蛋白酶活性和肝损伤的动物模型的制作方法

专利名称：蛋白酶活性和肝损伤的动物模型的制作方法
技术领域：
本发明是关于用作蛋白酶活性和肝损伤，包括脂肪变性的非转基因、非人动物模型。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是人类医学的急迫问题。已知HCV是大多数非A、非B肝炎的致病因子，估计全球有3％的人为血清阳性(A.Alberti等.，丙肝的自然史“Natural History of Hepatitis C”，J.Hepatology，31.，Suppl.1，pp.17-24，1999)，仅仅美国就有近4百万人感染(M.J.Alter等，美国的病毒性肝炎流行病学“TheEpidemiology of Viral Hepatitis in the United States”，Gastroenterol.Clin.North Am.，23437-455，1994)；M.J.Alter，美国的丙肝病毒感染“Hepatitis C Virus Infection inthe United States”，J.Hepatology，31.，Suppl.1，pp.88-91，1999)。
首次接触HCV后只有约20％的个体发展成临床急性肝炎，而其他人看来可自发克服此感染。然而在大约70％的病例中，此病毒可变为慢性感染持续几十年(S.Iwarson，慢性肝炎的自然过程“The Natural Course of Chronic Hepatitis”，FEMS Microbiology Reviews，14201-204，1994；D.Lavanchy，丙肝的全球监视和控制“Global Surveillance and Control of Hepatitis C”，J.Viral Hepatitis，635-47，1999)。这常常导致复发性和进行性恶化性肝脏炎症，进而引起更严重的疾病状态，如肝硬化和肝细胞性肝癌(M.C.Kew，丙肝和肝细胞肝癌“Hepatitis C andHepatocellular Carcinoma”，FEMS Microbiology Reciews，14211-220，1994；I.Saito等.，丙肝病毒感染与肝细胞肝癌的发生相关“Hepatitis C Virus Infection isAssociated with the Development of Hepatocellular Carcinoma”，Proc Natl Acad SciUSA，876547-6549，1990)。
HCV是RNA病毒，属于黄病毒科。该病毒归于血源性病原因子，主要通过与血液制品接触而传播。HCV能引起受感染者慢性肝炎、纤维化和肝细胞性肝癌。病毒基因组为正链RNA，长9.6Kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。结构蛋白核心、包膜1和包膜2蛋白是病毒装配和包装所必须。
从NS2至NS5的非结构蛋白执行病毒复制和多聚蛋白加工所必须的各种功能。
3010-3033氨基酸的多聚蛋白经蛋白水解切割产生各NS蛋白(R.Bartenschlager等，“丙肝病毒的非结构蛋白编码切割NS3/4和NS4/5连接处所需的丝氨酸型蛋白酶”，J.Virol.，673835-3834，1993；A..Grakoui等，“丙肝病毒编码的丝氨酸蛋白酶特性分析蛋白酶依赖性多聚蛋白切割位点的确定”，JVirol.，672832-2834，1993；A.Grakoui等，“丙肝病毒多聚蛋白切割产物的表达和鉴定”，J.Virol.，671385-1395，1993；L.Tomei等，“NS3是丙肝病毒多聚蛋白加工所需的丝氨酸蛋白酶”，J.Virol.，674017-4026，1993)。
HCV NS蛋白3(NS3)具有丝氨酸蛋白酶活性，可帮助加工大多数病毒酶，因此被认为是病毒复制和传染性所必需。NS3的前181个氨基酸(病毒多聚蛋白的1027-1207残基)已被证明含有NS3的可加工HCV多聚蛋白的所有4个下游位点的丝氨基酸蛋白酶结构域(C.Lin等，“丙肝病毒NS3丝氨酸蛋白酶反式剪切要素和加工动力学”J.Virol.688147-8157，1994)。
HCV NS3丝氨酸蛋白酶及其相关辅因子NS4A可协助加工所有的病毒酶，因此被认为是病毒复制所必需。
目前尚无令人满意的抗HCV药物和治疗方法。HCV疾病现有的治疗方法只有peg化(pegylated)的干扰素和病毒唑治疗。然而，干扰素具有明显的副作用(M.A.Wlaker等，“丙肝病毒目前治疗方法的回顾和进展”DDT，4518-29，1999；D.Moradpour等，“丙肝的治疗现状和进展”Eur.J.Gastroenterol Hepatol.111199-1202，1999；H.L.A.Janssen等，“与慢性病毒肝炎的干扰素α治疗相关的自杀”J Hepatol.21241-243，1994；P.F.Ranault等，“干扰素α的副作用”Seminars inLiver Disease，9pp.273-277，1989)并且只能在部分病例(约25％)中产生长期缓解作用(O.Weiland，“慢性丙肝病毒的干扰素治疗”，FEMS Microbiol Rev.14279-288，1994)。此外有效的抗HCV疫苗前景仍不明确。
开发HCV蛋白酶抑制剂的进展受阻于缺乏稳定和可重复的动物模型。许多动物不易感染HCV。
黑猩猩是已知最好的HCV动物模型(Bassett等，J.Virol.Feb，73(2)1118-26，1999；Bassett等，Hepatology.29(6)1884-92，1999；Brasky等，1998；Bassett等，J Virol.72(4)2589-99，1998；Bukh，Hepatology.39(6)1469-75，2004；Bukh，Apgar等，J Infec Dis.178(4)1193-7，1998；Kolykhalov，Mihalik等，JVirol.Feb，74(4)2046-51，2000；Bukh，Forns等，Intervirology，44(2-3)132-42，2001)。然而，以黑猩猩测试药物存在着相关的伦理、成本及实用性问题。此外，黑猩猩的HCV感染过程较轻微(Walker，Springer Semin Immunopathol.19(1)85-98，1997)，疾病的表现与人HCV感染不同。感染HCV的人70％成为慢性感染，而30％清除了病毒。相反，感染的黑猩猩65-80％清除了病毒而25-30％导致急性肝炎。此外，黑猩猩的HCV感染过程比人温和，黑猩猩不会因HCV感染发展成肝硬化。用HCV感染黑猩猩的费用每只约为6万美元。
用HCV感染其它非人灵长动物模型如低等灵长动物(Bukh，Apgar等，J VirolHepat.8(3)228-31，2001；Korzaya，Lapin等，Bull Exp Biol Med.133(2)178-81，2002)或狒狒(Sithebe等，J Med Virol.66(4)468-71，2002)的尝试遇到了复杂的问题。替代动物模型如GB感染的小绢猴(Garson，Whitby等，J Med Virol.52(3)286-8，1997；Bukh，Apgar等，Virology.30262(2)470-8，1998；Beames，Chavez等，J Virol.74(24)11764-72，2000；Beames，Chavez等，ILAR J.42(2)152-60，2001；Sbardellati，Scarselli等，2001；Lanford，Chavez等，Virology.311(1)72-80，2003；Martin，Bodola等，Proc Natl Acid Sci USA.100(17)9962-7，2003)也获得了各种不同的结果。
已报导含有HCV某些部分(基因)的转基因小鼠被用于研究HCV诱导的肝病理变化和肝细胞性肝癌(HCC)(Koike，Moriya，Yotsuyanagi等，J Gen Virol.78(Pt7)1527-31，1997；Pasquinelli，Shoenberger等，Hepatology.25(3)719-27，1997；A.Honda等，J Med Virol. 59281-189，1999；Koike.Nippon Rinsho.59(7)1265-70，2001；He，Cheng等，Woeld J Gastroenterol.9(#)474-8，2003)。这些转基因模型有几个缺点，包括不能充分模拟病毒的生命周期(V.Brass等，HepatologyElsewhere.H.Jaeschke等，Hepatology.35722-724，2002)。也有文献报导了嵌合人肝脏的小鼠。已报导移植了HCV感染的人PBMCs的SCID小鼠在接种HCV后病毒持续感染了8周，但8个小鼠中只有2只显示存在有能表明病毒复制的复制型(负链)HCV(Bronowicki，Loriot等，Hepatology.28(1)211-8，1998)。给裸鼠移植负载HCV的肿瘤导致少量的HCV复制(Labonte，Morin等，J Med Virol.66(3)312-9，2002)。在肾包膜中移植负载HCV肿瘤的三嵌合体小鼠模型(Galun，Burakova等，J Infecy Dis.172(！)25-30，1995；Ilan，Arazi等，J Infct Dis.185(2)153-61，2002；Daban和Erwn，Curr Opin Mol Ther.5(2)148-55，2003)和HCV感染的人肝细胞群在SCID-uPA小鼠中再增殖获得成功也已得到证实(D.F.Mercer等，Nature Medicine.7927-933，2001)。然而，此模型技术上要求高，也有许多与该模型有关的可变性，因其取决于不同的肝细胞重建。
小动物(如小鼠)模型可保留化合物，使科学家能研究化合物的药物动力学(PK)作用，这取决于抗病毒化合物的吸收、分布、代谢和毒性。
研究某化合物的药效学(PD)作用，主要是该化合物的体内效应。由于目前可得到的小鼠HCV模型，如含有重建人肝脏的小鼠可变性太大而不稳定，它们不适合用于抗病毒药物的筛选。
此外，肝脏损伤是否由HCV感染直接造成尚不明确(N.Fausto，NatureMedicine，7，pp.890-891，2001)。用于HCV相关的肝损伤模型可了解感染过程并筛选保护肝脏免受损伤的试剂。
脂肪变性是脂肪在肝脏中或机体其它器官中的积聚。已在HCV感染病人中观察到脂肪变性。然而，其它疾病也有脂肪变性症状。见A.Lonardo等，“脂肪变性和丙肝病毒肝脏和肝外疾病的机制和意义”，Gastroenterology.126586-597，2004；M.Romero-Gomez等，“慢性丙肝中血清Leptin水平与肝脂肪变性的关系”，981135-1142，2003；V.Ratziu等，“慢性丙肝中的脂肪、糖尿病和肝损伤”，622-29，2004；F.Ramalho，“丙肝病毒感染和肝脏脂肪变性”，60125-127，2003。这些疾病，如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)相当广泛。这些疾病的治疗研究受阻于缺乏合适的脂肪变性模型。
因此，需要一种适合抗病毒药物筛选和用作肝脏损伤模型的更稳定、技术上要求不高的(及因此可重复的)、成本低的小动物模型。
发明概述本发明涉及一种可用于蛋白酶活性检测的动物模型。具体说，本发明提供了一种在肝脏中具有蛋白酶-SEAP报导子构建物的动物。
本发明还涉及肝脏损伤的动物模型。此模型包括具有一种表达构建物的动物，该构建物插入到动物肝脏中，其编码的蛋白质能引起肝脏损伤。
本发明也涉及脂肪变性及其相关疾病的动物模型。该模型包括具有一种表达构建物的动物，该构建物编码待表达的能引起肝脂肪变性的蛋白质。
本发明还涉及从这些动物得到的细胞，和含有上述基因系统/表达构建物的细胞、载体和细胞系。
本发明提供的动物模型对于小动物是强健、可重复和适合的。这些模型具体可用于，如药物开发、为体内的蛋白酶活性和肝损伤建立模型。
本发明还提供制备该动物模型和利用此模型的方法。
附图简要说明


图1.是表达融合有分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报导子的野生型(WT)和突变型(MT)HCV蛋白酶的报告基因的示意图。
图2.(MT HCV NS3·4A SEAP蛋白)描述以丙肝病毒4AB连接区(下划线)连接的SEAP蛋白和突变型HCV蛋白酶融合蛋白的氨基酸序列。用箭头标出了HCV蛋白酶的非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白4A(NS4A)组分的氨基端和羧基端边界。该蛋白酶NS3蛋白(框出)活性位点中的丝氨酸139突变成丙氨酸(Ser--＞Ala)使此蛋白酶失活。
图3.(WT HCV NS3·4A SEAP蛋白)描述以丙肝病毒4AB连接区(下划线)连接的SEAP蛋白和野生型HCV蛋白酶融合蛋白的氨基酸序列。用箭头标出了HCV蛋白酶的非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白4A(NS4A)组分的氨基端和羧基端边界。
图4.(WT HCV NS3·4A SEAP DNA)描述以HCV蛋白4AB连接区连接的SEAP开放阅读框和突变型HCV蛋白酶cDNA融合基因的核苷酸序列。该活性位点中以下划线标识的突变使此蛋白酶失活但没有改变开放阅读框。
图5.(WT HCV NS3·4A SEAP DNA)描述以HCV蛋白4AB连接区连接的SEAP开放阅读框和野生型HCV蛋白酶cDNA融合基因的核苷酸序列。
图6.描述转染了HCV WT/MT NS3·4A SEAP质粒的小鼠肝细胞上清液的SEAP水平，以RLU单位表示。
图7.描述了HCV蛋白酶抑制剂对SEAP分泌的作用。
图8.是融合有SEAP报告基因的编码HCV WT/MT蛋白酶的腺病毒构建物的示意图。
图9.说明Ad/HCV WT或Ad/HCV MT NS3·4A-SEAP感染的小鼠肝细胞培养液中的SEAP释放。
图10.描述小鼠肝细胞培养液中HCV蛋白酶抑制剂对SEAP的Ad/HCVNS3·4A依赖性表达的作用。
图11.描述用Ad/WT和Ad/MT HCV NS3·4A-SEAP感染的SCID小鼠血清中的SEAP分泌。
图12.描述用HCV蛋白酶抑制剂处理时对经Ad/WT和Ad/MT HCVNS3·4A-SEAP感染的SCID小鼠血清中SEAP分泌的影响。
图13.说明a)Ad-WT-HCV NS3·4A-SEAP，b)Ad-WT HCV NS3·4A-SEAP和用HCV抑制剂处理时以及c)Ad-WT-HCV NS3·4A-SEAP之间的形态学差异。
图14.说明在本发明动物模型中用VX-950的N-丙基侧链的D-和L-异构体的混合组合物进行的剂量反应研究。
图15.是本发明所用构建物和所得数据的小结。
图16.是在本发明模型中示范性蛋白酶抑制剂活性的小结。
图17.描述本发明模型的治疗和未治疗的肝脏样本。
图18.显示VX-950(所用的D-和L-异构体的混合物)的结构和其相关的试验数据。
图19.VX-950(D-和L-异构体的混合物)在Vertex HCV蛋白酶小鼠模型中的活性。
A)腺病毒在感染小鼠中的分布。在静脉注射199.5IFU/小鼠的Ad.HCV.pro.WT.SEAP24小时后，在小鼠的各种器官中检测HCV NS3蛋白。H-心脏，Spl-脾脏，Ki-肾脏，Lu-肺，Li-肝。取20微升各脏器的均质裂解液作4-12％Bis-Tris蛋白凝胶电泳，然后用抗NS3单克隆抗体作免疫检测。130Kd标准蛋白用于指示未被切割的融合蛋白，70Kd标准蛋白用于指示切割的NS3蛋白。底部条带显示在同一免疫印迹条带中用抗小鼠GAPDH单克隆抗体检测到的36Kd的甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白。GAPDH的水平表明每条泳道所加蛋白量大致相等。
B)显示VX-950的体内活性给SCID小鼠注射(经尾静脉)109.5IFU/小鼠的Ad.WT.HCVpro或Ad.MT.HCV.pro，然后每天二次口服300mg/kg的VX-950或不口服VX-950。收集注射后24小时的血清，作SEAP的化学发光试验。与未治疗对照相比，VX-950引起血清SEAP分泌减少了27倍。没有观察到对突变型HCV蛋白酶活性的影响。
C)在HCV蛋白酶动物模型中的VX-950滴度口服给予SCID小鼠(每组n＝6只)各种剂量的VX-950(如图所示)，2小时后尾静脉注射109.5IFU/小鼠的Ad.WT.HCV pro。静脉注射后24小时收集感染小鼠的血清作SEAP化学发光试验。VX-950治疗小鼠血清的SEAP水平以单用运载体治疗组的百分比％表示。计算出的有效剂量(ED50)为与单用运载体治疗组相比，能抑制50％血清SEAP释放的VX-950剂量。
图20和21.VX-950保护小鼠免受肝脏损伤给6周龄SCID小鼠注射(经尾静脉)Ad.WT.HCV pro(1011IFU/小鼠，A，B和C标记为WT)或Ad.MT.HCVpro(1011IFU/小鼠，标记为MT)。注射WT病毒的小鼠(n＝8)每天二次口服300mg/kg VX-950或只在最初三天口服运载体。7天后处死动物收集肝脏作病理学检查。图中显示了没有用任何药物(无药物)治疗感染WT蛋白酶，或用VX-950治疗感染WT蛋白酶和感染MT蛋白酶的小鼠肝脏的大略外观。在各肝脏下面也显示了具有病理学变化的肝脏的苏木精伊红染色肝脏切片(400x)。
图22.是HCV蛋白酶动物模型的示意图。给6周龄SCID小鼠注射(经尾静脉)复制缺陷性腺病毒，此病毒能表达融合有分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的野生型HCV蛋白酶，或能表达融合有SEAP的突变型HCV蛋白酶(作为对照)。HCV NS3·4A蛋白酶依赖性SEAP将分泌到感染的SCID小鼠血流中—可用发光试验测定。
图23.描述脂肪变性与HCV蛋白酶表达的关系。给SCID小鼠注射递增浓度的表达野生型HCV蛋白酶的腺病毒(半对数递增的107-11IFU/小鼠)。用油红O染色感染后72小时的肝脏冰冻切片。用苏木精反染色细胞核。观察到肝中脂肪的积聚与SEAP分泌表达的增加(因此与HCV蛋白酶活性)相关(图中显示的是20倍放大)。
图24.描述脂肪变性与HCV蛋白酶表达的关系。图24与图23相同，但放大40倍。可观察到肝细胞内脂肪的积聚。
图25.描述与HCV蛋白酶表达相关的脂肪变性可用HCV蛋白酶抑制剂VX-950缓解。给SCID小鼠注射1011IFU/小鼠的表达野生型HCV蛋白酶、突变型HCV蛋白酶或SEAP的复制缺陷性腺病毒(n＝6)。最初3天，一组注射表达野生型HCV蛋白酶的腺病毒的小鼠(n＝6)经300mg/kg BID(每天二次)口服治疗。第7天处死所有小鼠，其肝切片作油红O染色。与突变型HCV蛋白酶或SEAP小鼠组相比，表达野生型HCV蛋白酶小鼠的肝脏中有明显脂肪积聚(20倍放大)。
发明详述本发明的一实施方式提供一种动物，其肝脏是用含有可操作性连接于表达蛋白酶的DNA的启动子的构建物来表达外源性蛋白质的靶标，所述蛋白酶连接于可被该蛋白酶切割的序列，而该序列连接于一报告子。该报告子经该蛋白酶切割后，可存在于动物的任何部位，如动物的血液、血清、或组织中。在一实施方式中，可在血清中测到此报告子。
本发明可采用任何可检测的报告蛋白。报告蛋白通常可用如化学发光或荧光检测。典型的报告蛋白包括分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)和辣根过氧化物酶。本发明中还可使用的报告蛋白是一种独特的蛋白，即不存在于动物天然状态下的蛋白，但可用合适抗体或抗体模拟物检测。
本文所用的“动物”指人以外的任何哺乳动物。包括任何年龄的动物，包括胚胎、胎儿、新生儿和成年动物。本发明所用的动物可得自商业来源。这些动物包括但不限于实验动物或其它动物，家兔、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仑鼠、沙鼠和豚鼠)、牛、绵羊、猪、山羊、马、狗、猫、鸟类(如鸡、火鸡、鸭、鹅)、灵长类(如黑猩猩、猴子、小绢猴、恒河猴)。优选的动物包括大鼠、小鼠(SCID等)、狗、猴子。更优选的动物包括小动物，如小鼠或大鼠。最优选的，该哺乳动物是小鼠。
本发明的另一实施方式提供一种非人哺乳动物，其肝脏是用包括可操作性连接的启动子和编码某蛋白(其表达可引起肝脏损伤)的DNA的系统来表达外源性蛋白质的靶标。更具体说，该动物是非转基因、非人动物。这种肝脏损伤可通过，例如检查肝脏形态学、组织学和/或酶水平来评估。
如本文所证明的那样，本发明动物模型的肝脏具有脂肪变性特征。也可利用提供的此模型来阐明HCV感染所引起的脂肪肝。
因此，本发明的另一实施方式提供一种非人哺乳动物，其肝脏是用包括可操作性连接的启动子和编码某蛋白(其表达可引起脂肪变性)的DNA的系统来表达外源性蛋白质的靶标。这种肝脏损伤可通过，例如检查肝脏形态学、组织学和/或酶水平来评估。
本发明动物模型中产生的肝损伤包括脂肪变性(steatosis)。因此，本发明还提供疾病和病症如NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝或雷氏(Reyer’s)综合征的模型。这些动物模型可用于试验来鉴定调节脂肪变性，和涉及脂肪变性的疾病、病情或病症，包括但不限于NAFLD、NASH、酒精性脂肪变性和雷氏综合征的化合物。
本发明可利用任何蛋白，包括但不限于酶、结构蛋白、哺乳动物蛋白、病毒蛋白、细菌蛋白和真菌蛋白。优选的蛋白质包括酶，如蛋白酶、激酶和脂酶。本发明实施方式可采用所有的天然、野生型和突变型DNA和蛋白质。
涉及蛋白酶的本发明实施方式可采用任何蛋白酶，包括哺乳动物、病毒、真菌和细菌蛋白酶。
如技术人员所知，蛋白酶可分类为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。所有这些蛋白酶可应用于本发明的实施方式。蛋白酶的例子包括但不限于组织蛋白酶(如组织蛋白酶-B、组织蛋白酶-D、或组织蛋白酶-G)、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、C-1脂酶、C-3转化酶、尿激酶、纤溶酶原激活剂、顶体蛋白、β-内酰胺酶、D-丙氨酸-D-丙氨酸羧基肽酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、激肽释放酶、凝乳酶、胃蛋白酶、血管紧张肽、转化酶、脑啡肽酶、假单胞杆菌弹性蛋白酶、亮氨酸氨基肽酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰肽酶E、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9和-10)。
优选用于本发明的蛋白酶包括病毒如逆转录病毒(如HIV、HTLV和慢病毒)、小RNA病毒(如脊灰病毒)、黄病毒(如HCV和其它瘟病毒属病毒如BVDV)、植物病毒(如毛状病毒组)、披膜病毒属(如仙台病毒)、细小病毒属和腺病毒属的蛋白酶。具体说，这些病毒蛋白酶包括但不限于肝炎病毒(如甲肝、乙肝、丙肝、戊肝、辛肝或庚肝病毒)的蛋白酶、HIV蛋白酶、细小病毒蛋白酶或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状病毒、卡波齐肉瘤病毒)蛋白酶。
本发明一实施方式中，蛋白酶是丙肝病毒蛋白酶。优选的丙肝病毒蛋白酶是HCV NS3·4A蛋白酶。
可利用病毒载体，直接注射入肝脏、静脉注射或非病毒的基因转移，将本发明的基因系统(即编码例如HCV-SEAP融合蛋白的表达构建物)输送给肝脏。也可利用与非感染性腺病毒颗粒、金颗粒、脂质的偶联或任何非病毒性基因转移来进行此种输送。
在本文所公开的一优选实施方式中，利用腺病毒作为运载体来输送到肝脏。在SCID小鼠中，显示感染了表达SEAP融合HCV蛋白酶的腺病毒的SCID小鼠血清中有HCV蛋白酶依赖性SEAP分泌。在一优选实施方式中，可用本文所述腺病毒载体将该表达构建物输送给肝脏。
本发明的实施包括复制基因系统(即表达构建物)并从而产生蛋白。本发明包括任何可导致所需复制的技术。通常这种复制是由启动子实现的。用于实施本发明的启动子包括CMV、RSV、SV40或白蛋白启动子。本发明也包括其它技术，如IRES元件。
在本发明中，腺病毒包含融合了SEAP报告子的HCV编码蛋白酶的表达构建物，该表达构建物处在能驱使HCV蛋白酶-SEAP融合蛋白表达的合适启动子控制下。该启动子通常是异源性启动子，其插入方式是可操作性连接从而可表达此融合蛋白。
术语“表达构建物”或“表达载体”指包含有编码基因产物(如HCV和SEAP的融合蛋白)的核酸的任何类型的基因构建物，所述核酸的部分或全部编码序列可被转录。转录物优选被翻译成蛋白质。某些实施方式中，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物。
所述编码基因产物的核酸处在一启动子的转录控制下。“启动子”指启动某基因特异性转录所需的、被细胞合成机器或导入的合成机器所识别的一种DNA序列。短语“在转录控制下”指该启动子相对于该核酸处在正确的位置和朝向，能控制RNA聚合酶的启动和该基因的表达。
术语启动子本文用于指一组转录控制组件，成簇状围绕在RNA聚合酶II的起始位点。启动子由分离的功能性组件组成，每个组件约由7-20bp的DNA组成，含有一个或多个转录激活剂或阻抑蛋白的识别位点。
用于控制感兴趣的核酸序列表达的具体启动子据信并不重要，只要它能控制该核酸在靶细胞中的表达。因此在优选实施方式中，优选核酸编码区置于启动子附近并处于启动子的控制下，所述启动子可在肝细胞中得到表达。一般说，这种启动子可包括人或病毒启动子。
在不同的实施方式中，人巨细胞病毒(CMV)直接早期基因启动子、SV40早期启动子、罗斯肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子、磷酸甘油激酶启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，所有这些启动子都是本领域技术人员熟知和不难获得的，可用于获得目的编码序列的高水平表达。也可考虑采用本领域熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或噬菌体启动子来实现目的编码基因的表达，只要其表达水平足以实现给定目的。通过采用性能熟知的启动子，可优化转染或转化后目的蛋白质的表达水平和模式。本发明可采用诱导性启动子，如设计用于调节目的基因在哺乳动物细胞中表达的诱导性蜕皮激素系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
本发明的一实施方式中采用启动子，优选是CMV。在哺乳动物细胞中，CMV直接早期启动子常用于提供强转录活性。在需要降低转基因表达水平时也可用强度略差的修饰的CMV启动子。当需要在造血细胞中表达转基因时，常用逆转录病毒启动子，如MLV或MMTV的LTR。可用的其它病毒启动子取决于所需的效果，包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2 LTR、腺病毒启动子如E1A、E2A或MLP区、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒的启动子。
可利用类似的组织特异性启动子在特定组织或细胞中实现转录，以降低对非靶组织的强毒性或不良影响。肝特异性启动子包括，例如IGFBP-1启动子，已知Cx32基因(Piechocki等，Carcinogenesis.第20卷，3401-406，1999，3月)具有肝特异性启动子，许多其它肝特异性基因是本领域技术人员已知的，可采用这些基因的启动子元件来实现组织特异性表达产生本文所述的动物模型。
可用于本发明的其它调节元件是增强子。这些基因元件可提高位于同一DNA分子远处的启动子的转录。增强子的组成与启动子非常相似。即它们由许多单个元件组成，各元件与一个或多个转录蛋白结合。增强子和启动子之间的基本差别是操作性的。增强子区作为整体必须能刺激远处的转录，而启动子区或其组成元件不需要如此。另一方面，启动子必须含有能在特定位点以特定取向控制RNA合成启动的一个或多个元件，而增强子缺乏这种特异性。启动子和增强子常常重叠和毗连，常具有类似的组件结构。本发明所用的增强子是本领域技术人员熟知的，取决于所用的具体表达系统(Scharf D等，Results Probl Cell Differ.20125-62，1994；Bittner等，Methods in Enzymol.153516-544，1987)。
当采用cDNA插入物时，通常需要包含聚腺苷酸信号以实现基因转录的正确聚腺苷酸化。聚腺苷酸信号的性质对本发明的成功实施据信不是关键性的，可采用任何这类序列，如人或牛生长激素和SV40聚腺苷信号。该表达盒的另一元件是终止子。这些元件的作用是提高信使水平和最大程度减少从该盒通读到其它序列的可能。
本发明的某些实施方式中，采用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因，或多顺反子信使。IRES元件能绕过5’甲基加帽依赖性翻译的核糖体扫描模式，而在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，Nature.334320-325，1998)。已有小RNA病毒科两成员(脊灰病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，同上)以及哺乳动物信使的IRES的相关描述(Macejak和Sarnow，Nature.35390-94，1991)。可将IRES元件连接于异源开放阅读框。可一起转录多个开放读框，每个均由IRES分隔，产生多顺反子信使。借此IRES元件，各开放阅读框可接近核糖体进行有效翻译。采用单一启动子/增强子来转录一个信使可有效表达多个基因。
可将任何异源性开放阅读框与IRES元件相连。这包括分泌蛋白、多亚单位蛋白、独立基因所编码的蛋白、胞内或膜结合蛋白及可选择标记的基因。以此种方式，可用一个构建物和一个可选择标记同时将几种蛋白质基因导入到一个细胞中进行表达。
可有许多方法将表达构建物导入细胞中。本发明的某些实施方式中，表达构建物包括病毒和工程改造的病毒基因组衍生构建物。其它实施方式中采用非病毒递送方式。某些病毒能通过受体介导的胞吞作用进入细胞而整合入宿主基因组中，稳定而有效地表达病毒基因，这使它们成为将外源基因导入哺乳动物细胞中的有吸引力的候选者(Ridgeway，RodriguezR L.Denhardt DT编.“载体分子克隆载体及其应用纵览”(VectorA survey of molecular cloning vectors and theiruses.)，StonehamButterworth，467 492，1988；Nicolas和Rubenstein，“载体分子克隆载体及其应用纵览”(VectorsA survey of molecular cloning vectors andtheir uses)，Rodriguez和Denhardt(编)，StonehamButterworth，493 513，1988；Baichwal和Sugden，“基因转移”(Gene Transfer)，Kucherlapati R编，New York，Plenum Press，117 148，1986；Temin.“基因转移”(Gene Transfer)，KucherlapatiR编，New York，Plenum Press，117 148，1986)。首先用作基因载体的病毒是DNA病毒，包括乳多泡病毒(papovavirus)(猿猴病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988同上；Baichwal和Sugden，1986，同上)和腺病毒(Ridgeway，1988同上；Baichwal和Sugden，1986，同上)。这些病毒具有较低的外源性DNA序列容量和有限的宿主谱。此外，它们在允许的细胞中的致癌潜能和细胞病变作用产生了安全问题。它们只能容纳最多至8kb的外源基因物质，但可方便地导入各种类型的细胞系和实验动物中。
现已广泛认识到可利用各种病毒载体将DNA导入细胞中。这种实施方式中，含有目的基因的病毒载体的表达构建物可以是腺病毒(见美国专利No.5,924,554；5,707,618；5,693,509；5,670,488；5,585,362；各纳入本文作参考)、逆转录病毒(见例如美国专利No.5,888,502；5,830,725；5,770,414；5,686,278；4,861,719；各纳入本文作参考)、腺相关病毒(见例如美国专利No.5,474,935；5,139,941；5,622,856；5,658,776；5,773,289；5,789,390；5,834,441；5,863,541；5,851,521；5,252,479；各纳入本文作参考)、腺病毒-腺相关病毒的杂交病毒(见例如美国专利No，5,856,152，纳入本文作参考)、牛痘病毒或疱疹病毒(见例如美国专利No.5,879,934；5,849,571；5,830,727；5,661,033；5,328,688；各纳入本文作参考)的载体。
本发明另一实施方式中，该表达构建物可单由重组裸DNA或质粒组成。该构建物的转移可用上述任何物理性或化学性渗透细胞膜的方法进行。这些方法具体可用于体外转移，然而也可用于体内(Dubensky等.Proc Natl Acid Sci USA.817529-7533，1984；Benvenisty和Neshif.Proc Natl Acid Sci USA.839551-9555，1986)。
本发明转移裸DNA表达构建物进入细胞的另一实施方式可涉及颗粒轰击。此法依赖于能否将包被了DNA的微粒加速到高速度使它们穿透细胞膜进入但不杀伤细胞(Klein等，nature.32770-73，1987)。已开发了几种能加速小颗粒的装置。一种装置依靠高压放电来产生电流进而提供动力(Yang等，Proc Natl Acid SciUSA.879568-9572，1990)。所用微粒由生物学惰性的物质组成，如钨或金珠。
本发明也提供获自含有本发明基因系统的哺乳动物的细胞。例如，可如本文所述产生本发明的动物模型。随后，采用本领域技术人员已知的技术从此动物分离得到原代肝细胞(见“动物细胞的培养”(Culture of Animal Cells)第4版，Freshney，2000，Publ.Wiley-Liss.Inc.)。然后此原代细胞可传代培养产生细胞系(见“动物细胞的培养”的第11和12章Culture of Animal Cells，Freshney，2000，)。
本发明还提供含有本发明基因系统的肝细胞或肝细胞系。更具体说，本发明涉及的肝细胞或细胞系是已用本文所述表达构建物转化的或转染的。在具体优选实施方式中，该表达构建物编码融合有报告子，如SEAP报告子的HCV蛋白酶。转化细胞的方法和组合物是本领域技术人员所 知的，可包括常规用于以外源性核酸序列修饰细胞系的任何技术。
本发明还提供含有本发明基因系统的病毒载体，用于表达含有融合有例如SEAP的HCV蛋白酶的表达构建物。更具体说，本发明涉及的腺病毒载体含有编码这种融合蛋白的表达构建物。
本发明也提供产生用于显示蛋白酶活性的哺乳动物模型的方法，该方法包括提供哺乳动物，和向该哺乳动物递送含有A)启动子、B)编码蛋白酶的DNA和C)编码报告子的DNA的基因系统(即表达构建物)，此系统中A、B和C可操作性连接，当存在报告子活性时表明有蛋白酶活性。
本发明也提供产生用于显示肝损伤的哺乳动物模型的方法，该方法包括提供哺乳动物，和向该哺乳动物递送含有启动子和编码蛋白质的DNA的表达构建物，所述蛋白质的表达引起肝细胞损伤。
本发明的这些过程的实施方式包括本文所述的任何动物、基因系统、表达构建物和/或方法。这些过程可进一步包括饲养该哺乳动物足够时间，例如，足以在该动物肝脏中产生损伤。
已报导了在COS-7细胞中采用融合了分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的HCV蛋白酶(Y-G Cho等，J Virol Methods.72，109-115页，1998)或在COS-7和HCV复制子细胞中采用融合了SEAP蛋白的绿色荧光蛋白(GFP)(J.-C.Lee等，Analyt.Biochem.，316162-170，2003)进行的体外细胞试验。然而这些方法不能应用于体内。
本文所提供的动物可用作体内蛋白酶活性模型。通过给予HCV蛋白酶抑制剂抑制SEAP分泌到小鼠血清中(见，例如图7)显示了HCV蛋白酶动物模型的用途。可通过检测或测定报告子的表达来测试或监测蛋白酶活性的调节。
因此，本发明的一实施方式提供一种测定可促进或抑制蛋白酶活性的药物的方法，该方法包括a)提供本文任一实施方式所述的哺乳动物；b)给予该哺乳动物药物；c)评价该药物对报告子表达的作用。
根据在该动物模型中表达的蛋白酶，可筛选各种药物和化合物增强或抑制该蛋白酶活性的效果。此方法对测试作为抗HCV治疗的药物效果特别有用。
用表达融合有SEAP的HCV蛋白酶的腺病毒感染的小鼠也证明了HCV蛋白酶依赖性肝脏病理变化。通过说明HCV蛋白酶抑制剂可保护小鼠免于腺病毒感染中与表达SEAP的野生型HCV蛋白酶有关的肝脏损伤，证明了该模型的HCV蛋白酶肝损伤组分的用途。
肝损伤常见于HCV病人。迄今这主要被归因于宿主介导的抗病毒免疫应答反应。然而，HCV感染的侵袭过程可见于HIV共感染的病人和免疫损伤的病人。本发明的模型本身可用于研究缺乏免疫系统时HCV的病理发生。了解该疾病的发生机制可能产生干扰此病进程的新方法，及设计与开发治疗HCV介导的肝脏损伤的合理方法。在表达WT HCV蛋白酶的小鼠肝脏中观察到的脂肪变性提示，HCV蛋白酶在丙肝的病理发生中起一定作用。
因此，本发明的一实施方式也提供评估能促进或抑制肝脏损伤的药物的方法，该方法包括a)提供本文任一实施方式所述的哺乳动物；b)给予该哺乳动物此药物；和c)评价该药物对肝损伤的作用。
此肝损伤试验中可测试和/或筛选任何类型的药物或化合物。例如，可测试能引起肝损伤或能治疗和/或预防肝损伤的任何药物。这些药物包括但不限于蛋白酶抑制剂、半胱氨酸酶抑制剂(如ICE抑制剂、半胱氨酸酶-3抑制剂、半胱氨酸酶-7抑制剂等)、激酶抑制剂(如丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶抑制剂)、IMPDH抑制剂、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂、脂肪酶抑制剂、细胞因子抑制剂(如TNF-α，TGF-β抑制剂)、凋亡介质和/或抑制剂(如PARP)、抗体(或其片段)、Fab片段、抗体样肽或蛋白(或其片段)。此法尤其可用于测试治疗或预防肝损伤，包括肝脂肪变性的药物效果。
因此，本发明通过给予用本发明方法鉴定的化合物，提供抑制肝脏损伤、脂肪变性、NAFLD、NASH、酒精性脂肪变性、或雷氏综合征的方法。
具有抗肝损伤治疗效果的待测试药物或候选物质可以是蛋白质或其片段、小分子抑制剂，甚至是核酸分子。可能能够证明通过应用筛选试验而鉴定出的最有用的药用化合物是结构上与其它已知的肥胖调节剂相关的化合物。这些活性化合物可包括天然产生的化合物的片段或其一部分，或可以是发现的原先无活性的已知化合物的活性组合。然而，在人或动物模型中测试这些化合物之前，必须测试各种候选物以确定哪一个具有潜力。
因此，所述活性化合物可包括天然产生的化合物的片段或其一部分，或可以是发现的原先无活性的已知化合物的活性组合。因此本发明提供筛选试验来鉴定能抑制或治疗肥胖症的药物。建议从天然来源，如动物、细菌、真菌、植物来源(包括树叶、树皮)、海洋样品分离的化合物作为候选物测试其是否存在有用的潜在药物制剂。
应理解，待筛选的药物制剂也可以从化学组分或人造化合物中产生或合成。因此，可理解本发明所鉴定的候选物可以是多肽、多聚核苷酸、小分子抑制物，或可通过合理的药物设计从用于治疗肝脏疾病的已知药物出发设计的任何其它无机或有机化学化合物。
某些情况下的“有效量”是能有效地可重复性地改变肝脏疾病某给定指数(indicator)的量。
用测试化合物治疗动物涉及到以适当剂型给予动物此化合物。给药可通过临床或非临床目的所用的任何途径，包括但不限于口服、鼻腔、口含、直肠、阴道或局部给药。或者，可通过气管内滴注、支气管滴注、皮内、皮下、肌内、腹腔内或静脉内注射给药。具体考虑全身性静脉注射，经血液、脑脊液(CSF)或淋巴液局部给药和肿瘤内注射。
确定某化合物的体内效果可能涉及各种不同的标准。这些标准包括但不限于存活率、炎症反应的抑制或预防、活动水平提高、免疫效应子功能改善和食物摄取改善。
如本文所证明的那样，HCV蛋白酶抑制剂VX-950可有效缓解脂肪变性。因此，本发明的另一实施方式是提供一种抑制脂肪变性的方法，该方法包括给予需要的病人有效量的蛋白酶抑制剂。本发明也提供治疗或预防具有脂肪变性症状的疾病、病症或紊乱。这些疾病包括但不限于NAFLD、NASH、酒精性脂肪变性和雷氏综合征。
VX-950是一种竞争性、可逆的模拟肽HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂，其稳态结合常数(ki*)为3nM(Ki为8nM)(见Perni等在AASLD会议，Boston，2003年10月上提供的通报；WO 02/18369)。
VX-950本发明也可用其它蛋白酶抑制剂。例如，可采用VX-950的手性混合物。某些实施方式中，可用的化合物是具有以下结构的N-丙基侧链的D-和L-异构体的混合物
结构A本文实施例中实验所用的化合物称为“VX-950”，以N-丙基侧链差向异构体混合物形式存在。该化合物的结构如结构式A。应知结构式A描述了N-丙基侧链D-和L-非对映异构体的混合物。对利用VX-950或结构A化合物作为起始化合物通过合理的药物设计产生的其它药物，可测试它们的蛋白酶抑制活性。此外，还有许多其它本领域技术人员知道的蛋白酶抑制剂可用本发明方法测试。抑制剂的示范性例子包括以下PCT专利申请中所述的HCV蛋白酶抑制剂WO02/18369，WO 02/08244，WO 00/09558，WO 00/09543，WO 99/64442，WO99/07733，WO 99/50230，WO 98/46630，WO 98/17679和WO 97/43310，美国专利5990276，M，Linas-Brunet等，Bioorg，Med Chem Lett，81713-18，1998；W，Han等，Bioorg，Med Chem Lett，101571-79，2000；M Linas-Brunet等，Bioorg，Med Chem Lett，102267-70，2000和S LaPlante等，Bioorg，Med ChemLett，102271-74，2000。治疗脂肪变性方法中可采用这些和其它含有蛋白酶抑制剂的组合物。
也可考虑联合治疗脂肪变性或其它肝脏疾病。本发明的这种联合治疗方法也包括给予另一种组分，该组分含有另外的药剂，这些药剂选自免疫调节剂、抗病毒药剂、HCV蛋白酶抑制剂、HCV生命周期其它靶标的抑制剂、内部核糖体进入抑制剂、广谱病毒抑制剂、其它细胞色素P-450抑制剂、肝保护性制剂、脂肪变性抑制剂等，或这些药物的组合。见WO 02/18369。
因此，在另一实施方式中，本发明提供的方法包括给予蛋白酶抑制剂和其它抗病毒制剂，优选抗HCV制剂。这类抗病毒制剂包括但不限于免疫调节剂如α-、β-和γ-干扰素、PEG化的衍生的干扰素-α化合物和胸腺素；其它抗病毒制剂如病毒唑、金刚胺、汰比夫定；丙肝蛋白酶的其它抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3/NS4A抑制剂)；HCV生命周期其它靶标的抑制剂，包括螺旋酶、聚合酶和金属蛋白酶的抑制剂；内部核糖体进入抑制剂；广谱病毒抑制剂如IMPDH抑制剂(如美国专利5807876；6498178；6344465；6054472；WO 97/40028，WO98/40381，WO 00/56331所述的化合物，和霉酚酸及其衍生物，包括但不限于VX-497、VX-148和/或VX-944)；或任意上述药物的组合。
本文采用了以下定义(其中商标指本申请提交日时可得到的产品)。
“PEG化干扰素”指PEG-Intron，PEG化干扰素α-2b，可从ScheringCorporation，Kenilworth，NJ购得即；“Intron”指可从Schering Corporation，Kenilworth，NJ购得的干扰素α-2b，即Intron-A。
“利巴韦林(ribavirin)”指可从ICN制药公司，Costa Mesa，CA购得的在Merck Index entry 8365，第12版中有所描述的病毒唑(1-β-D-核糖呋喃-1H-1，2，4-三唑-3-羧氨基，也可从Schering Corporation，Kenilworth，NJ购得，称为Rebetol，或从Hoffman-La Roche，Nutley，NJ购得，称为Copegus；“Pagasys”指Pagasys，PEG化干扰素α-2a，可从Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ购得；“Roferon”指Roferon，重组干扰素α-2a，可从Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ购得；“Berefor”指Berefor，干扰素α-2，可从Boehringer Ingelheim PharmaceuticalInc，Ridgefied，CT购得；Sumiferon，一种纯化的天然α-干扰素混合物，如Sumiferon购自Sumitomo，日本；Wellferon，干扰素αn1，购自Glaxo-Wellcome Ltd.，Great Britain；Alferon，天然干扰素α的混合物，由Interferon Sciences制备，购自PurdueFrederick Co.，CT；术语“干扰素”本文指抑制病毒复制、细胞增殖和调节免疫反应的高度同源的种属特异性蛋白质家族的成员，如干扰素α、β或γ。Merck Index，entry 5015，第12版。在WO 02/018369中也有干扰素的描述。本发明实施方式中可采用这些干扰素之一。HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶阻断干扰素调节因子-3(IRF-3；见Foy等，Science 3001145-1148)的磷酸化和效应字作用。IRE-3是关键性的信号分子，因此HCV蛋白酶对该分子的作用可导致HCV感染恶化。抑制HCV蛋白酶可恢复IRE-3的功能，具有治疗HCV感染的治疗价值。因此可利用本发明的动物模型测试能缓解HCV蛋白酶对IRE-3信号传递的作用的药物的效果。
按照本发明的优选实施方式，干扰素是α干扰素。按照另一实施方式，本发明采用天然α干扰素2a，或本发明采用天然α干扰素2b。另一实施方式，本发明采用重组α干扰素2a或2b。还有一实施方式，干扰素是PEG化的α干扰素2a或2b。适合本发明的干扰素包括(a)Intron，(b)Peg-Intron，(c)Pegasys，(d)Roferon，(e)Berofor，(f)Sumiferon，(g)Wellferon(h)购自Amgen Inc.，Newbury Park，CA的共有序列α干扰素，(i)Alferon，(j)Viraferon，(k)Infergen。
如本领域技术人员所知，治疗方案中优选口服给药。干扰素通常不口服给药。然而，本发明的方法或组合物不限制于任何特定的剂型或方案。即本发明方法的各部分和各化合物可分开、一起、或以任何组合形式给予。
本发明的方法也包括给予细胞色素P450单加氧酶抑制剂。CYP抑制剂可用于提高受CYP抑制的化合物的肝浓度和/或血液浓度水平。
改善药物的药代动力学(如通过给予CYP抑制剂)的好处为本领域普遍接受。通过给予CYP抑制剂，本发明减少蛋白酶抑制剂VX-950的代谢，从而改善VX-950的药代动力学。改善药物的药代动力学的好处为本领域普遍接受，这种改善可导致蛋白酶抑制剂的血液浓度水平提高。对于HCV治疗，更重要的是此种改善可导致肝脏中该蛋白酶抑制剂的浓度提高。
在本发明的方法中，与缺乏CYP抑制剂时的VX-950血液浓度水平相比，给予CYP抑制剂的剂量足以提高该蛋白酶抑制剂的血液浓度水平。更为有利的，在本发明方法中，甚至可进一步降低所用的蛋白酶抑制剂的剂量(与单独给予蛋白酶抑制剂相比)。
CYP抑制剂包括但不限于利托那韦(WO 94/14436)、复方酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、环孢素、氯甲噻唑、西咪替汀、伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、氟伏草胺、氟西汀、奈法唑酮、珊特拉林、吲哚那韦、奈非那韦、安泼那韦、佛萨普那韦、沙奎拉韦、氯吡那韦、地拉韦定、红霉素、VX-944和VX-497。优选的CYP抑制剂包括利托拉韦、复方酮康唑、4-甲基吡唑、环孢素和氯噻唑。
已知测定某化合物抑制细胞色素P450单加氧酶活性能力的方法(见US6,037,157和Yun等，“药物代谢和处理”(Drug Metabolism and Disposition).第21卷403-407，1993)。
本发明所用的抑制剂可以是仅一种或一种以上同工酶的抑制剂。如果CYP抑制剂抑制多种同工酶，该抑制剂对一种同工酶的选择性抑制可能高于另一种同工酶。本发明方法可采用任意的这些CYP抑制剂。
本发明的实施方式可采用含化合物或其药学上可接受的盐的组合物，所述化合物如蛋白酶抑制剂(如VX-950)。如众所知，这类组合物通常含有药学上可接受的载体，并可含有本文所述的其它制剂(如CYP抑制剂)。各组分可存在于单独的组合物、联合的组合物或单一的组合物中。
如果这些组合物中采用化合物的药学上可接受的盐，这些盐宜衍生自无机或有机酸或碱。这类酸加成盐包括乙酸、己二酸、海藻酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、重硫酸、丁酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊丙酸、二葡糖酸、十二烷基磺酸、乙基磺酸、富马酸、葡糖庚酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、苹果酸、甲磺酸、2-萘磺酸、烟酸、草酸、棕榈酸、果酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸和十一酸。碱加成盐包括铵盐，碱金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，有机碱盐如二环己基胺盐、N-甲基-D葡糖胺，和氨基酸如精氨酸、赖氨酸盐等。
另外，碱性含氮基团可用以下试剂季胺化例如低级烷基卤如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；二烷基硫酸盐如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐，长链烷基卤如癸基、月桂基、肉豆蔻基和十八烷基氯、溴和碘；芳基卤如苯甲基、苯乙基溴等。从而获得水可溶或油可溶性、或分散性产物。
本发明组合物和方法中采用的化合物也可用附加的适当功能团修饰以提高选择性生物学性能。这类修饰是本领域已知的，包括提高对给定的生物系统(如血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物学穿透性能、提高口服利用率、提高溶解性能，以便可通过注射给药、改变代谢和改变排泄速率。
这些组合物中所用的药学上可接受的运载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质如人血清白蛋白、缓冲基质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的甘油脂混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、锌盐、胶质二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羟甲基纤维素钠、丙烯酸盐、蜡质、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌合聚合物、聚乙烯醇和羊毛脂。
按照优选实施方式，这些组分配制成给予哺乳动物，优选人类的药物。
本发明的药物组合物(以及本发明方法、组合物、试剂盒和包装中所用的组合物)可口服、经胃肠道外、舌下、喷雾吸入、局部、经直肠、经鼻、经口颊、经阴道或经植入的贮存器给予。本文术语“经胃肠道外”包括皮下、静脉、肌肉、关节内、滑膜内、胸骨内、囊鞘内、肝内、病灶内、颅内注射或灌注技术。优选口服或静脉内给予该组合物。
本发明组合物的灭菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可按照已知的技术采用适当的分散或湿润试剂和悬浮试剂配制。该灭菌可注射制品也可以是用无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂配制的可注射灭菌溶液或悬液，例如用1，3-丁烷基二醇配的溶液。可采用的可接受载体和溶剂是水、林格式溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常规采用灭菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的固定油，包括合成的单-或双-甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射药物，因为是天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化酯。这些油性溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或相似的分散剂，它们常用于药学上可接受的剂型，包括乳液和悬浮液。也可用在制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型时常采用的其它表面活性剂，如吐温、Spans和其它乳化剂或生物利用度增强剂来用于配制的目的。
在本发明所用的组合物(即用于本发明方法、试剂盒、组合物或包装的组合物)中，所述化合物和任选的其它制剂的剂量水平应为单一治疗方案中给药剂量的约10-100％，更优选约10-80％。
该药物组合物口服给药时可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、药片、药丸、药粉、颗粒、水悬液或溶液。就口服药片而言，常用的运载体包括乳糖和玉米淀粉。也常加入润滑剂如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服给药，可用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当需要口服水悬液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂相混合。如果需要，也可加入某种甜味剂、调味剂或着色剂。可接受的液体剂型包括乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。
或者，该药物组合物可以栓剂形式直肠给药。这可通过将药物与室温下为固体但在直肠温度时为液体因而可在直肠内融化从而释放药物的适当的无刺激性赋形剂混合制备。这类物质包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
该药物组合物也可局部给药，特别是当治疗目标包括局部应用易于接近的区域或器官，包括眼睛、皮肤或肠道下部的疾病。对这些区域或器官不难制备合适的局部用剂型。
肠道下部局部给药可用直肠栓剂进行(见上)或用合适的灌肠剂。也可采用局部透皮贴片。
对于局部应用，该药物组合物可配制成适当的油膏，该油膏含有悬浮或溶解在一种或多种运载体中的活性成分。用于局部给予本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、鲸鱼脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，该药物组合物可配制成适当的洗液或霜剂，该洗液或霜剂含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受载体中的活性成分。合适的载体包括但不限于矿物油、单硬脂酸脱水山梨醇、多乙氧基醚60、软脂酸酯蜡、鲸芳醇、2-辛基十二醇、苄醇和水。
对于眼科用药，可将该药物组合物用等渗的、pH调整的灭菌盐水配成微粒化悬液，或优选的，用等渗的、pH调整的灭菌盐水配成溶液，两种情况下均为加或不加防腐剂(如盐酸苄基醇)。或者，对于眼科用药，可将该药物组合物配成油膏如凡士林。
本发明的和根据本发明的药物组合物也可作为鼻内气溶胶给药或吸入。可按照药物制剂领域熟知的技术制备这类组合物，可配成盐水溶液，采用苯甲醇或其它适当的防腐剂、吸收促进剂(以提高生物利用度)、氟碳化合物和/或其它常规促溶或促分散剂。
本领域已知，该药物组合物也可以脂质体形式给药。
优选将本发明的药物组合物配成口服给药。
按照一优选实施方式，所述蛋白酶抑制剂(优选VX-950)存在的量能有效减少样本或病人中的脂肪变性。
本发明方法中所用化合物(如VX-950)的剂量水平为每日每千克体重约在0.01-100mg之间，优选在0.5-75mg之间。对于CYP抑制剂，通常剂量水平在每日每千克体重约0.001-200mg之间，更通常在约0.1-50mg之间，或约1.1-25mg之间。通常本发明的药物组合物每天给药约1-5次，或者连续输注。这种给药方式可用于慢性或急性治疗。可与载体物质混合产生单一剂型的活性成分的用量根据所治疗的宿主和给药的具体方式而变化。典型的制品含有约5-95％的活性化合物(w/w)。优选的，这类制品含约20-80％的活性化合物。
熟练的医师知道，干扰素的用量通常以IU计(例如约400万至1200万IU)。
在病人病情改善时，如有需要可给予维持量的化合物或组合物。然后给药的剂量或频率，或二者，可视症状而减至维持病情改善的水平，症状已缓解至理想水平时可结束治疗。然而，如果疾病症状复发，病人可能需要长期间歇性治疗。
也应理解，对某病人给予的具体剂量和治疗方案取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性，病人的年龄、体重、总体健康情况、性别、饮食、给药次数、药物排泄速度、药物组合和治疗医师的判断及所治疗具体疾病的严重程度。活性成分的用量还取决于所述具体化合物和该组合物中是否存在其它抗病毒药物及其性质。
利托那韦(Ritonavir)的优选剂型见美国专利6,037,157，及其引用的文献美国专利5,484,801；美国专利申请08/402,690和国际专利申请WO 95/07696和WO 95/09614。
根据另一实施方式，本发明提供治疗1)感染了含有病毒编码的NS3/4A丝氨酸蛋白酶(为病毒生命周期所必须)的病毒的病人；或2)患有肝损伤的病人的方法，该方法是给予所述病人含有用本发明方法鉴定的化合物的药学上可接受的药物组合物。优选的病人为人类患者。
在另一实施方式中，本发明提供预处理用于给予病人的生物制剂的方法，该方法包括使所述生物制剂与含有本发明化合物的药学上可接受的组合物接触的步骤。这类生物制剂包括但不限于；血液及其组分，如血浆、血小板、血细胞亚群等；器官如肾、肝、心、肺等；精子和卵子、骨及其组分、输入病人体内的其它液体如盐水、葡萄糖液等。
本发明也提供制备含有用本发明方法鉴定的化合物的组合物的方法。本发明的另一实施方式提供将本发明方法鉴定的化合物与本文所述一种或多种其它药物组合的方法。
药物组合物也可以“病人包”形式处方给予病人，所述“病人包”在一个包装中装有整个治疗方案(如发疱药包)。病人包与传统处方相比具有优势，药剂师可将大量药物分发给病人，而病人常可取得病人包中的说明插页，这是传统处方中一般没有的。包装中装入的插页已显示可改善病人对医嘱的依从度。
应理解本发明给予单个病人包或各制剂病人包中的组合物，这些病人包里面均装有指导病人正确使用的包装插页，这是本发明的另一优良特征。
本发明另一方面内容是装有用本发明方法鉴定的至少一种化合物和写有使用该化合物指南资料的插页。本发明另一实施方式中，该药物包还装有一种或多种本文所述的其它药物。可在同一包装或分开的包装中提供其它药物。
本发明另一方面内容是实施本发明方法的包装药盒，该药盒包含实施本发明方法的材料；和给予药物以有效治疗或预防HCV感染的说明书。
因此本发明提供的药盒能同时或依次给予用本发明方法鉴定的化合物(和任选的其它药物)或其用常规方法制备的衍生物。通常该药盒含有以药学上可接受的载体(以一种或多种药物剂型)配制的各种抑制剂和任选的其它药物的组合物，以及同时或依次给药的书面说明书。
在另一实施方式中，提供的包装药盒装有自我给药的一种或多种剂型；一种容器，优选是密封的，用于在贮存期间和用药之前保存该剂型；以及病人自行服药的说明书。该说明书通常是包装插页、标签和/或药盒中其它组分上的书面说明，，剂型如上所述。每种剂型可分开装，如在金属箔-塑料片中，每一剂量彼此分开装在单独的小室或泡 中，或可将其装在单个容器中，如塑料瓶或小瓶中。该药盒通常还包括用于包装药盒各组分的物质，即剂型，容器物质和用法的书面说明。这种包装物质可用硬纸板或纸箱、塑料或金属箔袋形式等。
通用方法可用本领域技术人员已知的方法制备VX-950(见，例如本文引用的文献)。
熟练医师已知的常规技术可用于实施本发明。这些技术可在出版的文献中找到。例如，本领域熟知的标准重组DNA和分子克隆技术。见，例如，F.M.Ausubel.，分子生物学现有技术(Current protocols in Molecular Biology)，John Wiley & SonsInc.，Media，PA；Sambrook，J.，Fritsch，E.F.T Maniatis，T.，“分子克隆实验室指南”(Molecular CloningA Laboratory Manual)；Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，1989，以及美国专利6,617,156和6,617,130中引用的文献，以上内容均纳入本文作参考。
为了更全面理解本发明而给出以下实施例。这些实施例的目的只是说明本发明而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1报告基因的设计和构建采用重叠性PCR来融合编码HCV NS3·4A和分泌型胎盘碱性磷酸酶的cDNA。用以下物质作PCR扩增HCV NS3·4Aa)a)NS4A U25’CAG CAG CAG GTA AGG GAG GTG TGA GGC GCACTC TTC CAT CTC ATC GAA CTC3’作为上游引物；b)b)NS4AL45’TGT CTG TCA TCC CGA CCA ACG3’作为下游引物。这样用pYes2/NS3·4A质粒作为模板PCR时产生一个893bp的产物。PCR条件是94℃45秒，50℃45秒，72℃1分钟。
同样，用PCR扩增分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)a)SEAP L35’AGT GAG ATC TGC GGC CGC TTA TCA TGT CTG CTC GAAGCG G3”作为下游引物；b)SEAP U5’TCA CAC CTC CCT TAC CTG CTG CTG CTG CTG CTG C3’作为上游引物，PCR条件是94℃45秒，55℃45秒，72℃1.3分钟。
将得到的PCR产物用QiaexII胶抽提试剂盒(Cat#20021 Qiagen)作胶纯化。用这些胶纯化的产物作为模板，NS4A L4与SEAP L3作为引物和PfU聚合酶(Stratagene)进行重叠性PCR扩增，使PCR产物NS3·4A与SEAP融合。
在另一实施方式中，制备了另一构建物。在此构建物中，用重叠性PCR，在HCV NS3·4A基因与编码分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的报告基因之间框内(in-frame)融合了HCV基因型1b的NS4A·4B连接区-(DEMEEC-ASHL)。经94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒从pYes2-NS3·4A质粒中扩增出了HCVNS3·4A(Markland等，1997)，采用以下PCR引物上游引物TGTCTGTCATCCCGACCAACG[NS3的nt1193-1213或pShuttle/NS34A-SEAP(DEMEEC.ASHLPY连接区)构建物的nt2211-2231]；下游引物CAGCAGCAGCAGCAGGAGGTGTGAGGCGCACTCTTCCATCTCATCGAACTC(斜线代表SEAP ORF序列nt4-19，下划线序列是NSA4序列nt165-142)。
用pSEAP2(Clontech，Palo Alto，CA)经94℃45秒，55℃45秒，72℃90秒扩增分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，采用以下引物上游引物AGTGAGTCTGCGGCCGCTTATCATGTCTGCTCGAAGCGG(斜线代表Not I限制性酶切位点，下划线序列代表SEAP ORF序列nt1560-1542)；下游引物TGCGCCTCACACCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGC(下划线序列代表CASHL的编码序列，它是4A·4B连接区的一部分，斜线代表SEAP ORF序列nt4-28)。
将897bp的HCV NS3·4A和1591bp的SEAP PCR产物作为模板进行重叠性PCR，采用TGTCTGTCATCCCGACCAACG作为上游引物(NS3的nt1193-1213)和CCCACCTTGGCTGTAGTC作为下游引物(SEAP ORF的nt709-726或pShuttle HCV WT/MT NS3·4A-SEAP[DEMEEC.ASHLPY连接区]的nt3799-3817。用Sali和PvuII限制性酶切1.6kb大小的PCR产物(产生1039bp大小的限制性片段)，克隆入pShuttle HCV WT NS3·4A-SEAP[DEMEEC.ASHLPY连接区]和pShuttle HCV MT NS3·4A-SEAP[DEMEEC.ASHLPY连接区]。
重组克隆经Hind III检测性限制性酶切进行鉴定，(用pShuttle HCV WTNS3·4A-SEAP和pShuttle HCV MT NS3·4A-SEAP[DEMEEC-ASHL连接区]转染CRL 1830小鼠肝细胞)转染48小时后用Western印迹法检测HCV蛋白酶的表达情况。
如先前所述，用管家内切核酸酶(Iceu I和PIsce I)消化pShuttle HCVWT-NS3·4A-SEAP和pShuttle HCV MT-NS3·4A-SEAP(DEMEEC-ASHL连接区)，克隆入pAdenoX(Clontech，Palo Atlo，CA)中。
实施例2将PCR产物克隆到质粒载体中将2.5kb的重叠性PCR产物用Sal I和Bgl II限制酶消化，用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)克隆入编码野生型HCV蛋白酶(WT)或编码在HCV蛋白酶活性位点含有丝氨酸--＞丙氨酸突变的突变型(MT)蛋白酶的pYesNS3·4A中。将编码HCV NS3·4A SEAP的3.7kb的Hind III-Not I cDNA片段克隆入pCEP4哺乳动物表达载体中。在Vertex Pharmaceuticals Incorporated的DNA核心装置中对所得克隆进行DNA测序。
实施例3在细胞培养物中表达HCV-SEAP报告质粒在12孔板中用2.4μg编码HCV WT NS3·4A-SEAP或SEAP cDNA的Pcep4与lipofectamine2000(Invitrogen)转染CRL 1830小鼠肝细胞。在12孔板中用2.4μg HCV WT NS3·4A-SEAP和HCV MT NS3·4A-SEAP一式二份转染CRL 1830小鼠肝细胞。转染72小时后检测培养液的SEAP活性。如图6所示，用WTHCV蛋白酶构建物转染的细胞比接受突变型(MT)蛋白酶的细胞分泌了更多的SEAP到培养液中。
在图7所示实验中，在12孔板中用编码HCV WT NS3·4A-SEAP或SEAPcDNA的Pcep4与lipofectamine2000(Invitrogen)转染CRL 1830小鼠肝细胞，并用0-40μM不同浓度的HCV蛋白酶抑制剂处理。48小时后检测培养液的SEAP活性。图7显示SEAP分泌受到HCV蛋白酶抑制剂的剂量依赖性抑制。
实施例4将HCV WT和MT NS3·4A-SEAP克隆到腺病毒中如图8所示，将pCEP4-HCV 34A-SEAP的NheI-NotI片段克隆到pShuttle腺病毒穿梭载体中。Pshuttle HCV WT和MT NS3·4A-SEAP用PI-SceI和IceuI双酶切，克隆到相似酶切的pAdeno-X DNA(BDBioscienes)中。用磷酸钙转染法(磷酸钙转染试剂，Gibco BRL)，将PacI限制性酶切的pAdeno-HCV WT/MTNS3·4A-SEAP DNA转染到HEK293细胞(ATCC)中。培养细胞二周至出现腺病毒感染的细胞病变作用，然后收集细胞中的重组腺病毒。继续感染更多HEK293细胞而扩增此病毒。利用氯化铯条带纯化编码HCV WT/MTNS3·4A-SEAP的腺病毒。
实施例5HCV-SEAP在用携带HCV WT和MT NS3·4A-SEAP报告构建物的腺病毒载体转导的细胞中表达制备表达HCV NS3·4A SEAP WT和突变体的腺病毒并稀释成20个MOI。接种在12孔板中的5×105个CRL 1830小鼠肝细胞24小时后用于转染。如图9所示，感染携带有通过NS4A-NS4连接区而融合SEAP报告子和WT HCVNS3·4A的腺病毒的小鼠肝细胞，向培养液中分泌的SEAP比接受突变构建物的细胞显著增多。
为了测试HCV蛋白酶抑制剂对HCV蛋白酶依赖性SEAP分泌的抑制作用，将抑制剂B稀释成80、40、20、10、5倍于其IC50，感染前30分钟每孔细胞加入1ml(最终浓度为40、20、10、5、2.5×IC50)。
在200μl中加入2μl腺病毒，1∶100稀释(原液为1.8×1012)，然后取14μl加入12.5ml培养基中(达到20个MOI)，每孔加入1ml培养基。培养细胞72小时，取20μl培养基用于SEAP化学发光试验(TROPIX)。研究结果见
图10。
实施例6用携带HCV WT和MT NS3·4A报告构建物的腺病毒载体转导的小鼠血清中HCV-SEAP的分泌为了检测和比较用含WT和MT HCVNS3·4A-SEAP的腺病毒转导的小鼠分泌的SEAP量，将各组病毒注射入SCID小鼠的尾静脉中。测定这些小鼠血清中的SEAP量，结果见
图11。P＜0.01时结果有意义。
为研究HCV蛋白酶抑制剂能否抑制在WT HCV蛋白酶而非MT蛋白酶控制下的SEAP分泌，给6周龄SCID小鼠注射1010或109.5IFU的表达融合了SEAP报告基因的HCV WT或HCV MT的腺病毒，小鼠注射剂量为用Niro悬浮载体配制的抑制剂B 300mg/kg每天二次共二天。72小时后小鼠取血，1∶500稀释血清后用BD Biosciences试剂盒评估血清SEAP水平。该研究结果见
图12。
实施例7HCV肝病病理模型给6周龄SCID小鼠(经尾静脉)注射所示表达野生型(WT)或突变型(MT)HCV蛋白酶的腺病毒构建物(1011IFU/每只)。一组注射WT病毒的小鼠(n＝8)用HCV蛋白酶抑制剂(抑制剂B，300mg/kg)治疗三天。7天后处死动物收集肝脏作病理学检查。其粗略的形态学变化见
图13。
实施例8用油红O染色脂肪肝(脂肪变性)和用苏木精反染细胞核1.检查-80℃保存的肝脏冰冻切片；2.如下制备油红O溶液a)油红O贮存液取500mg油红O染料(Sigma O-0625)溶于100ml异丙醇室温搅拌过夜。通过#1 Whatman滤纸过滤该溶液。室温避光贮存此溶液。
b)试验当天制备新鲜油红工作液，将40％水和60％油红O贮存液颠倒混合。
c)工作液室温放置1小时后过滤。用#1 Whatman滤纸过滤除去颗粒物质；3.用PBS配的10％福尔马林室温固定切片2小时；4.用DI水小心润洗固定的切片三次5分钟。润洗切片时要小心不要洗去肝薄切片；5.用油红O工作液室温染色固定的切片2小时；6.将固定的染色切片用DI水小心润洗1小时。第二次用DI水润洗过夜，第三次再1小时；7.用Harris苏木精反染核1分钟；8.用自来水润洗玻片5分钟；9.再用DI水润洗玻片2次5分钟10.用水性固定介质(Biomeda-Gel/mount，with anti Fading #M01D)固定玻片防止油进入到介质中；11.用澄清指甲油密封玻片边沿；12.将玻片6℃平置保存；13.用显微镜评估结果。
参见Flinders Medical Centre；“修饰的油红O技术”Modified Oil Red OTechnique的“组织病理学方法4”Histopathology Methods 4(www.hoslink.com/histo/4.HTM)，108页；Cook HC，Manual of HistologicalDemonstration Techniques，第360页，Cullings CFA，“组织病理学和组织化学技术手册”Handbook of Histopathlogical and Histochemical Technique第3版；Histochemistry(1992)，493-497。
实施例9产生HCV复制子细胞将亲代Huh-7细胞培养在DMEM(Dulbecco’s改良的Eagles培养基，JRHBiosciences，Lenexa，KS)中，含有10％热灭活胎牛血清(ΔFBS，JRH)，添加2mM谷氨酰胺与非必需氨基酸(JRH)。用与Lohmann等所述的I377neo/NS3-3’/wt复制子(Lohmann V，F.Komer，J.Koch，U Herian，L.Theilmann，和R.Bartenschlager.1999.“肝细胞系中的亚基因组丙肝病毒RNA复制”，Replication of subgenomichepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.Science.285110-3)相同的体外转录的亚基因组HCV复制子RNA转染细胞。选出含有自身复制的HCV复制子的稳定细胞保存在250μg/ml G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，然后用于后续HCV复制子试验。
实施10二天HCV复制子抑制试验将HCV复制子细胞接种在含10％ΔFBS的DMEM培养液的96孔板中，细胞密度为104/孔，让细胞附着生长过夜(约16小时)。然后除去培养液，用含系列稀释化合物(或无化合物作为对照)的DMEM替代，培养液含2％FBS和0.5％DMSO。用化合物培养细胞48小时。为测定化合物的抗病毒活性，用QiagenRNeasy 96试剂盒(Qiagen，Valencia.CA)抽提细胞的总(胞内)RNA。用实时多重定量RT-PCR(Taqman，见WO 02/061149)检测HCV RNA水平，采用HCV特异性引物(5’-CCA TGA ATC ACT CCC CTG TG-3’)和(5’-CCG GTC GTC CTGGCA ATT C-3’)及HCV特异性探针(5’-6-FAM-CCT GGA GGC TGC ACG ACACTC A-TAMRA-3’)和ABI Prism7700序列检测系统(Applied Biosystems，FosterCity，CA)。作为RNA抽提和定量的内部对照，在抽提前每份样品中加入已知量的BVDV RNA，在多重RT-PCR中用特异性引物和探针扩增。每个数据点代表5个重复孔(细胞培养)的平均值。IC50是使复制子细胞中HCV RNA水平减少50％时化合物的浓度。为监测细胞毒作用，用四唑化合物(MTS)试验(CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega，Madison，WI)测定化合物处理48小时后同一复制子细胞的活力。CC50是细胞活力降低50％时化合物的浓度。
实施例11HCV Ki试验方案用于分离5AB底物和产物的HPLC Microbore方法底物NH2-Glu-Asp-Val-Val-(α)Abu-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-COOH用DMSO w/0.2M DTT制备20mM 5AB贮存液(或由你选择的浓度)。等份-20℃贮存。
缓冲液50mM HEPES，pH7.8；20％甘油，100mM NaCI，试验总体积100μl
混合缓冲液、KK4A、DTT和tNS3；将每份78μl加入96孔板的各孔中，30℃孵育5-10分钟。
将2.5μl相应浓度的测试化合物溶于DMSO(只含DMSO作为对照)，加入各孔中，室温孵育15分钟。
加入20μl 250μM的5AB底物启动反应(25μM浓度等于或略低于5AB的Km)。
30℃孵育20分钟。
加入25μl的10％ TFA终止反应。
转移120μl等份到HPLC小瓶中。
用以下方法将SMSY产物和底物及KK4A分离Microbore分离方法仪器Agilent 1100脱气机G1322A二元泵G1312A自动采样器G1313A柱恒温室G1316ADiode阵列检测仪G1315A层析柱Phenomenex Jupiter5micron C18；300angstroms；150×2mm；P/O 00F-4053-B0层析柱定温于40℃注射体积100μl；溶剂A＝HPLC级水+0.1％ TFA；溶剂B＝HPLC级乙腈+0.1％ TFA
终止时间17分钟后运行时间10分钟。
如本文所用，术语“包含(含有、包括)”指除特定的试剂和元件外，可能包括其它试剂或元件。
本文所引用的所有文献均纳入作为参考。
虽然我们已描述了本发明的许多实施方式，但显然可改变我们的实施例而提供利用本发明化合物和方法的其它实施方式。因此应理解本发明的范围是由附属的权利要求书而不是上述实施代表的具体实施方式
所确定。
权利要求
1.一种非人哺乳动物，其肝脏含有基因系统，所述基因系统包含A)启动子B)编码蛋白酶的DNA；和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接，当存在报告子活性时表明有蛋白酶活性。
2.如权利1所述的哺乳动物，其特征在于，所述报告子选自分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿荧光蛋白(GFP)、或辣根过氧化物酶。
3.如权利2所述的哺乳动物，其特征在于，所述报告子是分泌型碱性磷酸酶(SEAP)。
4.如权利1-3任一项所述的哺乳动物，其特征在于，可在该哺乳动物的血液、组织或血清中检测到所述报告子。
5.一种非人哺乳动物，其肝脏含有基因系统，所述基因系统包含可操作性连接的启动子和编码其表达可引起肝脏损伤的蛋白质的DNA。
6.如权利5所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白质是蛋白酶、激酶或脂酶。
7.如权利1-4或6任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶是病毒蛋白酶。
8.如权利7所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶是丙肝病毒蛋白酶。
9.如权利8所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶是HCVNS3·4A蛋白酶。
10.如权利9所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶DNA是野生型DNA。
11.如权利9所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶DNA是突变型DNA。
12.如权利1-11任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述基因系统可用病毒载体、直接肝内注射、静脉内注射或非病毒基因转移方法输入肝脏。
13.如权利12所述的哺乳动物，其特征在于，所述基因系统可用腺病毒载体输入肝脏。
14.如权利1-13任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述启动子是CMV、RSV、SV40或白蛋白启动子。
15.如权利14所述的哺乳动物，其特征在于，所述启动子是CMV启动子。
16.如权利1-15任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或黑猩猩。
17.从权利要求1-16任一项所述非人哺乳动物获得的细胞。其特征在于，该细胞含有所述基因系统。
18.一种肝细胞或肝细胞系，其包含基因系统，所述基因系统含有A)启动子，B)编码蛋白酶的DNA，和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接，当存在报告子活性时表明有蛋白酶活性。
19.一种肝细胞或肝细胞系，其包含有启动子和编码其表达可引起肝细胞损伤的蛋白质的DNA。
20.一种病毒载体，其含有A)启动子，B)编码蛋白酶的DNA，和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接。
21.一种病毒载体，其含有可操作性相连接的启动子和编码其表达可引起肝脏损伤的蛋白质的DNA。
22.一种产生用于蛋白酶活性的哺乳动物模型的方法，该方法包括提供一种哺乳动物；和给该哺乳动物输入基因系统，所述基因系统含有A)启动子，B)编码蛋白酶的DNA，和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接，当存在报告子活性时表明有蛋白酶活性。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述报告子是碱性磷酸酶(SEAP)、荧光素酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、或辣根过氧化物酶。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述报告子是分泌型碱性磷酸酶(SEAP)。
25.如权利要求22-24任一项所述的方法，其特征在于，可在所述哺乳动物的血液、组织或血清中检测到所述报告子。
26.一种产生哺乳动物肝脏损伤模型的方法，该方法包括a)提供哺乳动物；和b)给该哺乳动物输入基因系统，所述基因系统含有启动子和编码其表达可引起肝细胞损伤的蛋白质的DNA。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是蛋白酶、激酶或脂酶。
28.如权利要求22-25或27任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是病毒蛋白酶。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是丙肝病毒蛋白酶。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是HCVNS3·4A蛋白酶。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶DNA是野生型DNA。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶DNA是突变型DNA。
33.如权利要求22-32任一项所述的方法，其特征在于，所述基因系统可用病毒载体、直接肝内注射、静脉内注射或非病毒基因转移方法输入肝脏。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述基因系统可用腺病毒载体输入肝脏。
35.如权利要求22-34任一项所述的方法，其特征在于，所述启动子是CMV、RSV、SV40或白蛋白启动子。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述启动子是CMV启动子。
37.如权利要求22-36任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或黑猩猩。
38.一种非转基因、非人哺乳动物，所述哺乳动物的肝细胞含有表达构建物，所述表达构建物包含A)启动子，B)编码蛋白酶的DNA，和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接，所述构建物的表达可通过存在报告子活性检测，其表达表明有蛋白酶活性。
39.如权利要求38所述的哺乳动物，其特征在于，所述报告分子是分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、或辣根过氧化物酶。
40.如权利要求39所述的哺乳动物，其特征在于，所述报告子是分泌型碱性磷酸酶(SEAP)。
41.如权利要求38-40任一项所述的哺乳动物，其特征在于，可在该哺乳动物的血液、组织或血清中检测到所述报告子。
42.一种非人哺乳动物，所述哺乳动物的肝脏含有表达构建物，所述表达构建物包含可操作性相连接的启动子和编码其表达可引起肝脏损伤的蛋白质的DNA。
43.如权利要求42所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白质是蛋白酶、激酶或脂酶。
44.如权利要求38-41或43任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶是病毒蛋白酶。
45.如权利要求43所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶是丙肝病毒蛋白酶。
46.如权利要求45所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶是HCVNS3·4A蛋白酶。
47.如权利要求46所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶DNA是野生型DNA。
48.如权利要求46所述的哺乳动物，其特征在于，所述蛋白酶DNA是突变型DNA。
49.如权利要求38-48任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述表达构建物可用病毒载体、直接肝内注射、静脉内注射或非病毒基因转移方法输入肝脏。
50.如权利要求49所述的哺乳动物，其特征在于，所述表达构建物可用腺病毒载体输入肝脏。
51.如权利要求38-50任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述启动子是CMV、RSV、SV40或白蛋白启动子。
52.如权利要求51所述的哺乳动物，其特征在于，所述启动子是CMV启动子。
53.如权利要求38-54任一项所述的哺乳动物，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或黑猩猩。
54.从权利要求38-53任一项所述非人哺乳动物获得的细胞。其特征在于，该细胞表达所述表达构建物中的报告子基因。
55.一种用表达构建物转化或转染的肝细胞或肝细胞系，其含有A)启动子，B)编码蛋白酶的DNA，和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接，所述肝细胞或肝细胞系表达报告子活性。
56.一种产生用于蛋白酶活性的非转基因、非人哺乳动物模型的方法，该方法包括给予非人哺乳动物一种组合物的步骤，该组合物包含表达构建物，所述表达构建物含有A)启动子，B)编码蛋白酶的DNA，和C)编码报告子的DNA，其中A、B和C可操作性相连接，给予该组合物的量可有效地在所述哺乳动物的细胞中表达所述蛋白酶，当存在报告子活性时表明所述蛋白酶在所述动物中表达。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述报告分子是分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、或辣根过氧化物酶。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述报告分子是分泌型碱性磷酸酶(SEAP)。
59.如权利要求56-58任一项所述的方法，其特征在于，可在所述哺乳动物的血液、组织或血清中检测到所述报告子。
60.一种产生用于肝损伤的非转基因、非人哺乳动物模型的方法，该方法包括给予非人哺乳动物一种组合物，该组合物包含表达构建物，所述表达构建物含有启动子和编码其表达可引起肝细胞损伤的蛋白质的DNA。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是蛋白酶、激酶或脂酶。
62.如权利要求56-59或61任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是病毒蛋白酶。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是丙肝病毒蛋白酶。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是HCVNS3·4A蛋白酶。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶DNA是野生型DNA。
66.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶DNA是突变型DNA
67.如权利要求56-66任一项所述的方法，其特征在于，所述表达构建物可利用病毒载体、直接肝内注射、静脉内注射或非病毒基因转移方法输入肝脏。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述表达构建物可用腺病毒载体输入肝脏。
69.如权利要求56-66任一项所述的方法，其特征在于，所述启动子是CMV、RSV、SV40或白蛋白启动子。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述启动子是CMV启动子。
71.如权利要求56-70任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或黑猩猩。
72.一种检测能增强或抑制蛋白酶活性的药物的方法，该方法包括a)提供如权利要求1-4、6-16、38-41或43-53任一项所述的哺乳动物；b)给予该哺乳动物所述药物；和c)评价该药物对报告子表达的影响。
73.一种评估能增强或抑制肝损伤的药物的方法，该方法包括a)提供如权利要求5-16或42-53任一项所述的哺乳动物；b)给予该哺乳动物所述药物；和c)评价该药物对肝损伤的作用。
74.一种鉴定能调节脂肪变性的化合物的方法，该方法包括a)提供如权利要求5-16或42-53任一项所述的哺乳动物；b)给予该哺乳动物所述化合物；和c)评价该化合物对该哺乳动物脂肪变性的影响。
75.一种鉴定能治疗NAFLD、NASH、酒精性脂肪变性或雷氏综合征化合物的方法，该方法包括a)提供如权利要求5-16或42-53任一项所述的哺乳动物；b)给予该哺乳动物所述化合物；和c)选择能治疗或缓解NAFLD、NASH、酒精性脂肪变性或雷氏综合征影响的化合物。
76.一种治疗哺乳动物脂肪变性或脂肪肝的方法，该方法包括给予哺乳动物HCV NS3·4A蛋白酶抑制剂。
77.一种哺乳动物肝保护方法，该方法包括给予哺乳动物HCVNS3·4A蛋白酶抑制剂。
78.一种治疗哺乳动物NAFLD、NASH、酒精性脂肪变性或雷氏综合征的方法，该方法包括给予哺乳动物HCV NS3·4A蛋白酶抑制剂。
79.如权利要求75-77任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂是VX-950。
全文摘要
本发明涉及用于蛋白酶活性和肝损伤(包括脂肪变性)的非转基因、非人动物模型。
文档编号A01K67/027GK1898561SQ200480033162
公开日2007年1月17日 申请日期2004年9月13日 优先权日2003年9月12日
发明者G·卡尔克里, A·翁 申请人:威特克斯医药股份有限公司