专利名称：应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法
技术领域：
本发明属于植物育种领域，特别是大豆和花生品质改良的生物工程育种领域。应用双链RNA基因沉默技术对大豆和花生的种子Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行改建，通过转基因技术对大豆和花生种子的脂肪酸含量进行特异性遗传改良，进而选育油酸含量高的大豆和花生材料。
背景技术：
双链RNA基因沉默是指在生物体内有双链RNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的，致使特定基因不能表达的遗传现象。双链RNA基因沉默技术是目前控制基因表达最有效和先进的技术，广泛的应用在植物基因工程的研究领域。Δ12脂肪酸脱氢酶是脂肪酸代谢中催化油酸形成亚油酸的关键酶，利用RNA反向重复序列引发的基因沉默原理对大豆和花生种子Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行基因改造，导致该基因沉默，使Δ12脂肪酸脱氢酶形成受阻和催化活性降低，从而减少亚油酸的合成，积累大量的油酸。一般的大豆种子油脂中油酸含量约为20％，花生为40-50％。油酸是一种单不饱和脂肪酸(18∶1)，稳定性高，能够降低人体中总胆固醇和血脂，降低有害的低密度脂蛋白胆固醇(LDC)，但保持有益高密度脂蛋白胆固醇(HDL)的水平。由于油酸稳定而益于健康的特点，提高大豆和花生种子油酸的含量以改善其营养价值和氧化稳定性，已成为目前大豆和花生品质改良的重要内容。
双链RNA基因沉默是指在生物体内有双链RNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的，致使特定基因不能表达或降低表达的遗传现象。自从双链RNA在基因沉默中的重要性被发现以来，世界上许多实验室将双链RNA基因技术用于植物基因功能研究和植物品质改良研究。这个技术是目前最有效的RNA水平上的基因表达抑制手段，其基因抑制效果远高于传统的反义antisense基因沉默技术。本发明所采用的发卡式双链RNA(带有部分内含子，hpRNA-intron)基因沉默结构是目前所研究的基因沉默类型中效率最高的，可达100％，而正义sense和反义antisense抑制的沉默效率为10％和15％，不带有内含子的发卡式双连RNA结构(hpRNA-loop)的沉默效率为69％，这些结果已经被很多实验所证实(Smith et al.2001 Nature 407319)。
高油酸大豆美国的DUPOND公司的高油酸大豆品种(G94-1，G94-19，and G168)，1996年申请专利，1997年获得美国FDA批准可以通过商品化进入市场。他们所获得的高油酸大豆材料的目的基因和来源为编码Δ-12油酸脱氢酶的gmFad2-1基因的正义抑制(sense)。与我们所采用双链RNA基因沉默的设计和构建来抑制大豆油酸脱氢酶(Δ-12油酸脱氢酶)gmFAD2-1的活性，进而合成和积累大量油酸的工作原理完全不同。
发明内容
本发明的目的在于应用双链RNA引发的基因沉默技术，设计和构建大豆和花生种子Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的特殊转化载体，通过基因工程手段，导致该基因的沉默，促进种子中油酸的积累，获得高油酸的大豆和花生材料。通过对大豆和花生种子Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与改建，构建FAD2-1的反向重复序列结构，并应用FAD2-1种子特异表达的启动子和终止子，其特殊的基因载体构建会导致FAD2-1基因沉默，进而达到合成大量油酸的目的。即本发明的目的是提供一种应用双链RNA基因沉默技术提高大豆和花生种子油酸含量的方法。
1.应用PCR方法，从大豆和花生基因组中克隆种子特异的Δ12脂肪酸脱氢酶基因片段，并根据双链RNA基因沉默原理将该基因片段构建成反向重复序列结构；2.将大豆和花生种子特异的Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的反向重复序列基因片段构建到含有种子特异性表达的启动子和终止子的载体中；3.通过农杆菌介导转化方法进行基因转移，组织培养和筛选工作，在其转基因后代中筛选高油酸含量的株系；采用PCR和Southern blot方法检测目的基因，用气相色谱(GC)检测油酸含量，通过系统选育，确立高油酸含量稳定的大豆和花生材料。
本发明可以缩短周期，提高效率，大幅度提高油酸含量，这将促进我国的大豆和花生品质改良育种的研究和发展。大豆和花生种子Δ12脂肪酸脱氢酶基因反向重复序列结构的设计与构建，可以提高目的基因的表达效率，通过建立的大豆和花生的遗传转化系统选育高油酸优异材料，为进一步选育高油酸大豆和花生品种提供基础。
具体实施例方式
以应用基因沉默技术提高花生种子油酸的含量为例1.所用材料花生材料花生品种为丰花1号、禾花1号和8130。
菌株和质粒大肠杆菌E.coli-DH5α、农杆菌LBA4404；克隆载体pGEM-Teasy，pBI121和pGLe-10。
酶和化学试剂植物基因组提取试剂盒；质粒提取试剂盒，DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，T4DNA聚合酶，CIAP小牛肠碱性磷酸化酶，pfu聚合酶和DNA ladder；抗生素(卡那霉素等)及其他生化试剂。
2.技术方法FAD2-1基因片断的克隆和表达载体构建从花生材料中制备总DNA，以此为模板进行多聚酶链式反应(PCR)。参照GeneBank中的花生FAD2-1基因(AF272950)设计两组PCR引物，引物由上海生工公司合成。
第1组引物序列为Primer1GAGCTGGAGGGCGTGTCACTAAGAT；Primer2CAAGTACAAGGGCCATCCTAGTGTG第2组引物序列为Primer1AGGGCGTGTCACTAAGATTGAAGCT；Primer2AATGGGTATGGAAGCTTGTGGAAATPCR反应体系包括10μl PCR buffer，10μl dNTP(each 2.5nmol/L)，2μl Tag酶，2μl引物(each 20nmol/μl)，2μl模板DNA，加灭菌双蒸水至100μl。基因扩增仪为PerinElmer9600型，PCR时间程序为94℃预变性3min，94℃1min，59℃1min，72℃90s，共35个循环。
将这两组PCR产物(片段1和片段2)分别连入pGEM-Teasy载体，然后进行DNA序列分析。测序结果与Genebank中序列进行同源性比较。
将片段2用EcoRI从pGEM-Teasy切下，用T4DNA聚合酶补平后反向连接到片段1所在的pGEM-Teasy的SacII位点上(平端连接法)，形成了FAD2-1基因片段的反向重复序列(片段2的序列与片段1的起始序列完全相同)。
利用种子特异表达的大豆凝集素基因启动子和终止子进行植物表达载体的构建。用载体pBI121和pGle-10重组产生的pLecSma(内含Smal酶切位点)作为卡那霉素抗性且带有大豆种子特异表达的凝集素启动子和终止子的双元载体。将构建好的FAD2-1反向重复序列用Nco1和Pst1从pGEM-Teasy释放出来，pfu聚合酶平端化，与用Smal线性化后并CIAP去磷酸化的载体pLecSma相连接，构建出表达载体pPNHO-1(见图1)。
大豆FAD2-1基因片段的克隆和载体的构建方法与花生相同，构建的表达载体为pSBHO-1(见图2)。
花生的转化和植株再生花生转化和组织培养参照Kiran Sharma&Vanamala Anjaiah(Plant Science 159(2000)7-19)方法进行。即通过三亲杂交方法将双元载体pPNHO-1导入根癌农杆菌LBA4404，用该农杆菌感染花生子叶外植体，光照下共培养三天，然后转至含有250mg/L头孢霉素的芽诱导培养基(20uMBA+10uM2，4-D+MS)上诱导丛生芽，两周后将丛生芽转至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的芽诱导培养基(20uMBA+10uM2，4-D+MS)上进行筛选，两周后再转至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的茎伸长培养基(2uMBA+MS)上，此过程约12周，待芽长至3-4厘米高时，转入无任何抗生素的生根培养基(5uMNAA+MS)，经过4周的培养，转化植株生根并长成完整小植株，经过炼苗，移栽至土壤长大并开花结实。
转基因花生的鉴定和油酸含量的测定PCR检测提取再生植株总DNA，以此为模板，用以NPTII和大豆凝聚素基因5’和3’端部分序列设计引物进行PCR反应。
NPTII基因部分序列引物Primer15-TGAGAATATCACCGGAATTG-3；Primer25-GGAAGAACAGTATGTCGAGCTA-3；大豆凝聚素启动子基因部分序列引物Primer15-CATGTGACAGATCGAAGGAA-3；Primer25-ATCTAATTATTCTATTCAGAC-3。
Southern杂交再生植株总DNA(10ug)经HindIII完全酶解后进行Southern杂交。DNA探针为大豆凝聚素启动子基因的全部序列，按TaKaRa公司随机引物标记试剂盒说明书进行标记。
T1和T2代种子油酸含量测定压榨法提取种子总油脂，甲酯化后用气相色谱法检测油酸含量。由东北师范大学测试中心和澳大利亚CSIRO植物研究所检测。
3.结果利用农杆菌介导的方法将ahFAD2-1基因的反向重复序列导入花生基因组，已在三个品种丰花1号、禾花1号和8130上获得成功，得到了100多株转化花生苗，具有良好的重复性，建立了高效的花生转化体系。
转基因花生的PCR检测采用标记基因NPTII，目的基因启动子(大豆凝聚素启动子)基因序列设计引物进行PCR检测。PCR检测结果表明，在88株检测植株中有65株为PCR阳性，扩增出了与标记基因和启动子基因序列片段相同分子量的条带，而对照植株未扩增出相应条带。
转基因花生的Southern杂交分析用目的基因启动子一大豆凝聚素启动子基因序列作为探针与转基因再生植株的DNA杂交，在PCR阳性植株当中，大部分植株的转基因真实性用Southern杂交分析所证实，含有一至多条杂交带。
T1代种子油酸含量测定压榨法提取种子总油脂，甲酯化后用气相色谱、Megabore层析柱检测油酸含量。2004年和2005年经东北师范大学分析测试中心和澳大利亚CSIRO植物研究所测定，转基因花生T1代单株种子在总油脂含量不变的条件下，对照植株油酸含量平均为40％，转基因花生东花4061(暂定名)平均为77％，其油酸含量平均比对照提高了37个百分点。
附图1为用于转化花生的载体模式图附图2为用于转化大豆的载体模式图附图3为基因沉默类型效率示意图
权利要求
1.一种应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法，其特征是(1).应用PCR方法，从大豆和花生基因组中克隆种子特异的Δ12脂肪酸脱氢酶基因片段，并根据双链RNA基因沉默原理将该基因片段构建成反向重复序列结构；(2).将大豆和花生种子特异的Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的反向重复序列基因片段构建到含有种子特异性表达的启动子和终止子的载体中；(3).通过农杆菌介导转化方法进行基因转移，组织培养和筛选工作，在其转基因后代中筛选高油酸含量的株系；(4).采用PCR和Southern blot方法检测目的基因，检测油酸含量，通过系统选育，确立高油酸含量稳定的大豆和花生材料。
2.按照权利要求1所述的应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法，其特征是FAD2-1基因片断的克隆和表达载体构建从花生材料中制备总DNA，以此为模板进行多聚酶链式反应，参照GeneBank中的花生FAD2-1基因(AF272950)设计两组PCR引物第1组引物序列为Primer1GAGCTGGAGGGCGTGTCACTAAGAT；Primer2CAAGTACAAGGGCCATCCTAGTGTG第2组引物序列为Primer1AGGGCGTGTCACTAAGATTGAAGCT；Primer2AATGGGTATGGAAGCTTGTGGAAATPCR反应体系包括10μl PCR buffer，10μl dNTP(each 2.5nmol/L)，2μl Tag酶，2μl引物(each 20nmol/μl)，2μl模板DNA，加灭菌双蒸水至100μl。基因扩增仪为PerinElmer9600型，PCR时间程序为94℃预变性3min，94℃1min，59℃1min，72℃90s，共35个循环；将这两组PCR产物片段1和片段2，分别连入pGEM-Teasy载体，然后进行DNA序列分析，测序结果与Genebank中序列进行同源性比较；将片段2用EcoRI从pGEM-Teasy切下，用T4DNA聚合酶补平后反向连接到片段1所在的pGEM-Teasy的SacII位点上，形成了FAD2-1基因片段的反向重复序列；利用种子特异表达的大豆凝集素基因启动子和终止子进行植物表达载体的构建用载体pBI121和pGle-10重组产生的pLecSma作为卡那霉素抗性且带有大豆种子特异表达的凝集素启动子和终止子的双元载体，将构建好的FAD2-1反向重复序列用Nco1和Pst1从pGEM-Teasy释放出来，pfu聚合酶平端化，与用Sma1线性化后并CIAP去磷酸化的载体pLecSma相连接，构建出表达载体pPNHO-1；大豆FAD2-1基因片段的克隆和载体的构建方法与花生相同，构建的表达载体为pSBHO-1；花生的转化和植株再生通过三亲杂交方法将双元载体pPNHO-1导入根癌农杆菌，用该农杆菌感染花生子叶外植体，光照下共培养约三天，然后转至含有250mg/L头孢霉素的芽诱导培养基上诱导丛生芽，两周后将丛生芽转至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的芽诱导培养基上进行筛选，两周后再转至含有125mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的茎伸长培养基上，此过程约12周，待芽长至3-4厘米高时，转入无任何抗生素的生根培养基，经过约4周的培养，转化植株生根并长成完整小植株，经过炼苗然后移栽至土壤。
3.按照权利要求2的应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法，其特征是所述的芽诱导培养基配方为20uMBA+10uM2，4-D+MS，茎伸长培养基为2uMBA+MS，生根培养基为5uMNAA+MS。
4 按照权利要求2的应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法，其特征是所述的花生品种为丰花1号、禾花1号和8130。
5 按照权利要求2的应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法，其特征是所述的根癌农杆菌菌种为LBA4404。
全文摘要
本发明属于植物育种领域，特别是大豆和花生品质改良的生物工程育种领域。本发明应用PCR方法，从大豆和花生基因组中克隆种子特异的基因片段，并根据基因沉默原理将该基因片段构建成反向重复序列结构；将大豆和花生种子特异基因的反向重复序列基因片段构建到含有种子特异性表达的启动子和终止子的载体中；通过农杆菌介导转化方法进行基因转移，组织培养和筛选；采用PCR和Southern blot方法检测目的基因的表达，检测油酸含量，通过系统选育，从而确立高油酸含量稳定的大豆和花生材料，改良大豆和花生品质。
文档编号A01H4/00GK1724669SQ20051001663
公开日2006年1月25日 申请日期2005年3月17日 优先权日2005年3月17日
发明者许守民, 柳青, 刘立侠, 李桂民, 宋凯, 蔡一荣, 冯凯, 李望丰 申请人:东北师范大学