专利名称：一种获得贝类杂种优势的杂交方法
技术领域：
本发明涉及通过利用杂种优势以改良皱纹盘鲍的经济数量性状的技术，具体地说是一种贝类种内远距离杂交及其杂种优势的有效利用方法，尤其是一种野生型贝类单配杂交以获得杂种优势的方法。
背景技术：
皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino是我国鲍科(Haliotidea)种类中最重要的经济种类之一。主要分布于日本列岛北部、朝鲜半岛和中国的黄海北部及渤海海峡的一部分水域。皱纹盘鲍属雌雄异体型贝类，行(？)异体体外受精，成熟个体性腺雌性为深蓝色，雄性为乳白色，繁殖期在黄渤海区为7～8月；我国比较集中的海区有辽宁省的大连市区、长海县，山东的烟台、威海和青岛市海域。皱纹盘鲍在鲍科中属中型种类，其肉质细腻柔软、口感好，是我国鲍科各种类中品质最好、价格最高、最受欢迎的种类。皱纹盘鲍也是我国两种进行规模养殖鲍科动物种类之一。
皱纹盘鲍是我国北方海区最重要的经济贝类，目前在我国黄渤海区进行养殖。但严重的病害，使皱纹盘鲍给产业造成了重大威胁。为了解决这个问题，在病因尚未查明或无法根本解决这个问题的情况下，利用“杂种优势”提高养殖对象的抗逆性和活力，可能会减轻病害损失，提高皱纹盘鲍养殖的生产力水平的重要途径。
传统的概念是只有在两个品种间或以上分类阶元间的杂交才有可能获得杂种优势，由于海洋贝类还没有人工培育的品种，因此只有物种间的交配，才算是杂交。从上个世纪三十年代，Galtsoff等(1932)就进行了美洲牡蛎和长牡蛎种间杂交受精试验，其论文在SCIENCE(76pp 371-372)发表。Davis(1950)牡蛎种间杂交研究也在SCIENCE(111pp 522)发表，这些研究的目的大多是牡蛎分类和进化有关。因为牡蛎分类问题一直是困扰分类学家们的难题，人们希望通过杂交来鉴别形态相近的牡蛎是否是相同物种的问题。到目前为止，即使是以应用为目的的研究，贝类杂交几乎全部是物种间的远缘杂交，如牡蛎(汪德耀，1952；周茂德等，1982；吕豪等，1994)，珍珠贝(魏贻尧等，1983)和扇贝(杨爱国等，2003)等。在鲍科种间杂交也有一些报道，Leighton等(1982)研究红鲍与粉红鲍、绿鲍和白鲍杂交；Hoshikawa等(1998)采用皱纹盘鲍与俄罗斯的勘察家鲍的杂交；孙振兴(1990)报道了大鲍与西氏鲍、西氏鲍与大鲍、西氏鲍与盘鲍、大鲍与盘鲍的杂交；王仁波等(1999)用红鲍与皱纹盘鲍进行杂交；柯才焕等(1999)用杂色鲍与皱纹盘鲍的杂交；王子臣、张国范等(未发表，1983)进行了皱纹盘鲍与美国红鲍和绿鲍的杂交，获得一定数量的杂交子代，但其发育参差不齐。令人遗憾的是，到目前为止这些报道还没有一例在产业上得到实际应用。
我国贝类杂交研究从上个世纪五十年代开始，开始也是牡蛎的杂交(汪德耀，1952)，此后也是一段长时间的中断，这与国际上的情况相似。到了八十年代才有人陆续开展这方面的研究(周茂德等，1982；姜卫国等，1983；吕豪等，1994；王仁波等，1999；杨爱国等，2003)。我国贝类杂交的前期工作主要是种间杂交，但这种形式的杂交大多没有得到实际的应用。
1992年张国范提出不同地理群体间杂交的思想，1993年和2002年以皱纹盘鲍为例进行了实验，中国和日本群体间的杂交F1代在2cm壳长前即已显示出杂种优势的存在。2004年张国范又提出种内杂种优势的概念，进一步提升对种内杂交及杂种优势利用的认识。
贝类种内杂种优势利用的杂交过程一般都是采用群体杂交的方式，即不同群体间多个体混交。由于皱纹盘鲍等贝类是野生型动物，多个个体混交的杂种优势率仅为单个个体间的单配杂交1/2。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、目标明确、野生型贝类单配杂交以高效获得种内杂种优势的具体操作方法。
本发明的技术方案是利用遗传距离≥0.01、遗传互补性强的经济贝类(如皱纹盘鲍)种内不同地理群体间野生型个体间进行单配杂交(不同群体的个体间单配杂交系指雌雄个体间一对一的交配，并繁殖子代以用于生产)，使F1的生长和抗性等经济数量性状得到显著改良。
杂交所用群体间的遗传距离通常为0.01-0.06；杂交所用群体的近交系数通常为0.2-0.5。
通过分子遗传学技术确定不同地理群体间的遗传距离，选择配合力0.01-0.50的组合亲本作为杂种优势利用亲本，通过单配获得种内杂种优势；其操作步骤为1)种贝的来源取几个地理分布区距离较远的群体，随机取样分析其两群体间的遗传距离，取与比较方便获得的雌性亲本群体遗传距离较远的群体(遗传距离≥0.01)为雄性亲本；如果性腺发育好，可以直接进行人工繁殖；如果不好，应在室内进行人工促熟；2)种贝促熟取壳长6～8cm的皱纹盘鲍在20℃条件下促熟，饲以大型藻类等天然饵料，积温达到800～1500℃·天，在消化腺与性腺结合部形成一明显的印痕，性腺饱满，表面有光泽，突出壳口面，雌性性腺呈深蓝色，雄性性腺呈乳白色；3)人工诱导产卵排精将经过人工促熟达性成熟的个体，皱纹盘鲍在20～23℃条件下阴干1～2小时，然后每个个体分别置于15～20L容器内，或全部雌性个体全部集中于一专用水槽内，注入升温至20～23℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；(栉孔扇贝也可如法获得高质量配子；)4)分别获得雌雄配子后进行雌雄个体1对1单个个体间的杂交授精。
所述使用种贝可以通过人工方法达性成熟，也可在自然条件下自然发育达性成熟；即杂交所用之亲贝的配子发生采用人工促熟的方法也可采用自然成熟的方法。
对雌雄种鲍的侯选者应严格进行表型甄别；壳面弧度大、波纹明显，壳表附着生物少，壳缘伸展平直锋利，呼吸孔间距较大者，壳宽/壳长0.65-0.75、足部明显突出壳缘者的个体可用作杂交亲本的侯选者；参与繁殖的亲体进行配合力，达到0.01-0.5组合留用，作为繁殖用亲本。
通过预实验对雄性个体活力进行检测，对成熟卵子受精率达到95％以上者可用于作繁殖种鲍，每个育苗场需要保有20-30个雄性种鲍，并对其进行分批促熟和人工授精。雌性种鲍的数量则依育苗场的规模而定。催产强度不宜大，如紫外线照射海水的强度应控制在500-600mwh/L以低。精卵排放后雄性种鲍要立即转移到正常的养殖环境中，保证换水、充气、投佴等，使其处于健康状态，以便重复使用。每个做种的雄鲍每次可分别为30-50个雌鲍进行单配受精；杂交用雄鲍的实际使用量为雌鲍使用量的1/30-50。
其雄性亲本一般可用非土著群体亲本，但也可以采用非土著亲本。
受精后对各单配组合的受精率、孵化率进行检测，早期面盘幼体变态率高于90％的组合保留并进一步培育，余者弃用。
本发明具有如下优点1.具有较强的可操作性强。本发明方法在分子辅助标记和配合力研究结果的指导下，选择贝类种内遗传距离相对较远的不同群体的个体进行单配杂交，以获得种内杂种优势，而且配子间适配性好，故这种杂交可操作性强，是一种具有广泛应用前景的杂种优势利用方法。
2.杂交具有高效性。本发明所获杂种优势比常规方法提高50％。本发明比群体混交的杂种优势率可提高40-50％。杂交所用群体间的遗传距离在0.04-0.06，群体内近交系数0.4-0.5，配合力0.1-0.4，单配，即可能获得种内杂种优势。如果仅用于经济杂交，杂交雄贝的使用量可为雌贝使用量的10-20％。
3.由于采用较小比例的雄贝作为杂交亲本，降低了生产成本。
本发明在分子辅助标记研究结果的指导下，选择(皱纹盘鲍)种内遗传距离相对较大、栖息环境有互补性的不同群体进行单配，以使抗性和生长势都得到改良；本发明可用于杂种优势的直接利用，也可以用于不同基因型的选择。本发明选择贝类种内遗传距离相对遗传距离较远不同群体的野生型个体间进行单配杂交，以获得更大种内杂种优势，是一种用于改良贝类经济性状的制种方法。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
取分布于日本岩手海区的雄性皱纹盘鲍20枚与中国大连长海獐子岛产雌性皱纹盘鲍150枚，经过分子遗传分析，两群体间的遗传距离为0.06，经过人工促熟达性腺成熟后即可进行人工杂交，其操作步骤为1)种贝促熟取壳长6～8cm的皱纹盘鲍在20℃条件下促熟，饲以大型藻类等天然饵料，积温达到1200℃·天，在消化腺与性腺结合部形成一明显的印痕，性腺饱满，表面有光泽，突出壳口面，雌性性腺(卵巢处)呈深蓝色，雄性性腺(精巢处)呈乳白色。
2)人工诱导产卵排精将经过人工促熟达性成熟的个体，皱纹盘鲍在20～23℃条件下阴干1～2小时，然后每个个体分别置于15～20L容器内，或全部雌性个体全部集中于一专用水槽内，注入升温至20～23℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子。
3)将催产种鲍分成A、B、C、D、E 5个组，每组4个雄鲍、30个雌鲍。每个个体各置一个严格隔离容器内进行分别催产。各组每个雄性亲鲍(共4个)的精子分别取等份混合在一起，同组内的也取4雌鲍，同取等量卵子混合，并与同组混合的精子受精，作为单配杂交的对照。各组挑选1个雄性个体分别与同组4个个体一对一杂交受精，即单配杂交。比较单配各组与混合授精组的发育、变态、生长和存活等情况。
应用例1.混合对照面盘孵化率为58.0％，变态率为63.0％，90天稚贝壳长为3.2mm，成活率为68.0％。而单配杂交组合除个别组合外普遍高于混合对照组，1-4组平均值分别为73.0％，75.5％，3.6和85.5％，稚贝成活率提高明显(表1)。
应用例2.混合对照面盘孵化率为66.0％，变态率为74.0％，90天稚贝壳长为3.2mm，成活率为65.0％。而单配杂交组合除个别组合外普遍高于混合对照组，1-4组平均值分别为74.3％，78.3％，3.8和82.5％，稚贝成活率提高明显(表2)。
应用例3.混合对照面盘孵化率为65.0％，变态率为61.0％，90天稚贝壳长为2.9mm，成活率为58％。而单配杂交组合除个别组合外普遍高于混合对照组，1-4组平均值分别为72％，65.3％，3.4和82.3％，稚贝成活率提高明显(表3)。
应用例4.混合对照面盘孵化率为65.0％，变态率为58.0％，90天稚贝壳长为3.1mm，成活率为58.0％。而单配杂交组合除个别组合外普遍高于混合对照组，1-4组平均值分别为73.0％，61.5％，3.5mm和77.0％，稚贝成活率提高明显(表4)。
应用例5.混合对照面盘孵化率为69.0％，变态率为52.0％，90天稚贝壳长为3.1mm，成活率为54.0％。而单配杂交组合除个别组合外普遍高于混合对照组，1-4组平均值分别为75.0％，58.8％，3.4mm和73.5％，稚贝成活率提高明显(表5)。
另外，凡其它贝类也为本发明所述创意思想之所及。即该种杂交方法可用于多种其它经济贝类，如栉孔扇贝、虾夷扇贝等雌雄异体型贝类和雌雄同体、但可行异体受精型贝类。
权利要求
1.一种获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于利用遗传距离≥0.01、遗传互补性强的经济贝类种内不同地理群体间野生型个体间进行单配杂交，使F1的经济数量性状得到显著改良。
2.按照权利要求1所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于杂交所用群体间的遗传距离为0.01-0.06；杂交所用群体的近交系数为0.2-0.5。
3.按照权利要求1所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于通过分子遗传学技术确定不同地理群体间的遗传距离，选择配合力0.01-0.50的组合亲本作为杂种优势利用亲本，通过单配获得种内杂种优势；其操作步骤为1)种贝的来源取几个不同海区距离较远的群体，随机取样分析其两群体间的遗传距离，取与比较方便获得的雌性亲本群体遗传距离较远的群体为雄性亲本；如果性腺发育好，可以直接进行人工繁殖；如果不好，应在室内进行人工促熟；2)种贝促熟取壳长6～8cm的皱纹盘鲍在20℃条件下促熟，饲以大型藻类等天然饵料，积温达到800～1500℃·天，在消化腺与性腺结合部形成一明显的印痕，性腺饱满，表面有光泽，突出壳口面，雌性性腺呈深蓝色，雄性性腺呈乳白色；3)人工诱导产卵排精将经过人工促熟达性成熟的个体，皱纹盘鲍在20～23℃条件下阴干1～2小时，然后每个个体分别置于15～20L容器内，或全部雌性个体全部集中于一专用水槽内，注入升温至20～23℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；4)分别获得雌雄配子后进行雌雄个体1对1单个个体间的杂交授精。
4.按照权利要求3所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于所述使用种贝可以通过人工方法达性成熟，也可在自然条件下自然发育达性成熟。
5.按照权利要求3所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于对雌雄种鲍的侯选者应严格进行表型甄别；壳面弧度大、波纹明显，壳表附着生物少，壳缘伸展平直锋利，呼吸孔间距较大者，壳宽/壳长0.65-0.75、足部明显突出壳缘者的个体可用作杂交亲本的侯选者；参与繁殖的亲体进行配合力，达到0.01-0.5组合留用，作为繁殖用亲本。
6.按照权利要求3所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于通过预实验对雄性个体活力进行检测，对成熟卵子受精率达到95％以上者可用于作繁殖种鲍，并对其进行分批促熟和人工授精。7.按照权利要求3所述的贝类杂交以获得杂种优势的方法，其特征在于每个做种的雄鲍每次可分别为30-50个雌鲍进行单配受精；杂交用雄鲍的实际使用量为雌鲍使用量的1/30-50。
7.按照权利要求3所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于其雄性亲本一般可用非土著群体亲本，但也可以采用非土著亲本。
8.按照权利要求3所述的获得贝类杂种优势的杂交方法，其特征在于受精后对各单配组合的受精率、孵化率进行检测，早期面盘幼体变态率高于90％的组合保留并进一步培育，余者弃用。
全文摘要
本发明涉及通过利用杂种优势以改良皱纹盘鲍的经济数量性状的技术，具体地说是一种贝类杂交以获得杂种优势的方法，利用遗传距离≥0.01、遗传互补性强的经济贝类种内不同地理群体间野生型个体间进行单配杂交，使F1的经济数量性状得到显著改良。本发明比群体混交的杂种优势率可提高40－50％。杂交所用群体间的遗传距离在0.04－0.06，群体内近交系数0.4－0.5，配合力0.1－0.4，单配，即有可能获得种内杂种优势，以使抗性和生长势都得到改良。
文档编号A01H1/02GK1823580SQ200510045939
公开日2006年8月30日 申请日期2005年2月25日 优先权日2005年2月25日
发明者张国范, 刘晓, 赵洪恩 申请人:中国科学院海洋研究所