专利名称：一种含银杏酸的复合杀螺剂及其制备方法
技术领域：
本发明属生物农药领域，涉及一种含有银杏酸的高效低毒的杀螺制剂，主要用于杀灭血吸虫病的唯一中间宿主—钉螺，防止血吸虫病的传播。
背景技术：
血吸虫的毛蚴侵入螺体后可以发育成母胞蚴，从而在螺体中成千上万倍地增殖，不断产生出尾蚴于水中或潮湿土表，以至感染人和其他动物，如此周而复始促成了血吸虫病的蔓延和扩散。钉螺(Oncomelania hupensis，O.hupensis)是传播我国广为流行的血吸虫病的唯一中间宿主。消灭钉螺可切断血吸虫的传播途径。所以，杀灭钉螺是国际公认的防止血吸虫病的重要措施。
血吸虫病流行于温带、亚热带、热带地区。2001年WHO估计，全球感染血吸虫病的人口约为2亿人，有6亿人口受到威胁，有76个国家受影响，其中绝大多数为发展中国家，该疾病已严重危害了这些国家人民的健康和经济发展。我国曾经对血吸虫病进行过大规模防治，使该病的流行得到有效控制。但近年来，由于某些原因，血吸虫病开始反弹。2004年我国《全国预防控制血吸虫病中长期规划纲要》中指出，现仍有7个省、110个县有血吸虫病流行，血吸虫病患者约为84.3万人。流行区总人口约为一亿人，有螺面积达3787km2。例如，湖南洞庭湖湖区几乎均有钉螺，已禁止游泳，沿湖的岳阳、常德、益阳地区均是重灾区。因此，对血吸虫病的防治成为国家可持续发展的战略目标之一。
化学灭螺仍然是消灭或减少血吸虫病感染和传播的最快捷而有效的方法之一。
迄今，使用化学合成杀螺剂是控制钉螺的主要手段。五氯酚钠曾被许多国家使用，灭螺效果好，但对非靶生物，尤其是鱼虾养殖类具广谱毒性，并造成严重的环境污染，早已被国际社会列为禁用品。氯硝柳胺(Niclosamidum)灭螺效果很好，是世界卫生组织唯一推荐使用的杀螺剂，但价格昂贵，在发展中国家大面积使用受到限制；它对鱼类等水生生物毒性大，被禁止在有水生生物的养殖水域使用，从而在应用范围上受到限制。而且，它不能有效防止钉螺的上爬，以逃逸杀伤，并还可导致靶生物的抗药性增高。
鉴于化学合成杀螺剂的弊端，国际社会对研发天然、植物来源的杀螺剂给予了极大关注。因此，研究开发灭螺效果好、成本较低、可生物降解的新型灭螺剂具有其必要性和紧迫性。中国科学院武汉植物研究曾从薯蓣植物根茎中提取制备了DZ植物杀螺剂，(中国专利号ZL97109214.1)。
银杏(Ginkgo biloba L.)是我国的珍贵树种，我国银杏资源占世界总量的70％以上。银杏叶、果均能入药。银杏叶中的银杏黄酮类和银杏内酯类对心、脑血管系统疾病具有显著的疗效，以其为主要药效成分开发成的银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)已成为国际市场上销售量最大的植物药。目前，我国对银杏叶提取物的利用除了满足国内市场的需求外，还以浸膏原料出口国外以满足国际市场的需求。
银杏酸为一类烷基或烯基酚酸类化合物，是银杏中除黄酮、内酯之外的另一类活性成分，存在于银杏叶和外种皮中。因银杏酸在口服制剂中可对机体产生致敏和细胞毒作用，在标准制剂中受到严格控制，需在提取、制备过程中加以除去。因而，以往银杏酸一直被作为废弃物丢弃。
银杏酸占银杏叶干重的1～2％，占银杏外种皮(干)的3～5％。我国年获取银杏叶浸膏量达200吨，在银杏叶浸膏量中银杏酸含量约为2.2％，即从银杏叶浸膏中去除的银杏酸总量约为4.4吨。而每年丢弃的银杏果实外种皮(干)达1.2万吨，其中含银杏酸约420吨。由此可知，每年有相当量(400余吨)的银杏酸被丢弃。对银杏酸研发，可对银杏叶和外种皮进行综合利用、变废为宝，产生巨大的社会与经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效低毒的含银杏酸的复合杀螺剂及其制备方法。本发明主要用于杀灭血吸虫病的唯一中间宿主一钉螺，防止血吸虫病的传播。
本发明银杏酸杀螺剂以银杏酸为主药，与氯硝柳胺、铜离子以及辅料按下述重量百分比的科学配伍组成复合杀螺剂，银杏酸20～50％，氯硝柳胺0.1～10％，硫酸铜0.01～1％，余为辅料。
所述的银杏酸为银杏酸总提物；氯硝柳胺为WHO认可的杀螺剂；铜离子为杀螺增效剂，其通过硫酸铜与氢氧化钠反应产生。
本发明银杏酸杀螺剂通过三种活性成分合适的制剂手段，可制成微乳剂。所述微乳剂，较为稳定，便于生产、储存、运输和使用。
包含本发明制剂配方的制剂，可以做成浓缩的液体制剂，如微乳剂、乳剂等，也可以是浓缩的固体制剂，如粉剂、颗粒剂、脂质体等。
本发明通过下述方法制备，按下述重量百分比，先将定量银杏酸总提物和氯硝柳胺用助溶剂-乙醇溶解，加入非离子型乳化剂-吐温80；另将配置好的1当量氢氧化钠加入定量硫酸铜中，制备成氢氧化铜胶体；然后通过高速乳化器将两者混合，并加入水制备成微乳剂；或，将定量氯硝柳胺可湿性粉剂直接溶于水，另用乙醇溶解定量银杏酸总提物并加入吐温80，然后通过高速乳化器将这两者与氢氧化铜胶体混合，并加入水制备成微乳剂。
银杏酸总提物20～50％，氯硝柳胺0.1～10％，硫酸铜 0.01～1％，氢氧化钠0.002～0.2％，乙醇20～70％，吐温80 1～5％，水 10～40％。
上述银杏酸总提物从银杏外种皮中提取，其中共有5个单体，其母核为水杨酸结构，苯环上有一个13、15、17烷基或烯基的侧链。
本发明按WHO“杀螺剂实验室终筛方法”中的浸泡法进行杀螺试验。结果表明，其中银杏酸杀灭钉螺的作用与氯硝柳胺相比有以下不同的特点(1)银杏酸可有效抑制钉螺的上爬，防止其逃逸杀伤；(2)银杏酸杀灭钉螺的作用起效较快，钉螺的死亡主要发生在24小时内。
对各银杏酸单体杀灭钉螺的LC50测定结果表明，其杀灭钉螺的强弱顺序为GA(13∶0)＞GA(15∶1)，GA(15∶0)＞GA(17∶1)＞GA(17∶2)。杀螺活性以前三者为主，其24小时的LC50分别为13.17mg/L，18.57mg/L，26.33mg/L，这三者在银杏酸总提物中的含量达70％左右，各银杏酸单体的协同作用，使银杏酸总提物达到较好的杀螺效果。
上述研究结果表明，其中，银杏酸主要单体化合物和银杏酸总提物杀灭钉螺的LC50在WHO所要求的杀螺剂范围内(＜100mg/L)。本发明的杀螺剂量为1～100mg/L。所使用的剂量对人类和淡水鱼类都不会产生伤害作用；其中，杀螺剂-氯硝柳胺可湿性粉剂与银杏酸的配伍，可产生协同作用，大大降低了用量，所含的氯硝柳胺剂量为10～1000ug/L。所使用的剂量降低了它对淡水鱼类的毒性，达到环保的要求，还降低了成本。
其中，杀螺增效剂-铜离子，通过与银杏酸和氯硝柳胺的配伍，可增强抑制钉螺的上爬率，提高其杀灭作用，使用剂量为1～100ppm。所使用的剂量达到经济、环保的要求。
本发明杀螺剂，按长江水产科学研究所制定的《鱼类毒性试验暂行规定》方案进行鱼毒试验，结果表明，对淡水鱼类无明显的毒性作用。
包含本发明杀螺剂配方的制剂，可临用时用水稀释至合适的浓度，喷洒于含有钉螺的水域或土壤上。可以间隔3～4天喷洒一次，以增强对钉螺的杀灭效果。
具体实施例方式
实施例11).银杏酸总提物及其单体的制备将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按1∶5的比例加入石油醚(沸程60～90℃)萃取1h，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚，得外种皮粗提物浸膏。
将浸膏用少量石油醚溶解，加样于硅胶柱上(硅胶柱为Φ32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚∶乙醚∶甲酸＝89∶11∶1(V/V/V)洗脱，以薄层层析在254 nm处出现荧光为检测指标。收集银杏酸总提物组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的银杏酸总提物组分水洗至中性，浓缩至干，得银杏酸总提物。
采用制备型C18 RP-HPLC柱与20cm载银阳离子HPLC交换柱相连用，用甲醇∶水＝93∶7(用0.1％甲酸酸化)为流动相，紫外检测波长为311nm，收集银杏酸各组分，进行冷冻干燥后，供鉴定和实验之用。
2).银杏酸总提物及其单体的鉴定上述分离制备的银杏酸总提物，经C18 RP-HPLC柱，通过Waters HPLC分析，甲醇∶水＝93∶7(用0.1％甲酸酸化)为流动相，紫外检测波长为311nm。检测图谱上无其它杂质峰，5个银杏酸单体的保留时间分别为9.6，10.4，12.0，15.5和16.5分钟，分离效果与峰型良好。上述分离制备的银杏酸单体经Agilent 1100 Series LC/MSD液质联机测定分子量，确定其结构分别为GA(13∶0)，GA(15∶1)，GA(15∶0)，GA(17∶1)，GA(17∶2)；同时，经该液质联机测定，在银杏酸总提物中各银杏酸单体的含量比例分别为17.26％，52.59％，3.04％，24.02％和3.09％。
实施例2将银杏酸总提物先用少量无水乙醇溶解，加入适当乳化剂，通过高速乳化，制备成乳剂，再用煮沸后冷却的自来水稀释至不同浓度40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、1.25mg/L(乙醇终浓度均＜0.1％)。同时，设用煮沸后冷却的自来水为空白对照，并用氯硝柳胺可湿性粉剂溶于该自来水(250ug/l)为阳性对照药。
按WHO“杀螺剂实验室终筛方法”中的浸泡法进行灭螺试验。
钉螺采自湖南岳阳血吸虫流行区。以群体逸蚴法除去阳性钉螺，在实验室培养72h。挑选螺龄为8～9旋的成螺备用。
在25ml烧杯中加30ml上述制备的不同药液(即加满至杯口)每一烧杯中放10只钉螺，杯口覆盖尼龙网，以防钉螺爬出。
对浸泡于对应液体中、盛放于水平桌面上烧杯中的钉螺，在室温(22+1℃)下，分别于5、10、15、30、60、120分钟观察并记录钉螺的上爬率和观察，并记录24h和48h时观察钉螺的死亡情况。以针刺法结合敲击法观察其活动情况，判定其是否死亡。经上述观察发现，钉螺的上爬率以1小时最有代表性，因而实验中均以1小时(1h)上爬率为观察指标。表1为银杏酸总提物浸杀钉螺和抑制钉螺上爬作用的实验结果。
表1
银杏酸总提物浸杀钉螺和抑制钉螺上爬的作用经重复试验，结果基本一致。上述结果显示，空白对照组中钉螺上爬明显，银杏酸总提物可引起钉螺上爬率呈剂量依赖性下降，与钉螺24小时的死亡率明显相关。银杏酸引起钉螺死亡的主要作用时间在24小时内。
实施例3
银杏酸总提物用少量无水乙醇溶解，加入适当乳化剂，通过高速乳化，制备成乳剂，再用煮沸后冷却的自来水稀释至不同浓度40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、1.25mg/L(乙醇终浓度均＜0.1％)。氯硝柳胺可湿性粉剂用煮沸后冷却的自来水稀释至不同浓度100ug/L、50ug/L、25ug/L、12.5ug/L、6.25ug/L、3.13ug/L。同时，用煮沸后冷却的自来水为空白对照。
按WHO“杀螺剂实验室终筛方法”中的浸泡法进行灭螺试验。
钉螺采自湖南岳阳血吸虫流行区。以群体逸蚴法除去阳性钉螺，在实验室培养72h。挑选螺龄为8～9旋的成螺备用。
在25ml烧杯中加30ml上述制备的不同药液(即加满至杯口)每一烧杯中放10只钉螺，杯口覆盖尼龙网，以防钉螺爬出。
对浸泡于对应的液体中、盛放于水平桌面上烧杯中的钉螺，在室温(22+1℃)下，观察并记录钉螺1小时的上爬率和观察并记录24h和48h时钉螺的死亡情况。以针刺法结合敲击法观察其活动情况，判定其是否死亡。表2为氯硝柳胺与银杏酸的协同作用实验结果。
表2.
从上述结果可见，随着氯硝柳胺浓度增大、银杏酸浓度减小，钉螺的上爬率未受影响；而随着氯硝柳胺浓度减小、银杏酸浓度增大，钉螺的上爬率明显降低；同时，银杏酸呈剂量依赖性提高对钉螺的死亡率。
实施例4银杏酸总提物用少量无水乙醇溶解，加入适当乳化剂，通过高速乳化，制备成微乳剂，再用煮沸后冷却的自来水稀释至不同浓度5mg/L、1.25mg/L，0.625mg/L，0.31mg/L(乙醇终浓度均＜0.1％)。氯硝柳胺可湿性粉剂用煮沸后冷却的自来水配制成10ug/L。同时，设用煮沸后冷却的自来水为空白对照。铜离子的配制采用硫酸铜与氢氧化钠反应，形成氢氧化铜胶体溶液，再经稀释后加入银杏酸与氯硝柳胺的混合液中，制成微乳剂，备用。
按WHO“杀螺剂实验室终筛方法”中的浸泡法进行灭螺试验。
钉螺采自湖南岳阳血吸虫流行区。以群体逸蚴法除去阳性钉螺，在实验室培养72h。
挑选螺龄为8～9旋的成螺备用。
在25ml烧杯中加30ml上述制备的不同药液(即加满至杯口)每一烧杯中放10只钉螺，杯口覆盖尼龙网，以防钉螺爬出。
对浸泡于对应的液体中、盛放于水平桌面上烧杯中的钉螺，在室温(22+1℃)下，观察并记录钉螺1小时的上爬率和观察并记录12h钉螺的死亡情况。以针刺法结合敲击法观察其活动情况，判定其是否死亡。表3本发明制剂中铜离子对银杏酸与氯硝柳胺杀灭钉螺作用的增效作用。
表3
从上述结果可见，铜离子的加入可有效减低钉螺的上爬率和提高钉螺12小时内的死亡率，起到很好的增效作用。
实施例5将定量银杏酸总提物和氯硝柳胺用助溶剂-乙醇溶解，用量为银杏酸总提物和氯硝柳胺的两倍，加入非离子型乳化剂-吐温80(乙醇用量的1/10)；另将配置好的1当量氢氧化钠加入定量硫酸铜中，制备成氢氧化铜胶体并稀释成不同的浓度；然后通过高速乳化器将两者混合，并加入水制备成微乳剂。
同时，设用煮沸后冷却的自来水为空白对照。
按WHO“杀螺剂实验室终筛方法”中的浸泡法进行灭螺试验。
钉螺采自湖南岳阳血吸虫流行区。以群体逸蚴法除去阳性钉螺，在实验室培养72h。
挑选螺龄为8～9旋的成螺备用。
在25ml烧杯中加30ml上述制备的不同药液(即加满至杯口)每一烧杯中放10只钉螺，杯口覆盖尼龙网，以防钉螺爬出。
对浸泡于对应的液体中、盛放于水平桌面上烧杯中的钉螺，在室温(22+1℃)下，观察并记录钉螺1小时的上爬率和观察并记录12h钉螺的死亡情况。以针刺法结合敲击法观察其活动情况，判定其是否死亡。表4显示本发明制剂中铜离子对银杏酸与氯硝柳胺杀灭钉螺作用的增效作用。
表4
从上述结果可见，铜离子的加入可有效减低钉螺的上爬率和提高钉螺12小时内的死亡率，起到很好的增效作用。
实施例6按上法配制含有银杏酸(5mg/L)、氯硝柳胺(50ug/L)、铜离子(6ppm)的微乳剂4000mL。从中取50mL供培养钉螺之用。其余用于养殖淡水鱼-红鲤鱼(观赏用)。按长江水产科学研究所制定的《鱼类毒性试验暂行规定》方案进行鱼毒试验。
钉螺采自湖南岳阳血吸虫流行区。以群体逸蚴法除去阳性钉螺，在实验室培养72h。挑选螺龄为8～9旋的成螺备用。在25ml烧杯中加30ml上述药液(即加满至杯口)，放入10只钉螺，杯口覆盖尼龙网，以防钉螺爬出。对浸泡于对应的液体中、盛放于水平桌面上烧杯中的钉螺，在室温(22+1℃)下，观察并记录24h钉螺的死亡情况。以针刺法结合敲击法观察其活动情况，判定其是否死亡。
取10条红鲤鱼(身长7～8cm)放入上述配制的溶液中，按常规饲养，水温20℃，观察72小时，记录红鲤鱼的死亡情况。
实验结果显示，在本发明杀螺剂的溶液中，24小时钉螺全部死亡，而所养殖的红鲤鱼全部存活。表明本杀螺剂高效低毒。
权利要求
1.一种含银杏酸的复合杀螺剂，其特征是以银杏酸为主药，与氯硝柳胺、铜离子以及辅料，按下述重量百分比组成银杏酸20～50％，氯硝柳胺0.1～10％，硫酸铜0.01～1％，余为辅料。
2.按权利要求1所述的含银杏酸的复合杀螺剂，其特征是所述的银杏酸为银杏酸总提物，其中有5个单体，其母核为水杨酸结构，苯环上有一个13、15、17烷基或烯基的侧链；所述的铜离子通过硫酸铜与氢氧化钠反应产生。
3.按权利要求1或2所述的含银杏酸的复合杀螺剂，其特征是所述的复合杀螺剂制成浓缩的液体制剂，包括微乳剂或乳剂。
4.按权利要求1或2或3所述的含银杏酸的复合杀螺剂的制备方法，其特征是包括下述步骤按下述重量百分比，先将定量银杏酸总提物和氯硝柳胺用助溶剂-乙醇溶解，加入非离子型乳化剂-吐温80；将配置好的1当量氢氧化钠加入定量硫酸铜中，制备成氢氧化铜胶体；然后通过高速乳化器将两者混合，并加入水制备成微乳剂；或，将定量氯硝柳胺可湿性粉剂直接溶于水，另用乙醇溶解定量银杏酸总提物并加入吐温80，然后通过高速乳化器将这两者与氢氧化铜胶体混合，并加入水制备成微乳剂，银杏酸总提物20～50％氯硝柳胺0.1～10％硫酸铜0.01～1％氢氧化钠0.002～0.2％乙醇20～70％吐温801～5％水10～40％。
5.按权利要求1或2所述的含银杏酸的复合杀螺剂，其特征是所述的复合杀螺剂还制成浓缩的固体制剂，包括粉剂、颗粒剂或脂质体。
全文摘要
本发明属生物农药领域，涉及一种含有银杏酸的高效低毒的杀螺制剂，本发明以银杏酸为主药，与氯硝柳胺、铜离子以及辅料科学配伍组成复合杀螺剂，用于杀灭血吸虫病的唯一中间宿主—钉螺，防止血吸虫病的传播。经杀螺试验，结果表明，可有效抑制钉螺上爬，防止其逃逸杀伤；杀灭作用起效较快，钉螺在24小时内死亡，所使用剂量对人类不产生伤害作用；对淡水鱼类无明显的毒性作用，在高效杀灭钉螺的同时，降低了毒性及成本，实现了“高效、低毒、环保、经济”的要求。本发明可制成浓缩的液体制剂或固体制剂，便于生产、储存、运输和使用。
文档编号A01N37/06GK101088339SQ20061002760
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者潘家祜, 毛佐华, 俞培忠 申请人:复旦大学