组织特异性高水平表达的任何其它启动子控制下表达。
本发明还涉及由SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8或SEQ ID NO10的DNA分子所编码的蛋白质，或在转基因生物体中具有TER活性的其功能性生物学活性片段。备选地，本发明涉及在生物体中产生的蛋白质，所述生物体具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所示氨基酸序列或者与具有TER活性的所述氨基酸序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。
如实施例1所述，可从细小裸藻分离蛋白质，但也可以从其他生物体中分离。
TER可通过本技术领域众所周知的多种方法从植物材料中回收。在从植物器官中分离种子贮藏化合物之前，从其它组织或器官机械分离出植物器官。将组织匀浆之后，离心去除细胞碎片，保留含有可溶性蛋白质片段的上清液部分以备进一步纯化目的化合物。如果产物从培养基中生长的细胞中分泌，则通过低速离心从培养基中去除细胞，然后保留上清液部分以备进一步纯化。
将从任何一种纯化方法获得的上清液部分用适宜树脂进行色谱分析，其中目的分子保留在色谱树脂上而样品中的许多杂质则不保留，或者杂质保留在树脂上而样品不保留。如有必要，可以使用相同的或不同的色谱树脂重复此种色谱分析步骤。本技术领域中的技术人员非常精通适宜色谱树脂的选择以及它们对于待纯化特殊分子的最有效应用。纯化产物可通过过滤或超滤浓缩，并于产物稳定性最佳的温度下保存。
已有本技术领域中已知的大量纯化方法，前述纯化方法并不意味着是限制性的。此类纯化技术描述于例如Bailey J.E.和Ollis D.F.1986，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-HillNew York。本文描述的用于从细小裸藻进行纯化的纯化方法可以作为范例，并且此方法容易被本技术领域中的那些技术工人应用于其它生物体。
所分离化合物的鉴定和纯化可通过本技术领域中的技术标准进行评定。这些技术包括高效液相色谱(HPLC)、光谱学方法、染色方法、薄层层析法、分析型色谱法如高效液相色谱、NIRS、酶分析法或微生物学方法。此类分析方法综述于Patek等人(1994，Appl.Environ.Microbiol.60133-140)、Malakhova等人(1996，Biotekhnologiya 1l27-32)和Schmidt等人(1998，Bioprocess Engineer 1967-70)、Ulmann工业化学百科全书(1996，第A27卷，VCHWeinheim，第89-90页，第521-540页，第540-547页，第559-566，575-581页和第581-587页)和Michal G.(1999，BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wileyand Sons；Fallon，A.等人，1987，Applications of HPLC in Biochemistry在Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷)。
本发明此外还涉及根据SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的蛋白质或具有TER活性从而增加三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸产量的蛋白质衍生物的用途。
意外发现细小裸藻TER基因的异源性表达导致如实施例11所述的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)种子中三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸含量(贮藏油)的显著增加。与野生型对照植物相比脂类含量增加了5％左右，在一个转基因系中甚至增加了10％。编码TER蛋白质的核酸序列的过表达对于转化植物的生长或其它特性没有不利影响。
根据本发明的方法除了应用于模式生物拟南芥菜之外，在理论上还可应用于所有植物种类。根据本发明的方法优选应用于天然油类含量已经很高和/或用于工业生产油类的脂类农作物。
植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料通常被理解为同样能够进行光合作用的任何单细胞或多细胞生物体或者细胞、组织、器官、部分、细胞或繁殖材料(如种子和果实)。为了本发明的目的，包括植物界中高等植物和低等植物的所有属和种。优选一年生植物、多年生植物、单子叶植物和双子叶植物。还包括成熟植物、种子、芽和幼苗、部分、繁殖材料(例如块茎、种子或果实)以及来源于它们的培养物，例如细胞培养物或愈伤组织培养物。
植物包括所有一年生和多年生的单子叶植物或双子叶植物，并且以实例的方式包括但不限于南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、核桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、Solarium、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Cichorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、Panieum、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花Salpiglossis、香瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Triticum)、高粱属(Sorghum)、云杉属(Picea)和杨属(Populus)的植物。
优选的植物是来自下列科的植物苋科(Amaranthaceae)、Asteraceae、芸苔科(Brassicaceae)、Carophyllaceae、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、蝶形花亚科(Papilionoideae)百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、番苦木科(Tetragoniaceae)、山茶科(Theaceae)、伞形科(Umbelliferae)。
优选的单子叶植物特别是选自单子叶的农作物植物，例如禾本科(Gramineae)，诸如稻、玉米、小麦或其它谷类物种如大麦、粟和高梁、黑麦、黑小麦或燕麦，以及甘蔗和所有草本物种。
本发明非常特别优选应用于双子叶植物生物体。优选的双子叶植物尤其选自例如下列的双子叶农作物植物-Asteraceae科如向日葵(Heliantus annuus)、万寿菊或金盏花和其它，-菊科，特别是莴苣属，非常特别的是莴苣(sativa)和其它，-十字花科，特别是芸苔属，非常特别是欧洲油菜(napus)(油料种子油菜)、芸苔油菜(campestris)(甜菜)、oleracea cv Tastie(甘蓝)、oleracea cvSnowball Y(花椰菜)和oleracea cv Emperor(花茎甘蓝)以及其它甘蓝；和拟南芥属，非常特别是拟南芥菜(thaliana)以及水芹或芸苔和其它，-葫芦科如甜瓜、西葫芦/南瓜或胡瓜和其它，-豆科，特别是大豆属，非常特别是大豆(max)、黄豆和紫苜蓿、豌豆、豆类(beans)或花生以及其它，-茜草科，优选Lamiidae亚类如小果咖啡(Coffea arabica)或大果咖啡(Coffea liberica)(咖啡丛(coffee bush))和其它，-茄科，特别是番茄属，非常特别是番茄(esculentum)(西红柿)、茄属(Solanum)，非常特别是马铃薯(tuberosum)(土豆)和茄(melongena)(茄子)以及辣椒属，十分特别是辣椒(annuum)(胡椒)和烟草或红辣椒以及其它，-梧桐科，优选Dilleniidae亚类，例如可可树(Theobroma cacao)和其它，
-山茶科，优选Dilleniidae亚类，例如大叶茶(Camellia sinensis或Theasinensis)(茶树)以及其它，-伞形科，特别是胡萝卜属(非常特别是胡萝卜(carota))和芹菜属(Apium)(非常特别是旱芹(graveolens dulce)(celeary))以及其它；和亚麻子、棉花、大麻、亚麻、黄瓜、菠菜、胡萝卜、甜根菜(sugar beet)和各种各样的树、坚果和葡萄藤种类，特别是香蕉和猕猴桃。
也包括观赏植物、有用的或观赏性的树、花、鲜切花、灌木或草坪植物，其以实例的方式包括但不限于被子植物、苔藓类植物如苔纲(Hepaticae)(地钱)和藓纲(Musci)(苔藓)；蕨类植物如蕨类、木贼和石松；裸子植物如松柏、苏铁、银杏和Gnetatae；藻类如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophpyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、粘藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻)和裸藻纲(Euglenophyceae)。本发明范围内的植物以实例的方式包括但不限于蔷薇科如玫瑰、杜鹃花科如杜鹃花(rhododendron和azalea)、大戟科(Euphorbiaceae)如猩猩木和巴豆、石竹科(Caryophyllaceae)如石竹、茄科如矮牵牛、苦苣苔科(Gesneriaceae)如非洲紫罗兰、凤仙花科(Balsaminaceae)如凤仙花、兰科(Orchidaceae)如兰花、鸢尾科(Iridaceae)如唐菖蒲、鸢尾、香雪兰和番红花、菊科如万寿菊、牻牛儿苗科(Geraniaceae)如天竺葵、百合科如龙血树、桑科(Moraceae)如无花果、天南星科(Araceae)如cheeseplant以及许多其它植物。
另外，用于本发明目的的植物生物体是能够进行光合作用的生物体如藻类、蓝细菌和藓类。优选的藻类是绿藻如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻属(Volvox)或杜氏藻属(Dunaliella)。特别优选集胞藻属(Synechocystis)。
最优选的为油料作物。油料作物认为是天然高脂类含量的植物和/或可用于工业生产油类的植物。这些植物具有高脂类含量和/或其它具有工业价值的特殊脂肪酸成分。优选的植物是那些按重量计脂类含量为至少1％的植物。油料作物包括列举的植物Borvago officinalis(紫草)、芸苔属如芸苔油菜(B.campestris)、欧洲油菜(B.napus)、芜箐(B.rapa)、大麻(Cannabissativa)、红花(Carthamus tinctorius)、椰子(Cocos nucifera)、海甘蓝(Crambeabyssinica)、萼距花属(Cuphea)物种(萼距花属物种产生尤其用于工业应用的中等链长度的脂肪酸)、油棕(Elaeis guinensis)(非洲油棕榈)、美州油棕(Elaeis oleifera)(美国油棕榈)、大豆(Glycine max)、陆地棉(Gossypiumhirisutfum)(美州棉花)、海岛棉(Gossypium barbadense)(埃及棉花)、草棉(Gossypium herbaceum)(亚洲棉花)、向日葵(Helianthus annuus)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻子或胡麻)、月见草(Oenothera biennis)(夜来香)、油橄榄(Olea europaea)(橄榄)、稻(Oryza sativa)、蓖麻(Ricinus communis)、胡麻(Sesamum indicum)(芝麻)、小麦属(Triticum)物种(小麦)、玉蜀黍(Zeamays)(玉米)和各种各样的坚果种类如胡桃和扁桃。
“总脂类含量”指的是所有油类的总和，优选地指三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸的总和。
“脂类”包括中性和/或极性脂类以及这些脂类的混合物。表1中的那些脂类以实例的方式提及，但不受限定。
表1植物脂类的分类


中性脂肪优选地指三酰甘油。中性和极性脂类都包括大范围的多种脂肪酸。表2的脂肪酸以实例的方式提及，但不受限定。
表2多种脂肪酸概述(选择)

1链长度双键数目*植物中非天然存在油类优选指种子油。
总脂类含量的“增加”指植物或其部分、组织或器官、优选植物种子器官中脂类含量的增加。在此上下文，与不使用本发明方法但未进行另外修饰的起始植物相比，在其它相同条件下脂类含量增加至少5％、优选至少10％、特别优选至少15％、非常特别优选至少20％，最优选至少25％。本文中的条件指与萌芽、植物培育和生长有关的所有条件，如土壤条件、气候条件、光照条件、受精、灌溉、植物保护处理等等。
“TER”通常指那些具有反-2-烯酰CoA还原酶活性以及如果相应核酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10在产油生物体，尤其是微生物、酵母、真菌和植物中表达时导致脂类含量增加的所有蛋白质，并且所述蛋白质与SEQ ID NO2、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11相同或者与SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有同源性。
具体而言，TER指多肽序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11。
最优选地，TER指如SEQ ID NO2所示的细小裸藻蛋白质TER和功能等效物或其它上述功能等效物部分。
反-2-烯酰CoA还原酶可通过各种本技术领域中熟知的方法从不同的生物体或植物材料中获得。在从植物器官分离种子贮藏化合物之前，可从其它组织或器官中机械分离植物器官。将组织匀浆后，通过离心去除细胞碎片并保留含有可溶性蛋白质的上清液部分以备进一步纯化目的化合物。如果产物从培养的细胞中分泌出来，则通过低速离心从培养基中去除细胞并保留上清液部分以备进一步纯化。
使用适当树脂将从两种纯化方法获得的上清液部分进行色谱分析，其中目的分子保留在色谱树脂上而样品中的许多杂质则不保留，或者杂质被树脂保留而样品不保留。必要时，可使用相同或不同色谱树脂重复此色谱步骤。本技术领域中技术工人非常精通对适宜色谱树脂的选择以及它们对待纯化特殊分子的最有效应用。纯化产物可通过过滤或超滤来浓缩，并于产物稳定性最佳的温度下保存。
本技术领域中有大量已知的纯化方法，前述纯化方法并不意味着对纯化方法的限制。例如，此种纯化技术描述于Bailey J.E.和Ollis D.F.1986，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-HillNew York。本文描述的用于从细小裸藻纯化的纯化方法可作为范例，并且纯化方法可通过那些本技术领域中的技术人员容易地适用于其它生物体。
“功能等效物”特别指如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所示的细小裸藻TER蛋白质的天然突变体或人工突变体，以及来自其它属于例如裸藻门生物体的、与上面所定义TER具有相同基本特征的同源性多肽。突变体包括一个或更多个氨基酸残基的替代、增加、缺失、倒置或插入。
在本发明范围内有利应用的TER可以容易地通过使用如列举的SEQID NO2所示多肽序列或者如SEQ ID NO1所示编码所述多肽序列的核苷酸序列作为搜索序列或探针，进行数据库搜索或者筛选基因文库或cDNA文库而发现。
所述功能等效物与SEQ ID NO2蛋白质的同源性优选为至少60％，特别优选至少70％，特别优选至少80％，最优选至少90％。
此外，可以使用SEQ ID NO3核酸序列以便从生物体中鉴定和克隆编码与SEQ ID NO3具有至少60％的同源性的TER的基因。
SEQ ID NO2的功能等效物与SEQ ID NO2的同一性至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％，优选至少58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％，更优选71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％，最优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
此外，下列核酸序列可用于从不同生物体鉴定和克隆编码与SEQ IDNO2具有至少40％同一性的TER的基因来自SwissProt/TREMBL的序列(代码和物种)Q87QB9 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q8D8Y6 创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8PE66 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.Campestris)Q83EP5 伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii.)Q8PR25 地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodispv.Citri)Q8EG14 Shewanella oneidensisQ87CN3 苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)Q88E33 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Q8XIP1 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)Q8D795 创伤弧菌Q93HE4 阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)Q87HT6 副溶血弧菌来自PIR的序列(代码和物种)A83277 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)H82630 苛养木杆菌AD0498 鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)B82164 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)B82418 霍乱弧菌G96956 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)来自Genbank REFSEQ的序列(代码和物种)ZP00116993 哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)ZP00064975 Microbulbifer degradansZP00033810 Burkholderia fungorum表3显示了TER氨基酸序列与这些同源性核酸的氨基酸序列以及相应保守氨基酸残基的比较。保守残基显示为灰色阴影。在序列下方给出这些残基的一致残基大写字母代表强制(mandatory)残基；正常体字母给出了在此位置上强制相似性组中的最主要的氨基酸。
通过与功能性特征序列相比较，SEQ ID NO2中假定功能位点被确定为下列氨基酸段
●NADH结合位点SEQ ID NO2中第190-196位氨基酸(Jrnvall等人，(1995)，“Short-chaindehydrogenases/reductases(SDR)”.Biochem.346003-6013.)●短链脱氢酶/还原酶催化位点SEQ ID NO2中第231-238位和第279-285位氨基酸(Das等人(2000)“Molecular cloning and expression ofmammalian peroxisomal trans-2-enoyl-coenzyme A reductasecDNAs.”J.Biol.Chem.27524333-24340.)●FAD结合位点SEQ ID NO2中第515-520位氨基酸(Chang和Hammes(1989)“Homology analysis of the proteinsequences of fatty acid synthases from chicken liver，ratmammary gland，and yeast.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868373-8376.)
*20 *40 *60 *80 *TER MSCPASPSAAVVSAGALCLCVATVLLATGSNPTALSTASTRSPTSLVRGVDRGLMRPTTAAALTTMREVPQMAEGFSGEATSAWAAAGPQ 90Q88E33 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8D795 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8D8Y6 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8EG14 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8PE66 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8PR25 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8XIP1 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q93HE4 ------------------------------------------------------------------------------------------ -A83277 ------------------------------------------------------------------------------------------ -AD0498 ------------------------------------------------------------------------------------------ -B82164 ------------------------------------------------------------------------------------------ -B82418 ------------------------------------------------------------------------------------------ -G96956 ------------------------------------------------------------------------------------------ -H82630 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q83EP5 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q87CN3 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q87HT6 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q87QB9 ------------------------------------------------------------------------------------------ -ZP00033810 ------------------------------------------------------------------------------------------ -ZP00064975 ------------------------------------------------------------------------------------------ -ZP00116993 ------------------------------------------------------------------------------------------ -





两种多肽之间的同源性可理解为通过借助程序算法GAP(Wisconsin软件包，版本10.0，Wisconsin大学，遗传学计算机组(GCG)，Madison，美国)比较计算的全部序列长度范围内氨基酸序列的同一性，其中在所述算法中参数设定如下开口加权8长度加权2平均匹配2,912平均错配-2,003例如，与序列SEQ ID NO2在蛋白质水平具有至少80％同源性的序列可理解为当使用上述程序算法并使用上面设定的参数与序列SEQ IDNO2比较时具有至少80％同源性的序列。
例如，功能等效物还包括那些由与核酸序列SEQ ID NO1至少具有60％、特别优选至少70％、尤其优选至少80％、最优选至少90％同源性的核酸序列所编码的蛋白质。
两个核酸序列之间的同源性可理解为借助程序算法GAP(Wisconsin软件包，版本10.0，Wisconsin大学，遗传学计算机组(GCG)，Madison，美国)计算比较的全部序列长度范围内两个核酸序列的同一性，其中在所述算法中参数设置如下开口加权50长度加权3平均匹配10平均错配0例如，与序列SEQ ID NO1在核酸水平至少具有80％的同源性的序列可理解为当使用上述程序算法并使用上述设置的参数与序列SEQ IDNO1相比较时具有至少80％同源性的序列。
功能等效物还包括由这样一种核酸序列所编码的、并具有通过SEQ IDNO2所表征的TER基本特征的那些蛋白质，其中所述核酸序列在标准条件下与SEQ ID NO1所述核酸序列杂交或者与上述序列互补或部分互补的核酸序列杂交。
此外，通过本身已知的杂交技术从例如核酸序列SEQ ID NO1或SEQID NO3开始可以在多种其基因组序列未知的生物体中容易地发现TER的天然实例和相应基因。
杂交可以在温和(低严格性)或优选在严格(高严格性)条件下进行。
此类杂交条件尤其描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，第9.31-9.57页，或者Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
作为实例，在洗涤步骤中的条件可以从那些低严格性(2×SSC，50℃)和那些高严格性(0.2×SSC，50℃，优选65℃)所限定的条件范围内选择(20×SSC0.3M柠檬酸纳，3M氯化钠，pH7.0)。
此外，洗涤步骤过程中温度可以从室温22℃的温和条件提高到65℃的严格条件。
盐浓度和温度两个参数可以同时变化，而且也可以维持两个参数之一不变而只改变另一个参数。还可以在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在情况下，杂交优选在42℃进行。
一些可效仿的杂交条件和洗涤步骤列举如下(1.)杂交条件，例如(i)4×SSC，65℃，或(ii)6×SSC，45℃，或(iii)6×SSC，68℃，100mg/ml变性鱼精DNA，或(iv)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的片段化鲑精DNA，68℃，或(v)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，42℃，或(vi)50％甲酰胺，4×SSC，42℃，或(vii)50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃，或(viii)2×或4×SSC，50℃(温和条件)，或(ix)30-40％甲酰胺，2×或4×SSC，42℃(温和条件)。
(2.)洗涤步骤，每次洗涤10分钟，例如(i)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃，或(ii)0.1×SSC，65℃，或(iii)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃，或(iv)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，42℃，或(v)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃，或(vi)2×SSC，65℃(温和条件)。
此外，本发明还涉及能确保由SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所表征TER在植物生物体或所述植物生物体的组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中进行转基因表达的转基因表达构建体。
上面给出的定义可应用于TER，特别优选的是编码TER且通过SEQID NO1序列描述的核酸的转基因表达。
在所述转基因表达构建体中，编码TER的核酸分子优选处于与至少一种能够确保TER在植物生物体或同一生物体的组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中表达的遗传控制元件(例如启动子)的有效连接中。
特别优选的是转基因表达盒，其中编码TER的核酸序列通过下列序列描述a)序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或b)依照遗传密码简并性从SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10衍生的序列c)与序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10具有至少60％同一性的序列。
有效连接可理解为例如启动子与编码TER的可表达核酸序列(例如SEQ ID NO1所示序列)的连续排列，并且如果适当的话，还可以以如下方式存在更多的调控元件(如终止子)，即当核酸序列重组表达时每一个调控元件能实行其功能。对于本目的不需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列如增强子序列还可以从更离的位置或者甚至从其它DNA分子的位置对靶序列发挥它们的作用。优选的排列是那些排列，即待重组表达的核苷酸序列位于作为启动子的序列的后面，以致于两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达核苷酸序列之间的距离优选少于200个碱基对，特别优选少于100个碱基对，非常特别优选少于50个碱基对。
通过常规重组和克隆技术方式可以实现有效连接和转基因表达盒，所述重组和克隆技术描述于如Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy TJ，Berman ML和EnquistLW(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel FM等人(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience以及Gelvin等人(1990)Plant Molecular Biology Manual。然而，更多的序列如作为具有特异性限制性酶切位点或信号肽的接头也可以位于这两个序列之间。同样，序列的插入也导致融合蛋白的表达。优选地，包含与待表达核酸序列连接的启动子的表达盒可以是整合载体形式，并且可通过例如转化将其插入到植物基因组。
然而，转基因表达盒还理解为那些构建体，其中编码TER的核酸序列位于内源性植物启动子之后，以这样一种方式植物启动子引起TER的表达。
优选引入转基因表达盒的启动子是那些能在植物生物体或同一生物体的组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中有效的启动子。在植物生物体中有效的启动子可理解为能够控制基因(特别是外源基因)在植物或植物部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中表达的任何启动子。例如，在该情况下，表达可以是例如组成型的、可诱导的或生长依赖性的。
优选下列启动子a)组成型启动子“组成型”启动子指确保在大多数(优选全部)组织中在植物发育的重要时期(优选在植物发育的所有时期内)表达的那些启动子(Benfey等人，(1989)EMBO J 82195-2202)。特别优选使用植物启动子或植物病毒来源的启动子。特别优选启动子CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录本(Franck等人，(1980)Cell 21285-294；Odell等人，(1985)Nature 313810-812；Shewmaker等人，(1985)Virology 140281-288；Gardner等人，(1986)Plant Mol Biol6221-228)或19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人，(1989)EMBO J 82195-2202)。另一个适宜组成型启动子是核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank登录号X03677)、来自农杆菌属(Agrobacterium)的胭脂氨酸合酶启动子、TR双元启动子、来自农杆菌属的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛蛋白启动子(Holtorf S等人(1995)Plant Mol Biol 29637-649)、泛蛋白1启动子(Christensen等人，(1992)Plant Mol Biol 18675-689；Bruce等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、空泡ATP酶亚基启动子、拟南芥菜腈水解酶1基因启动子(GenBank登录号U38846，核苷酸3862至核苷酸5325或5342)或来自小麦的脯氨酸富含蛋白质启动子(WO 91/13991)和另外的技术人员已知在植物中组成型表达的基因的启动子。特别优选CaMV 35S启动子和拟南芥菜腈水解酶1基因启动子。
b)组织特异性启动子此外，优选具有种子特异性的启动子，例如菜豆蛋白启动子(US 5,504,200；Bustos MM等人，(1989)Plant Cell 1(9)839-53)、2S白蛋白基因启动子(Joseffson LG等人，(1987)J Biol Chem 26212196-12201)、豆球蛋白启动子(Shirsat A等人，(1989)Mol Gen Genet 215(2)326-331)、USP(未知种子蛋白质)启动子(Bumlein H等人，(1991)Mol Gen Genet225(3)459-67)、油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152；Stalberg K等人，(1996)L Planta 199515-519)、蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Bumlein H等人，(1991)Mol Gen Genet 225121-128；Bumlein等人，(1992)Plant Journal 2(2)233-9；Fiedler U等人，(1995)Biotechnology(NY)13(10)1090f)、拟南芥属油质蛋白启动子(WO98/45461)和芸苔属Bce4启动子(WO 91/13980)。
更多适宜的种子特异性启动子是那些编码高分子量麦谷蛋白(HMWG)、麦醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶或淀粉合酶的基因的启动子。进一步优选的启动子是那些允许在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中进行种子特异性表达的启动子。可以有利地采用lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389，WO 95/23230)或者如WO 99/16890中所述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。
c)化学诱导型启动子表达盒还包括化学诱导型启动子(综述文章Gatz等人，(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通过此种启动子可将外源基因在植物中的表达控制在特定时间点。此类启动子如PRP1启动子(Ward等人，(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水杨酸诱导启动子(WO95/19443)、苯磺酰胺诱导启动子(EP 0388186)、四环素诱导启动子(Gatz等人，(1992)Plant J 2397-404)、脱落酸诱导启动子(EP 0335528)或乙醇-环己酮诱导启动子(WO 93/21334)同样可以使用。适宜启动子还有谷胱甘肽-S转移酶异形体II基因(GST-II-27)启动子，其可通过外源性应用安全剂如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(WO 93/01294)而激活，并在单子叶植物和双子叶植物的大多数组织中是可使用的。
特别优选的是组成型启动子、非常特别优选种子特异性启动子、具体而言是油菜籽蛋白启动子和USP启动子。
此外，使得在另外的植物组织或其它生物体如大肠杆菌中表达成为可能的更多启动子可以与待表达的核苷酸序列有效连接。原则上，适宜的植物启动子是所有上述启动子。
存在于本发明的转基因表达盒或转基因载体中的核酸序列可以与除启动子以外的更多遗传控制序列有效连接。术语遗传控制序列可广义地理解，并且指对根据本发明的表达盒的确立或功能具有影响的所有那些序列。遗传控制序列会修饰例如原核和真核生物体的转录和翻译。根据本发明的转基因表达盒优选包含在每一情况中位于待重组表达核酸序列的5’上游的植物特异性启动子和3，下游的终止子序列(作为额外的遗传控制序列)以及(如果适当的话)在每一情况下与待重组表达核酸序列有效连接的更多常用调控元件。
遗传控制序列还包括能改善表达控制特性的更多启动子，启动子元件或最小启动子。因此，遗传控制序列可以引起额外依赖于一定应激因素的组织特异性表达。此类元件例如对于水分应激、脱落酸(Lam E和Chua NH，J Biol Chem 1991；266(26)17131-17135)和热应激(Schoffl F等人，(1989)Mol Gen Genetics 217(2-3)246-53)的元件。
例如，更多有利的控制序列有革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2，以及酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
原则上，具有类似上述调控序列的所有天然启动子可以用于根据本发明的方法。此外，合成启动子也可以有利地使用。
遗传控制序列还进一步包含基因的5’非翻译区、内含子或3’非编码区，例如肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(对于综合性参考文献见The Maize Handbook，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，NewYork(1994))。已经表明它们在调控基因表达方面发挥了重要作用。因此已经表明5’非翻译序列可加强异源基因的瞬时表达。以实例方式提到的翻译增强子有烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie等人，(1987)Nucl Acids Res158693-8711)等等。它们可进一步提高组织特异性(Rouster J等人，(1998)Plant J 15435-440)。
瞬时表达盒可有利地包含一种或更多与启动子有效连接的被称作增强子的序列，并且它们使核酸序列重组表达的增加成为可能。另外的有益序列如更多调控元件或终止子也可以插入到待重组表达核酸序列的3’末端。基因构建体中可以存在一个或更多个拷贝的待重组表达核酸序列。
适宜作为控制序列的多腺苷酸化信号是植物多腺苷酸化信号，优选基本对应于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多腺苷酸化信号那些多腺苷酸化信号，具体而言是那些Ti质粒pTiACHS的T-DNA基因3(章鱼碱合酶)多腺苷酸化信号(Gielen等人，(1984)EMBO J 3835以及下列等等)或其功能等效物。特别适宜的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂氨酸合酶)终止子。
控制序列可以进一步理解为那些使同源重组、插入宿主生物体基因组或从基因组中去除成为可能的序列。例如在同源重组的情况下，特异性内源基因的编码序列可以以定向形式与编码dsRNA的序列互换。方法如cre/lox技术允许将表达盒从宿主生物体基因组中以组织特异性(或许为诱导性)去除(Sauer B(1998)Methods.14(4)381-92)。在这里，一定的侧翼序列被加入到靶基因中(lox序列)，从而使以后通过cre重组酶的方法去除成为可能。
重组表达盒和来源于此的重组载体可包括更多的功能性元件。术语功能性元件应广义地理解，并且指影响根据本发明的表达盒、载体或转基因生物体产生、复制或功能的那些元件。可以提及的实例包括但不限于a)选择标记，其对新陈代谢抑制剂如2-脱氧葡糖-6-磷酸(WO98/45456)、抗生素或杀生物剂(优选除草剂)例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等等具有抗性。特别优选的选择标记是对除草剂具有抗性的那些标记。下面以举例的方式提到的有编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)和灭活谷氨酰胺合酶抑制剂(bar和pat基因)的DNA序列、赋予对草甘膦(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)、编码草甘膦降解酶(草甘膦氧化还原酶)的gox基因、deh基因(编码灭活茅草枯的脱卤素酶)、灭活磺酰脲类和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶基因、编码降解溴草腈的腈水解酶的bxn基因、赋予对抗生素apectinomycin抗性的aasa基因、抵抗链霉素的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、赋予对卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、赋予对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、赋予对磺酰脲类除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)基因(例如具有如S4和/或Hra突变的突变ALS变体)。
b)报告基因，其编码容易定量的蛋白质并允许通过其颜色或酶活性评价转化效率、表达位点或表达时间。在本文中非常特别优选的报告蛋白质(Schenborn E，Groskreutz D.Mol Biotechnol.1999；13(1)29-44)诸如“绿色荧光蛋白质”(GTP)(Sheen等人，(1995)Plant Journal 8(5)777-784)、氯霉素转移酶、荧光素酶(Ow等人，(1986)Science 234856-859)、水母发光蛋白基因(Prasher等人，(1985)Biochem Biophys Res Commun126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶，非常特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人，(1987)EMBO J 63901-3907)。
c)复制起点，其允许根据本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中复制。提到的例子有ORI(DNA复制的起点)、pBR322 ori或P15Aori(Sambrook等人Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
d)对于农杆菌介导的植物转化所需的元件，例如T-DNA左边界或右边界或vir区域。
为了选择已经成功进行同源重组的细胞或其它已成功转化的细胞，通常还需要额外引入选择标记，所述选择标记可以赋予成功经历重组的细胞对杀生物剂(如除草剂)、新陈代谢抑制剂例如2-脱氧葡糖-6-磷酸(WO98/45456)或抗生素的抗性。选择标记允许从未转化细胞中选择出已转化细胞(McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 581-84)。
此外，所述重组表达盒或载体可以包含不编码核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10并且其重组表达会导致脂肪酸生物合成增加的更多核酸序列。此种核酸序列的实例(但不限于此)如额外重组表达的proOIL核酸序列，其选自编码乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)、二酰基甘油酰基转移酶(DAGAT)和磷脂二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)的核酸。此类序列对于技术人员是已知的，并且容易从相应植物的数据库或适宜cDNA文库中获得。
根据本发明的表达盒可以有利地通过使用重组表达盒所存在的载体导入生物体或其细胞、组织、器官、部分或种子(优选导入植物或植物细胞、组织、器官、部分或种子)。因此本发明进一步涉及包含核酸序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的重组表达盒的所述重组载体。
例如，载体可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒或者农杆菌。表达盒可以经适宜限制性酶切位点导入载体(优选质粒载体)。首先将获得的载体导入大肠杆菌。选择正确转化的大肠杆菌并使其生长，使用技术人员已知的方法获得重组载体。可使用限制性分析和测序验证克隆步骤。优选的载体是那些能够将表达盒稳定整合入宿主基因组的载体。
本发明还涉及包含如上定义的SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10、序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的转基因表达盒或者包含此表达盒的转基因载体的转基因植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料。
通过例如相应蛋白质或核酸的转化或转染产生此类转基因植物生物体。转化生物体(或转化细胞或转化组织)的产生需要向所述宿主细胞导入所述DNA(例如表达载体)、RNA或蛋白质。对于转化(或转导或转染)这一过程有多种方法可以使用(Keown等人，(1990)Methods in Enzymology185527-537)。因此，DNA或RNA可通过例如显微注射或用DNA包被的微粒进行轰击直接导入。还可使用例如聚乙二醇将细胞进行化学透化，从而DNA通过融合到达细胞。还可通过与含有DNA的单位(如小细胞、细胞、溶酶体或脂质体)进行原生质体融合将DNA导入。电穿孔对于DNA导入是更适宜的方法；在电穿孔中，通过电脉冲将细胞进行可逆性透化处理。在DNA溶液中浸泡植物部分以及花粉或花粉管转化也是可能的。此种方法已有描述(例如，Bilang等人，(1991)Gene 100247-250；Scheid等人，(1991)Mol Gen Genet 228104-112；Guerche等人，(1987)Plant Science52111-116；Neuhaus等人，(1987)Theor Appl Genet 7530-36；Klein等人，(1987)Nature 32770-73；Howell等人，(1980)Science 2081265；Horsch等人，(1985)Science 2271229-1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology91694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach编)Academic Press Inc.(1988)和Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski编)Academic Press Inc.(1989))。
对于植物转化，可以使用双元载体如pBinAR(Hfgen和Willmitzer1990，Plant Sci.66221-230)。双元载体的构建可通过将cDNA以正义或反义方向连接入T-DNA来实现。cDNA 5’端的植物启动子激活cDNA的转录。多腺苷酸化序列定位于cDNA的3’端。通过使用组织特异性启动子实现组织特异性表达。例如，可通过将油菜籽蛋白、LeB4或USP启动子克隆入cDNA的5’端实现种子特异性表达。还可以使用任何其它的种子特异性启动子元件。为了在整个植物内组成型表达，可使用CaMV 35S启动子。可使用如质体、线粒体或内质网的信号肽(Kermode 1996，Crit.Rev.Plant Sci.15285-423)将所表达蛋白质定向靶向细胞区室。将信号肽以与cDNA相同的阅读框克隆入5’端以实现融合蛋白的亚细胞定位。
植物双元载体的更多实例为TER候选基因被克隆入其中的pSUN300载体。这些双元载体包含在Nos启动子控制下驱动的抗生素抗性基因和位于带有OCS终止子的候选基因之前的USP种子特异性启动子，见图4。将TER cDNA以正义方向克隆入植物双元载体中位于USP种子特异性启动子后面的多克隆位点。使用标准条将将包含目的基因的重组载体转化入Dh5α细胞(Invitrogen)。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上于37℃过夜生长筛选转化细胞。使用QIAprep Spin小量制备试剂盒(Qiagen)根据厂商提供的说明书提取质粒DNA。根据标准分子生物技术(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual.第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，NY)进行亚克隆分析和限制酶切作图分析。
在植物中，已经描述的转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法可用于瞬时转化或稳定转化。适宜的方法特别是通过聚乙二醇介导DNA摄取的原生质体转化、使用基因枪的生物射弹方法(其称作粒子轰击方法)、电穿孔、干胚胎在含DNA溶液中孵育和显微注射。
除了此类“直接”转化技术之外，还可能通过根癌农杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的细菌感染以及通过转基因病毒感染将相应重组Ti质粒或Ri质粒转移实现转化。农杆菌介导的转化最适合双子叶植物的细胞。这些方法描述于例如Horsch RB等人，(1985)Science 2251229f。
当使用农杆菌时，表达盒要整合入特异质粒中(或者是穿梭载体或者是双元载体)。如果使用Ti或Ri质粒进行转化，Ti或Ri质粒T-DNA中至少右边界(但在多数情况下是右边界和左边界)与待导入表达盒(作为侧翼区)有效连接。
优选使用双元载体。双元载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。通常，双元载体包括选择标记基因和两侧为T-DNA右侧和左侧边界序列的接头或多接头。它们可直接转化入农杆菌(Holsters等人，(1978)Mol Gen Genet163181-187)。选择标记基因，例如赋予对卡那霉素抗性的nptII基因，允许选择出转化的农杆菌。在此情况下，作为宿主生物体的农杆菌应该已包括带有vir区域的质粒。在将T-DNA转移入植物细胞中需要该质粒。以这种方式转化的农杆菌可用于转化植物细胞。用于植物细胞转化的T-DNA的用途已经广泛地进行了研究和描述(EP 120516；Hoekema，在The Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，第V章；An等人，(1985)EMBO J 4277-287)。已知多种不同双元载体，其中一些是有商业可得的，如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.美国)。
已经描述了适于在植物中表达的其它启动子(Rogers等人，(1987)Meth in Enzymol 153253-277；Schardl等人，(1987)Gene 611-11；Berger等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 868402-8406)。
直接转化技术适用于任何生物体和细胞类型。在将DNA或RNA注射进入或电穿孔进入植物细胞的情况下，所使用质粒不需要满足任何特殊要求。简单的质粒如那些来自pUC系列的质粒也可以使用。如果从转化植物中再生出完整植物，则在质粒中需要存在额外的选择标记基因。
当选择标记是所插入DNA的一部分时，可以将稳定转化的细胞(即包含已整合入宿主细胞DNA的插入DNA的那些细胞)从未转化细胞中选择出来。能够赋予对抗生素或除草剂(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等)的基因可作为选择标记(见上)。表达此类标记基因的转化细胞能够在存在杀死未转化野生型细胞的浓度的抗生素或除草剂情况下存活。实例为上述提到的那些，并且优选包含赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(Rathore KS等人，(1993)Plant Mol Biol 21(5)871-884)、赋予对卡那霉素抗性的npII基因、赋予对潮霉素抗性的hpt基因或赋予对除草剂草甘磷抗性的EPSP基因。选择标记允许从未转化细胞中选择出转化的细胞(McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 581-84)。所获得植物可以常规方式培育和杂交。为了确保基因组整合具有稳定性和遗传性，应该生长两代或更多代。
上述方法描述于例如Jenes B等人，(1993)Techniques for GeneTransfer，在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，SDKung和R Wu编，Academic Press，第128-143页和Potrykus(1991)AnnuRev Plant Physiol Plant Molec Biol 42205-225。待表达的构建体优选克隆入适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等人，(1984)NuclAcids Res 128711f)。
对本文描述的TER核酸进行农杆菌介导的植物转化可以使用标准转化和再生技术进行(Gelvin，Stanton B.和Schilperoort R.A，Plant MolecularBiology Manual，第2版.Kluwer Academic Publ.，Dordrecht 1995in Sect.，Ringbuc Zentrale SignaturBT11-P；Glick，Bernard R.和Thompson，JohnE.Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，S.360，CRCPress，Boca Raton 1993)。例如，使用GV3(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株进行农杆菌介导的转化。
可以根据标准条件(Bechtold 1993，Acad.Sci.Paris.3161194-1199；Bent等人，1994，Science 2651856-1860)使拟南芥菜生长和转化。另外，可经过子叶或胚轴(Moloney等人，1989，Plant Cell Report 8238-242；DeBlock等人，1989，Plant Physiol.91694-701)将本发明的TER核酸转化入油菜籽。对农杆菌抗生素的使用和植物筛选取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。通常使用卡那霉素作为植物选择标记来选择油菜籽。此外，向胡麻进行农杆菌介导的基因转移可使用例如Mlynarova等人(1994，Plant Cell Report 13282-285)描述的技术实现。
大豆的转化可使用例如EP 0424047，U.S.5,322,783(Pioneer Hi-BredInternational)或EP 0397687，U.S.5,376,543或U.S.5,169,770(Toledo大学)中描述的技术进行。在室温下用70％的乙醇通过连续摇动将大豆种子表面灭菌4分钟后，在补充有0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)Clorox中连续摇动20分钟。然后用蒸馏水冲洗种子4遍，并置于Petri培养皿中的潮湿的无菌滤纸上室温6-39小时。剥离种皮，并从胚轴分离子叶。检查胚轴以确保分生组织区域未被破坏。在半开的无菌Petri培养皿内收集离体的胚轴，并在密封Petri培养皿中空气干燥至水分含量小于20％(鲜重)直到进一步使用。
从添加适当抗生素(例如100mg/l链霉素、50mg/l卡那霉素)的LB固体培养基中的单菌落制备根癌农杆菌培养物，然后将单菌落在液体LB培养基内生长至600nm处光密度为0.8。接着，于室温下7000转/分离心7分钟沉淀细菌培养物，沉淀在补充有100mM乙酰丁香酮的MS培养基(Murashige和Skoog 1962，Physiol.Plant.15473-497)中重悬。在使用前，将细菌培养物在该预先诱导培养基中室温培养2小时。大豆合子种子胚轴在大约44％的水分含量下用预先诱导农杆菌重悬培养物室温浸渗2小时(用农杆菌培养物浸渗干胚芽也适用于玉米胚轴)。
胚芽从浸渗培养液中移出并转移入含有2％蔗糖的固体MS培养基的Petri培养皿中于室温黑暗条件下培养2天。备选地，胚芽置于Petri培养皿中湿润(液体MS培养基)的无菌滤纸上，并在与上述相同条件下培养。在该阶段之后，将胚芽转入含有能杀死农杆菌的500mg/l卡那霉素或300mg/l头孢噻肟的固体或液体MS培养基中。
植物转化的方法也适用于芸苔属或其它农作物。具体而言，将芸苔种子用70％乙醇于室温下连续摇动进行表面灭菌4分钟之后，在补充有0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)Clorox中于室温下连续摇动20分钟。然后用蒸馏水冲洗种子4遍，并将种子置于Petri培养皿中潮湿的无菌滤纸上室温18个小时。剥离种皮，种子在半开的无菌Petri培养皿中进行空气干燥过夜。在这期间，种子损失其水分含量的大约85％。然后将种子室温保存于密封Petri培养皿内直至进一步使用(与用于大豆胚芽方法中所描述相似)。
一旦产生转化植物细胞，可使用技术人员知道的方法获得完整的植物。例如，使用愈伤组织培养物作为起始材料。枝或根的发育可以已知的方式在该尚未分化细胞生物量(biomass)中诱导。获得的植物苗可移植到户外并用于培育。
技术人员熟悉从植物细胞再生植物部分和完整植物的此类方法。例如，可用于此目的的方法例如Fennell等人，(1992)Plant Cell Rep.11567-570；Stoeger等人，(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等人，(1994)TheorAppl Genet 89525-533中描述的那些方法。
例如以TER为例，“转基因”指包含所述TER核酸序列的核酸序列、表达盒或载体或者指用所述核酸序列、表达盒或载体或通过重组方法建立的所有那些构建体转化的生物体，其中a)编码TER的核酸序列，或b)与a)中的所述核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如在植物生物体中有功能的启动子没有处于其天然遗传环境中或者已经通过重组方法进行了修饰，修饰例如一个或多个核苷酸残基的替代、加入、缺失、倒置或插入是可能的。天然遗传环境指来源生物体或在基因组文库中存在的天然染色体位点。以基因组文库为例，优选至少在某种程度上保留核酸序列的天然遗传环境。核酸序列的至少一侧为其天然遗传环境，并且天然遗传环境中的序列长度至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、非常特别优选至少5000bp。天然存在的表达盒(例如天然存在的编码TER的基因的启动子和相应TER基因的组体)在通过非天然的、合成的(“人工的”)方法例如诱变处理将TER的基因进行修饰时，则变成转基因表达盒。此类方法描述于US 5,565,350；WO 00/15815，还可参见上面。
优选作为转基因生物体的宿主或起始生物体首先是符合上述定义的植物。为了本发明的目的，包括植物界中高等植物和低等植物的所有属和种，特别是用于获得油类的植物，例如芜箐、向日葵、芝麻、红花、橄榄、大豆、玉米、小麦和坚果物种。还包括成熟植物、种子、根和苗和部分、繁殖材料和其衍生的培养物如细胞培养物。成熟植物指幼苗期以外的任何发育阶段的植物。幼苗指处于早期发育阶段的幼小的、未成熟植物。
用上述用于生物体转化或转染的方法产生转基因生物体。
本发明还涉及根据本发明的转基因生物体的用途以及用于生产粮食、饲料、药物或精细化学药品特别是油类、脂肪、脂肪酸或其衍生物的细胞、细胞培养物、部分(如转基因植物生物体的根、叶等等)以及转基因繁殖材料如从中衍生的种子或果实。
SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQID NO10或其衍生物在植物中进行转基因表达除了影响脂类含量以外，还介导其它有益作用，例如增加应激抵抗力。例如，盐土和水中出现的此种渗透应激是农业中日益突出的问题。例如，增加应激耐受力使得能够将常规可耕种植物生长不旺盛的区域用于农业使用。
在本技术领域中已经较好地建立了酶活性和动力学参数的测定。可根据Inui等人，(1984)，European J.Biochem.142121-126测定TER活性。
可以在转录或/和翻译水平测定转化宿主生物体中的重组基因产物的活性。确定基因转录水平(基因产物翻译可利用的mRNA数量的指示)的有用方法是Northern印迹(对于参考文献见例如Ausubel等人，1988，Current Protocols in Molecular Biology，WileyNew York)，其中设计结合目的基因的引物用可检测标签(通常为放射性或化学发光标签)进行标记，以致于当从生物体培养物提取总RNA，在凝胶上进行电泳，转移至稳定基质并用探针进行孵育时，探针的结合和结合数量提示该基因mRNA的存在以及mRNA的数量。此信息至少部分说明了转化基因的转录程度。通过几种方法从植物细胞、组织或器官中制备总的细胞RNA，所述方法是本技术领域中众所周知的，例如描述于Bormann等人，(1992，Mol.Microbiol.6317-326)的方法。
为确定由此mRNA翻译的蛋白质的存在和相对量，可以使用标准技术，例如Western印迹(见例如Ausubel等人，1988，Current Protocols inMolecular Biology，WileyNew York)。在此方法中，提取总细胞蛋白质，经凝胶电泳分离，转移至基质如硝酸纤维素膜，并用探针如特异性结合目的蛋白质的抗体孵育。该探针通常标有容易检测的化学发光标签或显色标签。观察到标签的存在和标签的量指示了细胞中目的突变体蛋白质的存在和数量。
植物中的遗传修饰对目的种子贮藏化合物如三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸的影响可通过如下确定，即使修饰植物在适宜条件下生长并且分析种子或其它植物器官中目的产物的产量是否增加。此类分析技术对于本技术领域中的技术人员是熟知的，其包括光谱学、薄层色谱法、各种类型染色法、酶学和微生物学方法以及分析型色谱法如高效液相色谱(见例如，Ullman 1985，Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第89-90页和第443-613页，VCHWeinheim；Fallon，A等人，1987，Applications of HPLC in Biochemistry在Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等人，1993Productrecovery and purification，Biotechnology，第3卷，第III章，第469-714页，VCHWeinheim；Belter，P.A.等人，1988Bioseparationsdownstreamprocessing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy J.F.和CabralJ.M.S.1992，Recovery processes for biological materials，John Wiley andSons；Shaeiwitz J.A.和Henry J.D.1988，Biochemical separations在Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，Separation andpurification techniques in biotechnology，第B3卷，第11章，第1-27页，VCHWeinheim和Dechow F.J.1989)。
除了上述方法之外，如Cahoon等人，(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，2212935-12940)和Browse等人，(1986，Anal.Biochemistry442141-145)所述，可从植物材料中提取植物脂类。脂肪酸的定性和定量分析描述于Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology.Ayr/ScotlandOily Press.-Oily Press Lipid Library；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr，ScotlandOilyPress，1989Repr.1992.-IX，307S.-Oily Press Lipid Library；和Progressin Lipid Research，OxfordPergamon Press，1(1952)-16(1977)Progressin the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN。
脂肪酸产物存在的明确证明可通过根据标准分析方法如Christie及其参考文献(1997在Advances on Lipid Methodology第4版Christie，OilyPress，Dundee，第119-169页；1998)多方面描述的GC、GC-MS或TLC分析转基因植物来获得。关于叶的详细方法由Lemieux等人描述(1990，Theor.Appl.Genet.80234-240)，而关于种子的详细方法由Focks和Benning描述(1998，Plant Physiol.11891-101)。
甘油骨架的C-1、C-2或C-3位置的脂肪酸组成分析通过脂肪酶消化确定(见例如Siebertz和Heinz 1977，Z.Naturforsch.32c193-205和Christie 1987，Lipid Analysis第2版，Pergamon Press，Exeter，ISBN0-08-023791-6)。
例如，一般使用例如14C-醋酸盐或14C-丙酮酸盐标记叶或种子，通过分析碳流动(见例如Focks和Benning 1998，Plant Physiol.11891-101；Eccleston和Ohlrogge 1998，Plant Cell 10613-621)收集关于脂类和糖生物合成途径中蛋白质活性增加或减少所产生影响的信息。碳-14在脂类和水溶性成分中的分布可在分别分离(例如在TLC板上)(包括14C-蔗糖和14C-苹果酸之类的标准)后通过液体闪烁计数进行测定(Eccleston和Ohlrogge1998，Plant Cell 10613-621)。
待分析的材料可经超声处理、玻璃研磨、液氮和磨碎或经其它适用方法进行碎裂。材料破碎后必须离心。将沉淀重悬于蒸馏水中，于100℃加热10分钟，冰上冷却，再次离心后在含有2％二甲氧基丙烷的溶于甲醇的0.5M硫酸中于90℃提取1小时，导致产生水解油类和脂类化合物从而获得转甲基脂类。在石油醚中提取这些脂肪酸甲基酯，最后使用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52CB，25m，0.32mm)进行GC分析，分析时于170℃-240℃间的温度梯度下20分钟并且于240℃下5分钟。对所获得脂肪酸甲基酯的鉴定可通过使用可得的商业化来源(即Sigma)标准进行定义。
在没有脂肪酸标准的情况下，通过衍生作用和随后的GC-MS分析鉴定分子。例如，三键脂肪酸的定位经4，4-二甲基-噁唑啉衍生作用后经GC-MS显示(Christie，Oily Press，Dundee，1998)。
例如，可以构建含有本文公开的核酸或其片段的酵母表达载体，并使用标准方法转化入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。然后，分析所得到转基因细胞中的糖、油类、脂类或脂肪酸含量的改变。
同样地，可以构建包含本文公开的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或其片段的植物表达载体，并使用标准方法转化入适宜植物细胞如拟南芥菜、大豆、芸苔、玉米、小麦、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)等。然后，分析所得到转基因细胞和/或来源于其的植物中油类、脂类或脂肪酸含量的变化。
另外，本文公开的序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或其片段可用来在多种生物体如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞的基因组中产生敲除突变(Girke等人，1998，Plant J.1539-48)。然后，评价所得到敲除细胞中种子贮藏混合物的组成和含量，以及突变对表型和/或基因型的影响。对于其它基因失活的方法包括US 6,004,804“非嵌合体突变载体”和Puttaraju等人的方法(1999，“Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy”Nature Biotech.17246-252)。
现在已经概括描述的本发明可通过参照下面的实施例更容易地理解，所述实施例仅仅是为了说明的目的，其并不旨在限制本发明的范围。
实施例常规方法常规克隆过程克隆过程例如限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、核酸转移至硝酸纤维素膜和尼龙膜、DNA片段的连接、转化大肠杆菌和酵母细胞、细菌的生长以及重组DNA的序列分析按照Sambrook等人(1989，ColdSpring Harbor Laboratory PressISBN 0-87969-309-6)或Kaiser，Michaelis和Mitchell(1994，“Methods in Yeast Genetics”，Cold SpringHarbor Laboratory PressISBN 0-87969-451-3)中所描述进行。
化学药品如果在文中没有另外指出，所用化学药品以p.a.质量从Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司获得。使用来自Milli-Q水系统水净化装置(Millipore，Eschborn)的净化无热原水(在下文中指定为H2O)制备溶液。限制性内切酶、DNA修饰酶和分子生物学试剂盒从AGS(Heidelberg)、Amersham (Braunschweig)、Biometra(Gttingen)、Boehringer(Mannheim)、Genomed(Bad Oeynnhausen)、New EnglandBiolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison，Wisconsin，USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Amsterdam，Netherlands)公司获得。如果不另外指出，按照制造商的说明使用。
植物生长拟南芥菜植物生长于如Ogas等人(1997，Science 27791-94；1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9613839-13844)所描述的Murashige-Skoog培养基中或者生长于如Focks和Benning(1998，Plant Physiol.11891-101)所描述的标准条件下的土壤中。
实施例1来自细小裸藻的反-2烯酰辅酶A还原酶(TER)的生物化学纯化1千克细小裸藻Z株细胞在需氧条件下生长1周用作起始材料。
裸藻培养在BIOSTAT B 10L发酵灌(Braun Biotech)中进行。培养条件如下培养体积为7升、光强度为5000lx持续光照、温度为28℃、以200转/分搅拌。将Ogbonna，J.C.等人(1981)J.Appl.Phycol.1067-74和Yamane，Y等人(2001)Biotech.Lett.231223-1228所描述的确定成分培养基改良并使用。1升培养基由12g葡萄糖；0.8g KH2PO4；1.5g(NH4)2SO4；0.5g MgSO4×7H2O；0.2g CaCO3；0.0144g H3BO3；2.5mg维生素B1；20μg维生素B12；1ml痕量元素溶液和1ml铁溶液组成。痕量元素溶液为每100ml蒸馏水中包含4.4g ZnSO4×7H2O；1.16g MnSO4×H2O；0.3g Na2MoO4×2H2O；0.32g CuSO4×5H2O和0.38g CoSO4×5H2O并且铁溶液为每100ml蒸馏水中包含1.14g(NH4)2SO4Fe(SO4)2×6H2O和1gEDTA。在培养期间培养基的pH维持在2.8并且向培养物通以2升/分钟的空气。
在使用标准技术收获培养物之后，使用弗氏细胞压碎器(French Press)破碎细胞。30％硫酸铵溶解(cut)用于去除细胞碎片。透析之后，进行一系列层析纯化步骤，见表4。它们包括离子交换层析(DEAE-Fraktogel)、疏水相互作用(phenylsapharose)、亲和层析(Reaktive Red 120)和羟磷灰石层析法。相应的纯化水平见表4。而且，完备的纯化方案还包括另外的离子交换层析(Mono Q)，经制备型凝胶纯化以及通过Superdex 200的最终凝胶过滤。此方案达到1600倍以上的纯化。
纯化步骤的细节如下使用FPLC系统(Amersham Biosciences)开展全部层析步骤。根据厂商提供的说明书装填所有柱子或使用预装柱。所有缓冲液经0.45μm硝化纤维素滤膜(Sartorius，Gttingen)过滤并去除气体。经弗氏细胞压碎器破碎和30％硫酸铵溶解之后，使用DEAE-Fraktogel EMD650S(Merck)进行第一次层析步骤。在大小为2.6×12cm的XK 26柱(Amersham Biosciences)上进行10轮层析并且使用0-1M线性梯度KCl(25mM磷酸钾缓冲液pH6.8，含有1mM EDTA、1mM DTT和1μM FAD)进行洗脱。将活性级分混合并在XK 26柱(2.6×14cm)上进行4轮PhenylSepharose 6 Fast Flow low sub(Amersham Biosciences)层析。使用1M-0M的NH4(SO4)2线性梯度(溶于10mM Tris-HCl pH 8.0，含有1mM EDTA、1mM DTT和1μM FAD)洗脱。将活性级分混合并在XK 16柱(1.6×9cm)柱上进行5轮Reaktive Red 120(Sigma)层析。使用0-1M KCl的线性梯度(25mM磷酸钾缓冲液pH 6.8，含有1mM EDTA、1mM DTT和1μMFAD)洗脱。再次将活性级分混合并使用Eco-Pac CHT IICartridge(Bio-Rad，München)在羟磷灰石基质上进行8轮层析。使用从10mM到500mM的线性梯度磷酸钾缓冲液(pH6.8，含1mM DTT和1μMFAD)洗脱。将活性级分混合并在Mono Q HR 5/5柱(Amersham Biosciences)上进行3轮层析。使用0到1M线性梯度的KCl(溶于10mM Tris-HCl pH8.0，含1mM EDTA、1mM DTT和1μM FAD)洗脱。
将活性级分混合并按照制造商的说明书在Mini Prep Cell(Bio-Rad)中进行6轮6％的连续天然聚丙烯酰胺凝胶层析。将活性级分混合并在Superdex 200HR 10/30柱(Amersham Biosciences)上进行3轮层析。用含有150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA和1μM FAD的10mMTris-HCl pH 8.0洗脱。使用标准方法将活性级分进行SDS-PAGE。最终的酶制剂显示为在44kDa附近非常接近的一条主带和一条次带，见图2。
当用标准方法进行SDS-PAGE凝胶(12％)电泳时，最终的酶制剂显示为在44kDa附近非常接近的一条主带和一条次带。
使用如Inui，H等人(1984)Eur.J.Biochem.142121-126所描述且进行以下修饰的方法测量酶活性。测定混合物包含100mM磷酸钾缓冲液pH6.2；0.75mM丁烯酰辅酶A(Sigma)；0.4mM NADH和2μM FAD和酶。不含底物的测定混合物在30℃预孵育10分钟。反应也于30℃进行并从加入底物开始。通过340nm处吸光度的降低来测定活性。最终测定体积是1ml(Ultrospec 2000分光光度计，Amersham Biosciences)或200μl(GENios微量滴定板读取仪，Tecan Instruments，Maennedorf，Switzerland)。
图2显示了不同纯化步骤后TER在SDS-PAGE凝胶(12％)中的蛋白质模式。酶活性与较上的主带相关。
表4从1000g裸藻细胞开始进行的反-2-烯酰辅酶A还原酶的纯化

实施例2从细小裸藻细胞分离总RNA和poly-(A)+RNA为了研究转录本，分离了总RNA和poly-(A)+RNA。按照下面的方法从细小裸藻细胞中分离RNA分离总DNA的细节涉及使用5克鲜重的裸藻。材料在液氮条件下于研钵中研磨成细粉并溶于20ml重悬缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0；100mM NaCl；10mM EDTA；30mM 2-巯基乙醇；2％(w/v)SDS；4M异硫氰酸胍；5％(w/v)Polyclar)。将匀浆液转入锥形管并使用相同体积苯酚/氯仿/异丙醇通过振荡进行提取。提取物于室温5000g离心5分钟进行相分离。用冰冷的异丙醇在-20℃沉淀核酸60分钟，然后于4℃6000g离心20分钟，并将沉淀重悬于含有10μg/ml蛋白酶K的5ml TE缓冲液中。用1.25ml 10M LiCl于-20℃过夜沉淀RNA，然后在4℃于10000g离心30分钟进行沉淀。RNA沉淀重悬于5ml DEPC处理的水中，为了进一步纯化可再次使用乙醇于-20℃沉淀2小时。最后通过在4℃于10000g离心20分钟获得最终的RNA沉淀。将总RNA稀释于2ml TE并测定浓度。
使用Amersham Biosciences的采用oligo(dT)-纤维素柱的mRNA纯化试剂盒从总RNA中制备mRNA。
实施例3cDNA文库的构建为了构建cDNA文库，使用莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(AmershamBiosciences，Freiburg，德国)和oligo-d(T)引物完成第一条链的合成，通过与DNA聚合酶I、Klenow酶孵育并用RNA酶H于12℃消化(30分钟)和22℃消化(1小时)来完成第二条链的合成。在65℃孵育(10分钟)终止反应，随后转移至冰上。通过苯酚/氯仿抽提和Sepharose CL-4B去除核苷酸。使用T4-DNA连接酶(Amersham Biocsciences，12℃过夜)将EcoRI/NotI接头(Amersham Biosciences，Freiburg)连接到cDNA末端并通过多核苷酸激酶孵育(Amersham Biosciences，37℃，30分钟)将该接头磷酸化。过量的接头通过Sepharose CL-4B除去。cDNA分子连接到载体臂上，并使用GigapackIII Gold试剂盒(Stratagene，Amsterdam，荷兰)中的材料并按照厂商提供的说明书将其包装入λZAPII噬菌体。
使用ExAssist辅助噬菌体(Stratagene，荷兰)通过体内切除从cDNA库产生pBluescript噬菌粒用于进一步分析。
实施例4通过肽指纹法和随后相应cDNA的克隆鉴定TER蛋白质的序列将生物化学纯化的TER进行SDS-PAGE电泳后出现44kDa的双带。从凝胶上分别切下主带和次带并使用标准方法用胰酶消化。所得到的肽用从凝胶提取，再按照标准方法使用ESI-Q-TOF MS/MS分析。两个带产生了完全相同的肽，这证实与Inui和同事的描述(Inui，H.等人，(1986)J.Biochem.100995-1000)相比，TER作为单一亚单位酶被完全纯化。下面是使用ESI-Q-TOF MS/MS鉴定的肽肽1 ACLKPLGATYTNR肽2 AALEAGLYAR肽3 VLVLGCSTGYGLSTR肽4 TDPAT肽5 SLDGDAFDSTTK肽6 DLWSQVNTANLK肽7 AGWYNTVAFEK肽8 RVQEELAYAR肽9 DLSDFAGYQTEFLR肽10 LYPGDGSPLVDEAGR肽11 LTQQYGCPAYPVVAK肽12 VDDWEMAEDVQQAVK肽13 STGYG(AMVR/LSEK)肽14 AHPPTSPGPK肽15 ALSEAGVLAEQK肽16 ((GT)/(AS))HEGCLEQMVR
肽17 LYPENGAPLVDEQR根据这些肽设计简并引物并用于以cDNA为模板的PCR。由于细小裸藻中的核酸GC含量高，在PCR之前要在98℃初始变性10分钟。PCR条件如下94℃，30秒；50℃，30秒和72℃，90秒，30个循环；72℃最终延伸5分钟。使用以下引物扩增得到837bp的片段5’-GGITGGTAYAAYACIGTIGC-3’(参照肽7)和5’-GTYTCRTAICCIGCRAARTC-3’(参照肽9)。将该片段克隆入pBluescript SK+/HincII并测序(SEQ ID NO3)。所翻译序列含有纯化蛋白质的几种肽，并且因此837bp的片段用作杂交探针以筛选cDNA文库，该文库是使用来自如实施例2和3所描述的需氧生长的裸藻细胞mRNA构建的。筛选250,000个重组噬菌体得到6个独立的克隆。cDNA插入片段在1600bp和1900bp之间。对所有6个克隆从两端测序表明所有克隆代表同一转录本，而仅在长度上有所变化。最长的克隆经核酸外切酶III删除进行双链完全测序。此克隆长1912bp，并且包含可编码539个氨基酸的1620bp的可读框(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。在克隆两端具有含NotI和EcoRI限制性酶切位点的接头，并将该克隆插入载体pBluescript SK的EcoRI位点。图3显示了pBluescript SKP载体中TER克隆的图谱。
实施例5表达TER基因的酵母细胞中三酰甘油的积累通过EcoRI消化从克隆载体pBluescript SK+载体上切下TER基因并克隆入多拷贝质粒pYES2(Invitrogen)中强诱导GAL1启动子之后的EcoRI位点，从而产生质粒pYTER。用pYTER转化的野生型酵母株By4742(MATα his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0)在缺乏尿嘧啶并添加2％(vol/vol)甘油和2％(vol/vol)乙醇的合成培养基(Sherman，F.等人(1986)Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics，Cold SpringHarbor Lab.Press，Plainview，NY.)中于30℃振荡培养。生长24小时后通过加入终浓度为2％(wt/vol)的半乳糖诱导GAL1启动子。在生长24小时或48小时后收获细胞。用空载体(pYES2)转化并在相同条件下培养的野生型细胞By4742用作对照。
为了定量总脂类的含量，通过离心收获3份(每份5ml)酵母培养物，用蒸馏水洗涤得到的沉淀并冻干。测定干细胞的重量，在转变成甲基酯后通过常规气液相层析分析(GLC)定量脂肪酸含量(Dahlqvist等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6487-6492)。
脂类含量以nmol脂肪酸/mg干重计。测定了从35ml液体培养物收获的细胞中酵母的脂类组成。收获的酵母细胞在15ml玻璃管中用水重悬至终体积0.6ml，再加入3.75ml氯仿∶甲醇(1∶2)、50μl乙酸和2ml玻璃珠(0.45-0.50mm)。用剧烈搅动(5×1分钟)破碎酵母细胞，再按照标准方法(Bligh，E.G.和Dyer，W.J.，Can.J.Biochem.Physiol.37(1959)，911-917)将脂类抽提入氯仿。将收集的脂类级分分成两部分并且通过Silica Gel 60板(Merck)上的TCL在己烷/二乙醚/乙酸(70∶30∶1)中分离用于定量中性脂类(即未酯化脂肪酸(FA)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)和甾酯(SE))并且在氯仿/甲醇/醋酸/水(85∶15∶10∶3.5)中分离用于定量主要极性脂类(即磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、卵磷酯(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE))。通过短暂暴露于I2蒸气中定位脂类位，并通过适当标准鉴定。不同的脂类种类从板上切下并通过在含有2％(vol/vol)硫酸的无水甲醇中将切下材料于85℃加热60分钟制备脂肪酸甲酯。将甲酯抽提出来并通过如Dahlqvist等人(2000)所描述的常规气液色谱法(GLC)定量。
实施例6反-2-烯酰CoA还原酶(TER)在大肠杆菌中的功能性表达。
选择TER cDNA克隆的两个不同部分用于在大肠杆菌中进行异源性表达。第一个构建体(ter1)包含完整的可读框(SEQ ID NO1)。第二个构建体(ter2)包含从136位氨基酸开始的部分可读框。ter2长1215bp，计算分子量为45kDa，大小等同于与细小裸藻来源的纯化TER蛋白质的分子量(见图2)。使用下列引物从细小裸藻的cDNA中扩增构建体ter1和ter2TER1Ndefor 5’-TAT ACA TAT GTC GTG CCC CGC CTC GCC GTC TG-3’Nde I
TER1Bglfor 5’-TATAGA TCTTAT GTC GTG CCC CGC CTC GCC GTC TG-3’Bgl IITER2Ndefor 5’-TAT ACA TAT GTT CAC CAC CAC AGC GAA GGT CAT CC-3’Nde ITERXhorev 5’-TATCTC GAGCTA CTG CTG GGC AGC ACT GG-3’Xho Iter2由限制性位点Nde I和Xho I插入载体pET28a(Novagen，Darmstadt，德国)，并在大肠杆菌表达株BL21(DE3)(Novagen)中表达。
50-100ml含有抗生素的LB培养基培养单个大肠杆菌克隆。培养物于37℃振荡生长直至OD6000.6-1。培养物用终浓度0.4mM的IPTG于16℃培养过夜进行诱导。随后经4000g离心10分钟收获表达培养物。沉淀用裂解缓冲液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)重悬，再加入1mg/ml溶菌酶4℃培养30分钟。用超声处理进行细胞破碎，每个循环80W 10秒，共六个循环。加入RN酶A(10μg/ml)和DN酶I(5μg/ml)，再用探针4℃孵育10分钟。10000g离心30分钟后的上清液含有可溶性蛋白质级分。
4ml可溶性蛋白质级分补充1ml 50％的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden，德国)并于4℃振荡培养1小时。然后全部样品注入聚丙烯柱(Qiagen)，收集流出物。每次用4ml洗液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mMNaCl，20mM咪唑)进行洗脱步骤，多达3次。蛋白质的洗脱进行4次，每次用0.5ml洗脱液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑)。
转化有ter2-pET28的大肠杆菌的可溶性蛋白质级分经SDS-PAGE显示与对照细胞不同，主要条带位于预期的45kDa大小的位置(见图5)。ter2蛋白质借助添加的His标签经Ni-NTA琼脂糖纯化并且12％SDS-PAGE显示了ter2蛋白质的强富集(见图5)。使用标准方法(Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory PressISBN 0-87969-309-6)进行Western印迹分析和免疫检测。作为第一抗体使用了单克隆小鼠IgG His标签抗体(Novagen，Darmstadt，Germany)，所使用的第二抗体是HRP结合的山羊抗小鼠抗体(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)。使用ECLWestern印迹分析试剂盒(Amersham Biosciences)检测二级抗体。用随后的His标签的免疫检测对BL21(DE3)中构建体ter2-pET28进行Western印迹分析显示了ter2蛋白质过表达的特异性信号(见图6和7)。纯化ter2蛋白质的特异活性为1510nmol/mg/分钟。
ter1分别由限制性酶切位点Nde I和Xho I以及Bgl II和Xho I插入载体pET28a(Novagen)和pET32a(Novagen)中(见图7和8)。见图8Rosetta(DE3)中构建体ter1-pET32的western印迹显示了大肠杆菌BL21(DE3)没有表达ter1。因此，大肠杆菌表达宿主Origami株(DE3)和Rosetta株(DE3)(均来自Novagen)可用来检测ter1的表达。pET28a中ter1构建体的SDS-PAGE显示没有表达。然而，接下来的his标签免疫检测的Western印迹显示了大肠杆菌Rosetta(DE3)中构建体ter1-pET32的特异性信号(见图8)。信号显示了预期的78kDa大小的含有19kDa的硫氧还蛋白标签的ter1-pET32构建体。不能测定用于表达的ter1蛋白质的TER特异活性。
大肠杆菌中细小裸藻TER的表达研究结果可作为考虑cDNA克隆N末端部分可以构成线粒体的靶向信号，其必须切除以产生成熟有活性的TER蛋白质。尽管如此，不能排除cDNA克隆的N末端部分构成跨膜结构域的可能性。此潜在跨膜结构域在从细小裸藻生物纯化TER的过程中有可能丢失(见实施例1)。如果在大肠杆菌中表达，此结构域由于错误的旋转或缺少膜连接可能破坏用C4底物进行的活性检测(见实施例1)。
实施例7用于拟南芥中过表达的一系列TER构建体的构建既然TER基因的缩短形式ter2在大肠杆菌中有活性，可产生被缩短的和修饰的但有功能的TER形式。作为例子TER基因的两个缩短版本可以通过PCR产生，测序，并且也可以转入植物中具有SEQ ID NO4给出的ORF的一个导致产生SEQ ID NO5给出的蛋白质序列。此蛋白质的序列与SEQ ID NO2相比是缩短的，但与SEQ ID NO2的126位氨基酸残基及下面的序列是相同的。然而在该相同区域之前具有不同于SEQ IDNO2的28个氨基酸N末端延伸。此28个氨基酸预测产生线粒体靶向作用而无需推定的SEQ ID NO2中125个氨基酸长的线粒体靶向序列。
第二种序列(SEQ ID NO6)产生的SEQ ID NO7氨基酸序列对应于上述作为ter2的缩短形式，并且在大肠杆菌中显示有活性。由此序列产生的蛋白质预测不能导向至线粒体。
作为另一个变异的例子，ter1(SEQ ID NO1)和ter2(SEQ ID NO6)变异可克隆入双元载体ST593(见
图10)以至于在ORF加上一个新的N末端序列，从而分别产生序列8和序列10。相应的蛋白质序列(SEQ ID NO9和11)将成为分别融合ter1和ter2的Rubisco小亚基的质体靶向肽。
这些DNA序列可克隆入如实施例8中下面列举的双元载体。
实施例8用于植物转化的质粒使用双元载体如pBinAR用于植物转化(Hfgen和Willmitzer 1990，Plant Sci.66221-230)。可通过以正义和反义方向连接cDNA至T-DNA进行双元载体的构建。cDNA 5’初端的植物启动子激活cDNA的转录。多聚腺苷酸序列定位于cDNA 3’末端。通过使用组织特异性启动子获得组织特异性表达。例如，种子特异性表达可通过将油菜籽蛋白、LeB4或USP启动子克隆入cDNA 5’端中来获得。也可以使用任何其它种子特异性启动子元件。为在全部植物中组成型表达，可使用CaMV 35S启动子。所表达的蛋白质可用信号肽靶向至细胞区室，如质体、线粒体或内质网(Kermode1996，Crit.Rev.Plant Sci.15285-423)。信号肽被克隆入cDNA框架的5’-端以获得融合蛋白质的亚细胞定位。
植物双元载体的更多例子有克隆有TER候选基因pSUN300载体，见图4。这些双元载体包括在Nos启动子控制下驱动的抗生素抗性基因、位于候选基因前面的USP种子特异性启动子并具有OCS终止子。将TERcDNA以正义和反义方向克隆入USP种子特异性启动子后面的植物双元载体的多克隆位点。含有目的基因的重组载体应用标准条件转化入Dh5α(Invitrogen)。在含有100μg/ml链霉素的LB琼脂上37℃过夜生长筛选转化细胞。根据厂商提供的说明书使用QIAprep Spin小量制备试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术进行亚克隆分析和限制性酶切图谱分析(Sambrook等人1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual.2nd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold SpringHarbor，NY)。
实施例9拟南芥的转化本技术领域中的技术人员可以从不同方法中选择，下面将给出例子。
使用基本上如Cloug和Bent，1998描述的浸花法(floral dip)，分别用含有质粒pSUN300-USP-TER-OCS的根癌农杆菌C58C1转化植物。全植株(花序和莲座丛)在含有5％蔗糖、0.02％Silwet L-77(Osi Specialties，Danbury，CT)和重悬有经转化的根癌农杆菌细胞的浸润培养基浸没20-30秒。然后植物转入21℃光照16小时和18℃黑暗中8小时的光周期的生长室(70％湿度)或者类似空气条件的温室。从成熟植物中收集T1种子。然后转化植物通过在补充卡那霉素(50μg/ml)的MS琼脂板的选择培养基上T1种子的生长来鉴定。
实施例10在转基因植物中TER基因功能的体外分析酶活性和动力学参数的测定在本技术领域中已很好地建立。TER活性可根据Inui及其同事(Inui等人，1984)的方法进行测定。
实施例11过表达TER基因的转基因拟南芥植物中的脂类含量如Cahoon等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2212935-12940)和Browse等人(1986，Anal.Biochemistry 442141-145)所描述，从植物材料中提取植物脂类。脂类和脂肪酸的定性和定量分析在Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology.Ayr/ScotlandOily Press.-(Oily PressLipid Library；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.APractical Guide-Ayr，ScotlandOily Press，1989Repr.1992.-IX，307)中有描述。
与不表达SEQ ID NO1、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的空载体拟南芥对照植物相比，来自过表达SEQ ID NO1、SEQ ID NO4或SEQ IDNO6的拟南芥植物的干T2代种子中总脂类含量有所增加。作为例子，表4中给出了经常规气相色谱分析测定的T2种子的脂类含量，其以每mg过表达SEQ ID NO4的植物干种子中脂肪酸的mg来计算。
表4SEQ ID NO4过表达后的总种子脂类

图9显示了当与携带空pSun300-USP载体的对照植物相比，以相对种子脂类含量表示时，可观察到明显的增加。图9描述了表达在种子特异性启动子控制下的SEQ ID NO4的植物拟南芥T2(灰色柱)种子油类含量。白色柱代表T2对照。误差棒代表了两个独立的T2种子提取物的标准差。所有值以相应对照植物平均值的百分数来显示。独立的线表示与对照相比种子储存脂类至少增加10％。
实施例12以序列比较为基础的反-烯酰活性的氨基酸残基特点表3显示了具有最接近发现序列的TER蛋白质序列的比对。另一方面，与来自公开数据库的质体烯酰-ACP-还原酶序列相比较显示几乎没有总体同源性，但是暗示了某些可能保守的氨基酸残基。下面的表4列举了在植物质体烯酰-ACP-还原酶以及在裸藻属反-烯酰辅酶A还原酶中保守的TER(SEQ ID NO2)氨基酸残基以及表3中显示的序列同源物。表5显示的氨基酸残基显示与烯酰还原酶功能有关，而与ACP或辅酶A依赖无关。还显示了氨基酸残基的相对位置，但本技术领域中的技术人员可以预见这些关键残基的相对位置中有5-10个氨基酸的变异，在某些情况下有20-30个氨基酸的变异将出现在酶家族的一些成员中。
表5与烯酰还原酶功能相关的氨基酸残基

由斜线分开的氨基酸在此位置上可以互换。括号里列举的氨基酸可在大多数序列中发现。
序列表<110>巴斯植物科学有限公司(BASF PLANT SCIENCE GMBH)<120>细小裸藻的TER基因<130>AE 20030715<140>PF 54922<141>2003-10-10<160>11<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1620<212>DNA<213>细小裸藻(Euglena gracilis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1620)<223>
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权利要求
1.具有反-2-烯酰-CoA还原酶(TER)(EC 1.3.1.44)活性的分离多肽，其包含选自下列的多肽序列a)如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所描述序列，b)与如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所描述序列具有至少60％同一性的序列，和c)包含如SEQ ID NO2所描述序列中的至少10个连续氨基酸残基的序列。
2.分离的核酸分子，其包含选自以下的序列a)如SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所描述的序列，b)编码如权利要求1所述多肽的序列，和c)在严格条件下与编码如权利要求1所述多肽的序列杂交的序列。
3.增加植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中总油类含量的方法，其包括a)将多核苷酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8或SEQ ID NO10在所述植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中进行转基因表达，和b)选择与起始生物体相对照或相比较在所述植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料中的总油类含量增加的植物生物体。
4.如权利要求3所述的方法，其中TER蛋白质由选自下列的核酸序列编码a)包含与核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸序列；b)包含含有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列中至少30个核苷酸片段的核酸序列；c)编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有至少60％同一性的氨基酸序列，和d)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的多肽片段的核酸序列，其中片段包含氨基酸序列SEQ ID NO2中至少10个连续氨基酸残基。
5.权利要求3或4所述的方法，其中植物是油料作物。
6.权利要求5所述的方法，其中植物种子中总油类含量有所增加。
7.包含与调节序列结合的核酸序列的表达盒，其中所述核酸序列选自a)包含与核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸序列；b)包含含有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列中至少30个核苷酸片段的核酸序列；c)编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有至少60％同一性的氨基酸序列，和d)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的多肽片段的核酸序列，其中片段包含氨基酸序列SEQ ID NO2中至少10个连续氨基酸残基，其中所述调节序列能够调节所述核酸序列在植物中的表达。
8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述核酸序列编码包含SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所示氨基酸序列的多肽。
9.权利要求7或8所述的表达盒，其中启动子是种子特异性启动子。
10.遗传修饰的植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料，其包含如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所定义的多肽或如权利要求7-9中任意一项所述的表达盒。
11.如权利要求10所述的遗传修饰植物生物体，其中植物生物体选自油料作物Borvago officinalis、芸苔油菜(Brassica campestris)、欧洲油菜(Brassica napus)、芜箐(Brassica rapa)、大麻(Cannabis sativa)、红花(Carthamus tinctorius)、椰子(Cocos nucifera)、海甘蓝(Crambeabyssinica)、Cuphea species、油棕(Elaeis guinensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera)、大豆(Glycine max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草本棉(Gossypium herbaceum)、向日葵(Helianthus annuus)、亚麻(Linum usitatissimum)、月见草(Oenotherabiennis)、油橄榄(Olea europaea)、稻(Oryza sativa)、蓖麻(Ricinuscommunis)、胡麻(Sesamum indicum)、小麦属(Triticum)物种、玉蜀黍(Zeamays)、胡桃和扁桃。
12.如权利要求10或11所述的遗传修饰植物生物体或其组织、器官、部分、细胞或繁殖材料的用途，其用于生产三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸或上述物质的衍生物。
全文摘要
本发明涉及细小裸藻来源的核苷酸序列SEQ IDNO1的鉴定和用途，当所述序列表达时将增加转基因生物体所产生的油类(如三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油、磷脂、蜡酯和/或脂肪酸)总量。
文档编号A01H5/00GK1882684SQ200480033794
公开日2006年12月20日 申请日期2004年10月8日 优先权日2003年10月10日
发明者P·奇尔普斯, O·奥斯瓦德, J·莱尔希尔, W·F·马丁, M·霍夫麦斯特 申请人:巴斯福植物科学有限公司