专利名称：防治温室蔬菜疫病的菌株px35的制作方法
技术领域：
本发明涉及防治温室蔬菜疫病的单一菌株，属于农作物防病治病技术领域，专用于蔬菜疫病的无公害防治。
二、技术背景目前我国保护地蔬菜的种植面积不断扩大，由于保护地内温湿条件适宜疫霉的生长，再加上同一品种的连作，造成疫病逐年加重。目前对蔬菜疫病的药剂防治主要还是使用化学农药，如乙磷铝、甲霜灵、普力克、阿米西达等。但是，使用化学农药不仅会产生农药残留，而且随着化学农药的逐年使用疫霉菌的抗药性也在逐渐增加，如美国密歇根州已经出现了对Ridmil gold有抗性的辣椒疫霉菌株，并且研究发现当一个菌株对Ridmil gold产生抗药性同时不会丧失原有的其他特性。(M.HausbeckR.Fulbright and R.Hammerschmidt.An integrated approach to manage phytophthora blighton Michigans vine crops.)。为此菜农只能加大农药的使用量，由此，农药使用和依赖程度呈现出恶性循环状态。农药的大量使用，使得蔬菜中农药残留量超标问题突出。2000年5月份农业部农药检定所组织北京、上海、重庆、山东和浙江等5省市的农药检定所，对50个蔬菜品种，1293个样品的农药残留进行抽样检测，农药残留量超标率达30％，残留浓度高者为允许残留量的几倍甚至几十倍。蔬菜中农药残留量的严重超标，导致中毒事故时有发生。据卫生部统计数字，1999年我国由于农药残留引起的食品店菜性食物中毒菜有37起，急性中毒的例子，还能引起我们的重视，而慢性中毒和蓄积性中毒的情况我们就不得而知，其实其结果会更加可怕。我国出口到日本、韩国等发达国家的蔬菜经常因为农药残留达不到他们的标准而被退回，这给许多菜农造成很大损失。为此应该大力推广种植无公害蔬菜，规范生产标准，尽量减少化学农药的用量。
无公害蔬菜早已成为世界蔬菜生产的主流。早在20世纪20年代，国外就开始发展无公害蔬菜，其主要生产方式是无土栽培。据不完全统计，世界上单用营养液膜法(NFT)栽培无公害蔬菜的国家就达76个。在新西兰，半数以上的番茄、黄瓜等果菜类蔬菜是无土栽培的。日本、荷兰、美国等发达国家，采用现代化的水培温室，常年生产无公害蔬菜。我国无公害蔬菜的研究和生产始于1982年，该年召开全国生物防治会议，江苏省率先提出用生物防治代替化学农药防治。1983年，在全国植保总站的大力支持下，全国23个省、市开展了无公害蔬菜的研究、示范与推广工作。通过几年的研究实践，探索出一套综合防治病虫害、减少农药污染的无公害蔬菜生产术。1985年全国推广无公害蔬菜生产面积4万hm2(60万亩)，至今全国各地几乎每个市都有无公害蔬菜生产基地。期间，开发了一些成功的生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。但尚未出现对疫病有较高防效的生防菌株。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，
公开日2002年7月17日)方法，菌体可室温保存2～3年。
发明内容
技术问题 针对温室疫病没有有较高防效的生防菌株制剂现状，提供开发一种防治蔬菜疫病的单一菌株，专用于防治辣椒、番茄、黄瓜等温室蔬菜疫病，菌株的防效高，并且有增产功能。
技术方案防治温室蔬菜疫病的菌株PX35，为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，于2007年01月26日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.1930。PX35在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，G+，产生芽孢。菌株PX35可分泌产纤维素酶、蛋白酶酶活性和产嗜铁素，对疫病生防有重要意义。
将上述防治温室蔬菜疫病的菌株PX35在PDA培养液37℃180rpm振荡培养20～24h，然后6000rpm离心10min，取PX35湿菌与菌体保藏液(本实验室的菌体保藏液专利，公开专利号CN1358838，
公开日2002年7月17日)按质量体积比为1∶40配成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。所用PDA培养液配制方法为用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。
有益效果本发明与现有蔬菜疫病防治技术相比，其优点和积极效果表现在本发明是专门针对蔬菜疫病开发的生防菌株，因而在防治蔬菜疫病方面与目前其他广谱生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治疫病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。同时，PX35菌株制剂还有增产功能，可为农民增加收入。
PX35菌株用湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，
公开日2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌剂，可室温保存2～3年。
PX35菌株制剂可以在温室移栽前，喷在有有机肥的田块，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，菌株通过多种生防机制起作用，从而达到防治疫病的效果。
试验表明，使用PX35菌株制剂对蔬菜疫病的平均防治效果防效为75～90％，病田增产30～96％，在无病田亦能取得10％左右的增产效果。
四
图1温室试验中PX35菌剂处理10天后对辣椒疫病的防治和促生效果图2PX35菌剂处理60天后对田间辣椒疫病的防治效果(江苏淮安，2006)五具体实施方式
1菌株的分离和鉴定一种防治温室蔬菜疫病(Phytophthora capsici)生防菌株PX35，专用于防治辣椒、番茄、黄瓜等温室蔬菜疫病。发明人从辣椒疫病的发病田中，采集了辣椒病健株，从根围、根内、叶围、叶内中分离到了1484个菌株，从中筛选出1株对辣椒疫病生防效果好的菌株，其编号为PX35。对PX35菌株的产纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶活性和产嗜铁素测定进行了研究，并对其进行了温室和大田防效研究，发现PX35菌株制剂有很好的防病增产效果，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。
PX35菌株为Bacillus sp.；PX35在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，G+，产生芽孢。PX35菌株可分泌产纤维素酶、蛋白酶活性和产嗜铁素，对疫病生防有重要意义。
2温室防效实验PX35菌剂制备平板活化PX35菌株，挑单菌落接种到5ml的LB培养液(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％ NaCl，pH 7.2)，37℃，180rmp振荡20h，转接到500ml的LB培养液中，37℃，180rmp振荡24h。将摇好的菌体悬浮液6000g离心10min，收集菌体，用无菌水配制108cfu/ml拮抗菌悬浮液。
病原菌制备致病菌株Phytophthora capsici CA1(王源超，丁国云，马志超，等。棉花疫霉菌和辣椒疫病菌核糖体基因ITS区域的克隆和序列分析，南京农业大学学报，2000，23(3)33-36)在V8培养基(郑小波.疫霉菌及其研究技术[M].北京中国农业出版社，1997)上，25℃培养3d，切4mm*4mm的菌丝块转接到V8培养液中，每100ml 10～12块，25℃培养3d，倒掉培养液，换无菌自来水，每12h换一次，换3～4次，在显微镜下观察到大量的游动孢子囊时，4℃冷激1～2h，刺激游动孢子产生。收集孢子液，用血球计数板计数，将孢子液调整到1*105个游动孢子/ml备用。
准备辣椒幼苗基质育苗，25℃16/8h光周期，苗长到3～4片真叶(30d左右)移栽。
将辣椒幼苗移栽入装满基质的盆钵(直径70mm，高90mm)中，每钵三株，置于16/8h光周期温室，两天后PX35菌剂灌根，每钵50ml，灌根两天后接病原菌，在幼苗茎基部接种2ml疫霉游动孢子悬浮液(105游动孢子/ml)。对照浇2ml无菌水。接PX35菌剂30d后统计病情，病情分级0-5级0级无症状；1级叶片轻微萎蔫，茎上开始出现褐色斑点；2级整个植株的30-50％有病状；3级整个植株的50-70％有病状；4级整个植株的70-90％有病状；5级整株死亡。每个处理18株苗，重复3次。与此同时，把每个处理的6株苗连根拔起，洗净晾干，分别统计鲜重，干重，增加生物量，根长，茎长。
苗期盆栽试验结果表明(表1，图1)，只接种辣椒疫霉对照组的发病率达72.2％，PX35菌剂处理的发病率为11.8％，PX35的防治效果达到83.5％。PX35菌剂能促进辣椒生长，与对照相比生物量增加了42.63％，根、茎长也有一定的增长。
表1 生防菌PX35制剂施用后30天对辣椒疫病的盆栽防效
注1.表中鲜重、根长、茎长数据为Mean±SE2.防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数*100％3.增加生物量(％)＝(处理组鲜重-对照组鲜重)/对照组鲜重*100％4.实验共重复三次。
3田间实际应用实验PX35菌剂制备将PX35菌株在PDA培养液37℃180rpm振荡培养20～24h，然后6000rpm离心10min，取湿菌与本实验室的菌体保藏液(公开专利号CN1358838，
公开日2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。
PDA培养液配制方法用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，然后121℃灭菌20min。
用上述方法所得的菌剂在2005、2006年在江苏淮安进行田间疫病防效试验示范。在作物移栽前喷雾使用，也可以做成堆肥使用，或稀释后在移栽时灌根使用。田间实验表明(表2、3，图2)，作物移栽前喷雾使用，辣椒苗移栽后60d，PX35菌剂处理组的发病率分别为3.08％，6.2％，防效为75.81％，89.8％。，增产率分别为40.00％和95.90％，PX35菌剂的增产率与代森锰锌处理组有显著差异。
表2 生防菌PX35菌剂对辣椒疫病的田间生防效果(江苏淮安，2005)
注同列数据后标不同小写字母者表示在5％水平上差异显著。
表3 生防菌PX35菌剂对田间辣椒疫病的防病及增产效果(江苏淮安，2006)
注同列数据后标不同小写字母者表示在5％水平上差异显著(P＜0.05)。
权利要求
1.一种防治温室蔬菜疫病的菌株PX35，菌株PX35为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，于2007年01月26日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1930。
2.权利要求1所述防治温室蔬菜疫病的菌株PX35在防治温室蔬菜疫病方面的应用。
3.用权利要求1所述防治温室蔬菜疫病的菌株PX35制备的生防菌剂。
4.用权利要求1所述防治温室蔬菜疫病的菌株PX35制备生防菌剂的方法，其特征在于将权利要求1所述防治温室蔬菜疫病的菌株PX35在PDA培养液37℃180rpm振荡培养20～24h，然后6000rpm离心10min，取PX35湿菌与菌体保藏液按质量体积比为1∶40配成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。
5.根据权利要求4所述的用菌株PX35制备生防菌剂的方法，其特征在于，所用PDA培养液配制方法为用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。
6.权利要求3所述生防菌剂在防治温室蔬菜疫病方面的应用。
全文摘要
一种防治温室蔬菜疫病(Phytophthora capsici)生防菌株PX35，属于农作物防病治病技术领域，专用于防治辣椒、番茄、黄瓜等温室蔬菜疫病。PX35经鉴定为Bacillussp.，在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，G
文档编号A01N63/02GK101063093SQ20071002128
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月26日 优先权日2007年4月26日
发明者郭坚华, 徐刘平 申请人:南京农业大学