专利名称：利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法
技术领域：
本发明涉及一种西瓜四倍体诱导技术，尤其是利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法。
背景技术：
西瓜是世界十大水果之一，因其多汁、风味浓而受到消费者喜爱。西瓜栽培面积大，在热带和亚热带地区都有广泛栽培；然而西瓜种质资源的遗传背景比较狭窄，因此采用新的技术方法获得更多的种质资源非常必要。三倍体无籽西瓜由于其良好的果实品质更受消费者青睐，有着巨大的商业潜力。三倍体西瓜的获得是通过常规二倍体与四倍体杂交而来，三倍体西瓜的生产受许多因素限制，其中一个原因就是四倍体的生产效率低。获得四倍体的传统方法是用诱变剂处理活体植株，活体诱导处理部位可为种子、幼苗茎尖、幼苗生长点等，诱变率一般在0.1％-3％，如秋水仙碱处理子叶期的西瓜幼苗，获得的四倍体频率低(1％-3％)(Nongkarn-Fongrin等，1993)，且嵌合率高(36％-75％)(McCuistion，1993)。因为传统的活体诱导处理方法具有诱变率低、嵌合率高、且获得的四倍体植株稔性低、不易获得大量四倍体个体等缺陷；而采用离体培养过程中应用诱变剂的诱导技术能够克服活体诱导技术的缺点，因此人们开始更多的使用离体培养的诱导技术。在植物倍性诱导过程中，秋水仙碱是一种常用的诱变剂，在多种植物上普遍应用(James F.Hancock，1997)，许多研究者利用它进行了离体培养染色体加倍研究(Giirel等，2000；Zhang等，1995；Li-Ying等，1999；Gmitter等，1991)。除草剂在植物倍性的研究过程中，具有多倍化程度高，药害轻等特点，也被用来做诱变剂(VanTuyl JM等，1992)。“欧拉灵”(Oryzalin)是一种二苯基胺类除草剂，对植物微管蛋白有更高的亲和性，低浓度条件下具有更高的微管蛋白解聚能力。诱变剂处理会对培养材料产生毒害性，在除草剂“欧拉灵”处理之前，将材料放在不含除草剂“欧拉灵”的培养基上预培养一段时间，再转入除草剂“欧拉灵”培养基处理，这样可提高材料对除草剂“欧拉灵”的抗毒害性，同时还能提高染色体加倍率(Hansen-AL，2000)。
到目前为止，尚无利用除草剂“欧拉灵”离体高效诱导西瓜四倍体技术的发明。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种获得四倍体频率高的利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，是依次包括以下步骤1)、选用4天苗龄的西瓜子叶近胚轴端作为外植体；2)、将上述外植体在增植培养基上预培养4.5～5.5天；该增植培养基是按照每升MS基本培养基内加入2毫克6-苄基氨基瞟岭(BA)、0.5毫克吲哚乙酸(IAA)、30克蔗糖和7克琼脂的比例，并调节pH值为5.8所制成的；3)、将上述预培养后的外植体浸泡在液体诱导培养基中，在恒温振荡器上震荡后，于黑暗条件下处理11～13小时；该液体诱导培养基是按照每升MS基本培养基内加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和400毫克欧拉灵除草剂的比例，并调节pH值为5.8所制成的；4)、将上述处理完毕的外植体用无菌水冲洗干净后，转移到增植培养基上培养，培养25天后获得再生芽；5)、将上述再生芽依次进行生根培养、开瓶练苗和移栽温室，从而获得四倍体的西瓜再生植株。
作为本发明的利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法的改进所述步骤2)中预培养时间为5天。步骤3)是在28℃、每分钟150转的恒温振荡器上震荡，且处理时间为12小时。
本发明的步骤1)中所使用的4天苗龄的西瓜子叶近胚轴端作为外植体，是通过如下方法获得的将饱满的西瓜种子浸入蒸馏水浸泡6h后，小心去壳，用浓度为10％的次氯酸钠溶液消毒10min，期间不停振摇，无菌水反复冲洗后接种于MS发芽培养基，于培养箱内28℃黑暗培养，待胚根露出2-3mm时再转移到培养室内培养。然后选用4天苗龄子叶近胚轴端5×5mm小块(带1mm下胚轴)作为外植体。该MS发芽培养基是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖和7克琼脂的比例，并调节pH值为5.8所制成的。
本发明的步骤5)具体内容如下将步骤4)所得的再生芽转移到MS生根培养基上培养，生根15天后，开瓶练苗2天，小心洗去根部的MS生根培养基，然后移栽到装有蛭石的营养钵中，浇灌营养液。用塑料薄膜将营养钵遮住，以减少水分蒸发，并通风透气，4天后揭去薄膜。移入培养室在有散射光的室内培养5天，然后移栽到温室培养，就可获得四倍体的西瓜再生植株。所用的MS生根培养基是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、6克琼脂和0.1毫克萘乙酸(NAA)的比例，并调节pH值为5.8所制成的。
本发明中使用的所有培养基均用1mol/L的NAOH或HCL调节pH值至5.8，在121～126℃之间恒温灭菌20min。MS基本培养基为Murashige and Skoog1962年发明的植物组织基本培养基。BA代表6-苄基氨基瞟岭，NAA代表萘乙酸，IAA代表吲哚乙酸。
本发明的利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，利用诱变剂“欧拉灵”除草剂溶液处理诱导西瓜离体条件下的子叶，使染色体变异加倍；还确定了诱变剂的浓度、处理时间、处理方式及预培养试验对四倍体离体诱导的影响。因此采用本发明的方法，四倍体的诱导频率能达到85.6％；能克服传统方法中诱导频率低的缺点，为创制优良西瓜种质奠定基础。
图1是西瓜子叶外植体(近胚轴端带1mm的下胚轴)的示意图；图2是再生芽的示意图；图3是再生苗生根示意图；图4是再生苗定植示意图；图5是四倍体染色体鉴定图。
具体实施例方式
实施例1、利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，依次进行以下步骤1)、制作外植体将饱满的西瓜种子浸入蒸馏水浸泡6h后，小心去壳，用浓度为10％的次氯酸钠溶液消毒10min，期间不停振摇，无菌水反复冲洗后接种于MS发芽培养基，于培养箱内28℃黑暗培养，待胚根露出2-3mm时再转移到培养室内培养。然后选用4天苗龄子叶近胚轴端5×5mm小块(带1mm下胚轴)作为外植体，该外植体的形状如图1所示。所用的MS发芽培养基是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖和7克琼脂的比例，并调节pH值为5.8所制成的。
2)、将上述外植体在增植培养基上预培养5天；增植培养基是按照每升MS基本培养基内加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和7克琼脂的比例，并调节pH值为5.8所制成的。
3)、将上述预培养后的外植体浸泡在液体诱导培养基中，在28℃、每分钟150转的恒温振荡器上震荡后，于黑暗条件下处理12小时；液体诱导培养基是按照每升MS基本培养基内加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和400毫克欧拉灵除草剂的比例，并调节pH值为5.8所制成的。
4)、将上述处理完毕的外植体用无菌水冲洗干净后，转移到增植培养基上培养，培养25天后获得再生芽；该再生芽的形状如图2所示。所用的增植培养基同步骤2)中的增植培养基，培养室培养条件设定为白天温度25-27℃，夜间温度18-20℃，16/8h光周期，光照强度3000勒克司(lx)。
5)、将上述25天后的再生芽转移到MS生根培养基上培养，生根15天后(如图3所示)，开瓶练苗2天，小心洗去根部的MS生根培养基，然后移栽到装有蛭石的营养钵中，浇灌营养液。用塑料薄膜将营养钵遮住，以减少水分蒸发，并通风透气，4天后揭去薄膜。移入培养室在有散射光的室内培养5天，然后移栽到温室培养(如图4所示)，就可获得四倍体的西瓜再生植株。所用的MS生根培养基是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、6克琼脂和0.1毫克NAA的比例，并调节pH值为5.8所制成的。
实施例2、对上述西瓜再生植株进行四倍体的鉴定
早上8:00～9:00取上述西瓜再生植株的幼嫩根尖1～2cm作为材料，0.002M 8-羟基喹啉20℃处理2小时，乙醇洗涤，乙醇∶冰醋酸(体积比3∶1)固定液20℃固定12小时，用纯酒精洗涤2～3次直至材料不含冰醋酸的味道，再用蒸馏水洗涤，用1mol/L盐酸保持45℃解离30分钟，蒸馏水洗涤，卡宝品红染色，置于显微镜下观察，各取30个染色体清晰的细胞进行染色体计数，四倍体染色体鉴定图如图5所示。结论为采用本发明方法可以获得高频率的四倍体西瓜再生植株。
所有上述实验过程中所用到的试剂为植物组织培养过程中的基本试剂，均可购自Sigma和上海生工生物工程有限公司。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，其特征是依次包括以下步骤1)、选用4天苗龄的西瓜子叶近胚轴端作为外植体；2)、将上述外植体在增植培养基上预培养4.5～5.5天；所述增植培养基是按照每升MS基本培养基内加入2毫克6-苄基氨基瞟岭、0.5毫克吲哚乙酸、30克蔗糖和7克琼脂的比例，并调节pH值为5.8所制成的；3)、将上述预培养后的外植体浸泡在液体诱导培养基中，在恒温振荡器上震荡后，于黑暗条件下处理11～13小时；所述液体诱导培养基是按照每升MS基本培养基内加入2毫克6-苄基氨基瞟岭、0.5毫克吲哚乙酸、30克蔗糖和400毫克欧拉灵除草剂的比例，并调节pH值为5.8所制成的；4)、将上述处理完毕的外植体用无菌水冲洗干净后，转移到增植培养基上培养，培养25天后获得再生芽；5)、将上述再生芽依次进行生根培养、开瓶练苗和移栽温室，从而获得四倍体的西瓜再生植株。
2.根据权利要求1所述的利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，其特征是所述步骤3)是在28℃、每分钟150转的恒温振荡器上震荡。
3.根据权利要求2所述的利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，其特征是所述步骤2)中预培养时间为5天。
4.根据权利要求2或3所述的利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，其特征是所述步骤3)中处理时间为12小时。
全文摘要
本发明公开了一种利用欧拉灵除草剂离体诱导西瓜四倍体的方法，依次包括以下步骤1)选用4天苗龄的西瓜子叶近胚轴端作为外植体；2)将外植体在增植培养基上预培养4.5～5.5天；3)将预培养后的外植体浸泡在液体诱导培养基中，在恒温振荡器上震荡后，于黑暗条件下处理11～13小时；4)将处理完毕的外植体用无菌水冲洗干净后，转移到增植培养基上培养，培养25天后获得再生芽；5)将再生芽依次进行生根培养、开瓶练苗和移栽温室，从而获得四倍体的西瓜再生植株。采用本发明方法可以获得高频率的四倍体西瓜再生植株。
文档编号A01P21/00GK1826888SQ20061004959
公开日2006年9月6日 申请日期2006年2月24日 优先权日2006年2月24日
发明者张明方, 张全美, 杨景华, 齐晓花 申请人:浙江大学