专利名称：提高红豆杉中紫杉醇含量的方法
技术领域：
本发明涉及植物生长调节剂应用领域，特别是一种通过使用植物生长调节剂提高红豆杉紫杉醇含量的方法。
背景技术：
紫杉醇(Paclitaxel)是红豆杉树皮中的结构复杂的二萜类生物碱，广泛存在于Taxus属的红豆杉树中，是具有独特生理活性的新一代癌症化疗药物。商业用的紫杉醇主要来源于红豆杉的树皮，红豆杉是一个生长极其缓慢的树种，在树皮中紫杉醇的含量也很低，仅占干重的0.01％，治疗一个病人的紫杉醇需要量相当于60磅的红豆杉树皮，意味着有4株大树将被砍伐。虽然红豆杉属植物分布较广，但由于部分地域资源遭受破坏，天然林木日趋减少，已属于濒危珍惜树种。相对于原料资源来讲，紫杉醇存在供不应求的局面，而且目前矛盾十分尖锐。红豆杉野生资源利用十分有限，细胞培养技术目前还没有达到工业化生产水平，利用人工繁殖栽培扩大红豆杉资源是目前紫杉醇资源的可靠途径。我国虽然已建立了多处红豆杉的栽培生产基地，但生长极慢，紫杉醇含量低，提高栽培群体紫杉醇的含量是当前面临解决的一个难题。针对这一难点，企图通过采用使用一种新型植物生长调节剂冠菌素的方法，在一定时间内大幅度提高红豆杉茎叶中紫杉醇的含量。
植物生长物质是影响紫杉醇代谢的重要因素，目前研究最多的生长物质为茉莉酸或茉莉酸甲酯，它在植物次生代谢过程中起有重要的作用。大量研究发现，红豆杉细胞培养时加入不同浓度的茉莉酸甲酯(methyl jasmonate)，均能促进紫杉醇合成，其中以继代培养7天后加入作用效果最为明显，在红豆杉培养过程中加入10μmol/l茉莉酸甲酯，紫杉醇含量提高15倍，当茉莉酸甲酯与乙烯利(Ethrel)共同作用时紫杉醇提高19倍；而(3R，7R)和(3S，7R)-构型的茉莉酸甲酯对红豆杉细胞中紫杉醇的合成有较强的促进作用。
目前很多研究都是针对细胞培养的研究，对于植株紫杉醇代谢的研究很少，缺乏有效的调控技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供一种大幅度提高红豆杉中紫杉醇含量的方法。
为实现上述目的，本发明的方法是向红豆杉幼树的茎叶上喷施浓度为0.05-0.1mg/L冠菌素。所述的红豆杉幼树是温室内3-5年生红豆杉或野外扦插5-10年生红豆杉。
特别是，向温室内3-5年生红豆杉树叶面喷施冠菌素，重复喷施2-4次，每相邻两次喷施时间间隔为10-20天。
特别是，在8-10月份向野外扦插5-10年生红豆杉树叶面喷施冠菌素，重复喷施3-5次，每相邻两次喷施时间为间隔10-15天。
本发明的方法的优点和积极效果在于通过使用一定浓度的冠菌素，调节红豆杉的次生代谢系统，使红豆杉的茎叶紫杉醇含量提高1.6-2.9倍，大幅度提高紫杉醇产量，降低生产成本，提高生产企业的经济效益。
具体实施例方式
冠菌素(coronatin)，冠菌素是假单胞菌产生的一种物质，已证实它是茉莉酸的环戊烷结构类似物，可从多方面模拟茉莉酸多方面的功能。研究发现冠菌素与脱落酸、茉莉酸对植物有类似的功能，而且活性是后两者的数千倍，被认为是对植物有极大生理活性的生长调节物质。该调节剂为生物代谢产物，用量低，对环境是安全的。
实施例1温室内红豆杉处理处理材料为温室内栽培的4年生红豆杉小树，选择株高和分支数相同的小树，向红豆杉树叶面喷施浓度为0.05mg/L冠菌素，重复3次，每相邻两次喷施时间间隔15天。其中红豆杉树选择温室内3-5年生的、冠菌素浓度在0.05-0.1mg/L、喷施间隔时间为10-20天、重复喷施次数在2-4次范围内都是可行的。
2周后紫杉醇含量测定每个重复取5株，取样后先用自来水冲净根系，然后用蒸馏水清洗全株，吸水纸吸干水后分样，分别剪取侧根、茎、新叶和老叶，称取样品1g加入5ml甲醇研磨后，于超声波中处理4小时，离心吸出浸泡液再加入2ml甲醇，再重复一次，合并3次浸泡液9ml，减压蒸干后加入甲醇溶解；得到1ml甲醇提取液。吸取甲醇提取液加到SPEC18固相萃取柱顶端，分别顺序用10ml20％、80％甲醇溶液洗脱，萃取过程溶剂洗脱速度控制在3ml/min。收集80％甲醇洗脱液蒸干，加入0.5ml乙腈溶解，经0.22um微孔滤膜过滤，用HPLC分析紫杉醇含量。
取样期内器官紫杉醇含量最高的为根(0.0140±0.0045mg/g)其次为老叶(0.0113±0.0015mg/g)、茎(0.0082±0.0008mg/g)和新叶(0.0058±0.0011mg/g)。冠菌素处理在处理后两周根、茎、新叶、老叶的紫杉醇含量分别为对照的2.9倍、2.0倍、2.4倍、1.6倍，见表1；0.1mg/l冠菌素处理红豆杉2周采收可以大幅度提高器官内紫杉醇的含量，使人工种植红豆杉获得高的紫杉醇产量，提高资源利用率和生产者的经济效益。
表1 冠菌素处理对红豆杉紫杉醇含量影响比较分析
表1中数据为处理Taxol含量/对照Taxol含量比值实施例2野外红豆杉处理处理材料为野外栽培基地扦插繁殖的6年生红豆杉，选择株高相似的材料处理，于九月向红豆杉树叶面喷施浓度为0.1mg/l冠菌素，重复4次，每相邻两次喷施时间间隔12天。其中野外扦插红豆杉树选择5-10年生的、喷施时间8-10月、冠菌素浓度为0.05-0.1mg/l、喷施重复次数3-5次、间隔时间10-15天都是可行的。
2周后紫杉醇含量测定每个重复取5株，分别剪取茎、针叶，风干粉碎，过100目筛后，称取混合样品1g放到20ml试管中，加入10ml甲醇于超声波清洗器中超声处理4小时，离心倒出浸提液，再加入l0ml甲醇，重复两次上述超声处理步骤，合并3次浸泡液30ml，用旋转蒸发仪减压蒸干。然后加入1ml甲醇溶解，再用0.5ml甲醇洗两次，合并甲醇液得到2ml甲醇提取液。吸取甲醇提取液加到SPEC18固相萃取柱顶端，分别顺序用10ml20％、80％甲醇溶液洗脱，萃取过程溶剂洗脱速度控制在3ml/min。收集80％甲醇洗脱液蒸干，加入0.5ml乙腈溶解，经0.22um微孔滤膜过滤，用HPLC分析紫杉醇含量。
Cor处理两周后，红豆杉茎、叶的紫杉醇含量分别为0.288±0.07mg/g、0.118±0.03mg/g，为对照茎、叶紫杉醇含量的2.1倍1.5倍；表明0.1mg/l冠菌素处理可以大幅度提高器官内紫杉醇的含量。
使用本发明的方法可产生可观的经济效益由于使用冠菌素在短期内使红豆杉器官内紫杉醇产量大幅度提高，比对照提高1.6-2.9倍，降低生产成本，提高生产企业的经济效益。
使用本发明的方法可产生积极的生态效益红豆杉属第四纪冰川后残遗物种，天然分布地域狭窄、零散，加之人为偷盗、野蛮采种，使天然红豆杉生存处于濒危边缘，药用取其嫩小枝、叶、根做提取紫杉醇的原料，本发明可以大幅度提高栽培红豆杉的紫杉醇产量，减轻紫杉醇生产的巨额利润所带来环境压力，从根本上保护野生资源。
所以本发明的方法具有推广价值濒危红豆杉林繁育已被列入东北老工业基地高技术产业化项目和星火计划，黑龙江共栽种红豆杉1.24万亩，总栽种株数552万株；云南仅丽江就栽植1至2年生红豆杉苗250万多株。因此本专利有巨大的应用前景和经济效益。
权利要求
1.一种提高红豆杉中紫杉醇含量的方法，其特征在于向红豆杉幼树的茎叶上喷施浓度为0.05-0.1mg/L冠菌素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的红豆杉幼树是温室内3-5年生红豆杉或野外扦插5-10年生红豆杉。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于向温室内3-5年生红豆杉树叶面喷施冠菌素，重复喷施2-4次，每相邻两次喷施时间间隔为10-20天。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在8-10月份向野外扦插5-10年生红豆杉树叶面喷施冠菌素，重复喷施3-5次，每相邻两次喷施时间间隔为10-15天。
全文摘要
本发明提高红豆杉中紫杉醇含量的方法属于植物生长调节剂应用技术领域。该方法是向红豆杉幼树的茎叶上喷施浓度为0.05－0.1mg/L冠菌素。使用本发明的方法可以调节红豆杉的次生代谢系统，使红豆杉的茎叶紫杉醇含量提高1.6－2.9倍，大幅度提高紫杉醇产量，降低生产成本，提高经济效益。本发明的方法可产生积极的生态效益红豆杉属第四纪冰川后残遗物种，天然分布地域狭窄、零散，加之人为偷盗、野蛮采种，使天然红豆杉生存处于濒危边缘，药用取其嫩小枝、叶、根做提取紫杉醇的原料，本发明可以大幅度提高栽培红豆杉的紫杉醇产量，减轻紫杉醇生产的巨额利润所带来环境压力，从根本上保护野生资源。所以本发明的方法值得推广、普及。
文档编号A01N63/00GK1685832SQ20051001145
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月21日 优先权日2005年3月21日
发明者董学会, 李召虎, 段留生, 张明才, 何钟佩 申请人:中国农业大学