专利名称：：一种诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥及其应用，属生物
技术领域：
。
背景技术：
：长期以来烟草种植受许多真菌病、病毒病、细菌病、线虫病危害，由疫霉菌(寄生疫霉烟草变种)引起的黑胫病、链格孢菌引起的赤星病、根结线虫引起的线虫病等都很常见。烟草病害的控制主要依赖于抗病品种和化学农药，目前，生产上还没有的对这些病害免疫或高抗的烟草品种育成，例如红花大金元等烟草优良品种也因为病害的原因大面积减产，但转基因烟草的应用由于安全顾虑，并未商品化，因此化学农药的使用仍然是云南烟叶病害控制的最主要措施。长期的农药加化肥生产模式使得土壤板结严重，土壤中有机质含量、保水能力下降明显，地下水化肥渗入污染严重，病害发生频繁，烟叶品质也有所下降，烟叶生产的最适宜的优质耕作土地面积逐渐縮小，不利于烟叶生产的可持续发展。这些问题在一定程度上代表了国内烟叶生产上存在的问题。提高土壤肥力、减少土壤污染的综合技术；基本植烟土壤质量保持和调控关键技术研究；烟叶无公害生产技术研究与开发应用；烟叶无公害综合生产技术集成与推广；烟草有害生物的综合、高效、持久、安全治理技术研究与应用等都己经列入了国家重点支持研究的领域。随着科学技术的进步，各国农业科学家普遍认为，肥料要向高效、复合的方向发展，即应寻求一种新型肥料，不仅将氮、磷、钾及微量元素配合使用，而且要将化肥和有机肥结合起来，发挥整体优势，以建立良性农田生态循环体系和作物营养综合体系，充分利用土壤潜力，达到使作物增产增收最佳效果。目前，世界各国都在借助高科技手段，寻求新的肥源，其中有机无机肥料是研究的重点。国内外纷纷开展针对目标作物的生长习性的有机无机复混肥，这样在提供全面、均衡营养的同时，增加土壤有机质含量，提供土壤微生物正常生长所需的环境，提高土壤营养成分的利用率。植物诱导抗病性也称系统抗病性，是指经诱导物处理后，植物体本身产生的^t多种有害病原菌抗性，而非专一抗性的现象，植物体内未直接接触诱导物的部位也被诱导表达PRs蛋白(病程相关蛋白，Pathogenesisrelatedproteins)是其最重要的生理指标。植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间长和利用安全方便等特点，被认为是植物病害防治的一种新途径、新技术，目前已成为国际上重要的农业研究领域。为使植物诱导抗病性应用于农业生产，近20多年来国际上研究筛选有效的抗病诱导物，特别是能商业化生产的化学药剂，迄今已发现2，6-二氯异烟酸(INA)、苯并噻唑类制剂(BTH)和氨基丁酸(BABA)等化合物可诱导作物产生对黄萎病、枯萎病及叶斑病的抗性，其中苯并噻唑类制剂(BTH)己开始商业化生产；但因该诱导物为化学制剂，对多数农作物有药害，因此开发效果一般。而开发活的微生物作为诱导物虽可避免这个问题，但实际应用效果常常受到环境条件的影响，而且诱导物的制备工序复杂，成本较高，开发难度也很大。目前，研究开发无污染、施用安全的生物制剂是该领域的热点，我们曾利用青霉素发酵的工业废弃物开发了一种诱导植物表达病程相关蛋白的有机肥(专利授权号zl20051(K)10824.8)，它同时具备良好肥效，又可诱导植物产生系统抗病性。将这种可以诱导植物表达病程相关蛋白的工业废弃物添加到复混肥中，同时根据烟草的生理特点和生产实际需要，设计复混肥中的N、P、K比例，以适应烟草这种喜钾作物的生长需求，开发可以诱导烟草病程相关蛋白基因表达，从而诱导产生系统抗病性的专用型有机、无机复混肥。使得该肥在提供烟草正常生长营养需求的同时还可以提高烟草的抗病能力，这不但具有良好的开发应用前景，还对于烟草生产的可持续发展具有积极意义。参考文献1.Huges，D.W.andGalau,A.G.(1988)，PreparationofRNAfromcottonleavesandpollen.PlantMol.Bio.R印.6:253-2572.MelissaK.Hill,LyonKarinJ.,LyonBruceR.(1999)IdentificationofdiseaseresponsegenesexpressedinGossypiumhirsutumuponinfectionwiththewiltpathogenVerticilliumdahliae.PlantMolecularBiology,40:289-2963.SambrookJ,RussellDW(2001)Molecularcloning:alaboratorymanual.3rdedn..ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork
发明内容本发明的目的在于通过对可诱导植物系统表达PRs蛋白的灭活青霉素生产残渣的研究，充分考虑烟草生长的实际需求，开发一种诱导烟草植物产生系统抗病性的烟草专用有机无机复混肥。本发明的诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥，该有机无机复混肥成分的质量百分比为该有机无机复混肥成分的质虽W分比为有机质含虽2128'《，全N7.79.4%,P4.37%禾llK1215%，jt他47.648.2%，该有机无机复混肥由下列步骤制成；(1)褐煤预处理，将商品褐煤加热至20030(TC烘干；(2)有机预混料制备预处理褐煤后，按照干燥褐煤蚕粪废渣510:15:1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料;利用预处理褐煤的热量保持混合物85°C以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素；(3)有机无机复混肥的料制备按硝铵磷肥:硫酸钾磷酸一铵:钙镁磷肥硫酸亚铁有机预混料2428:2430:510:46:00.5:25.743的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，即得粒径3-6mm的到诱导植物产生系统抗病性的烟草专用有机无机复混肥。本发明的诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥，以基肥、追肥的形式施用，作为诱导烟草表达病程相关蛋白从而产生抗病性及提供生长营养需求的应用。本发明具有效果佳、有广泛应用领域等优点，特别适应于喜钾肥的烟草及其它无公害种植的需要及大量农药才能控制病害的作物。本发明是这样实现的一、有机活性诱导剂的制备(1)褐煤预处理，将商品褐煤加热至20030(TC烘干。(2)有机预混料制备预处理褐煤后，按照干燥褐煤蚕粪废渣510:15:1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料;利用预处理褐煤的热量保持混合物85C以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素。(3)有机无机复混肥的料制备按硝铵磷肥:硫酸钾磷酸一铵:钙镁磷肥硫酸亚铁有机预混料2428:2430:510:46:00.5:25.743的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，即得到粒径为3-6mm诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥。(4)将制备的样品按常规标准检测，成分的质量百分比为该有机无机复混肥成分的质虽n分比为有机质含虽:2128%，全N7.79,1。/。，P4.370/。和K12l5%，其他47.648.2%。二、烟草诱导抗病性试验1、病原菌的拮抗实验烟草赤星病病原菌(97008、97009)、烟草青枯病病原菌Tb-23、烟草黑胫病菌98Pn009的菌株在PSA平板上活化8天后，向平板内倒入15ml无菌水，收集孢子及菌丝体悬液；用无菌纱布滤去菌丝体，得孢子悬液，备用。吸取病原菌孢子悬液0.5ml，加入到熔化并冷却到5(TC的6ml的PSA培养基内，混合均匀后，作为上层培养基，倾覆在预先已凝固的PSA平板上。待上层培养基凝固后，在每块平板上放置4个牛津杯(直径内一0.6cm、外—0.8cm，高1.0cm)，用移液枪分别向每个牛津杯内加入供试农药500倍或1000倍液或无菌水各200ul，然后将平板放置在26'C培养箱培养。72h后，测量抑菌圈的直径。结果表明，几种病原菌均能正常生长，为观察到明显抑菌圈的存在，表明该有机无机复混肥没有直接抑制或杀灭这几种病原菌的作用。2、病原菌的接种试验a.样品水提液的制备取该有机无机复混肥200g，加蒸馏水至10L,浸泡24小时，过滤得到2%浓度的水提液，或稀释到所需浓度。b.对烟草黑胫病的诱导抗性实验烟草品种"红花大金元"(7W'co"朋atatec"历cv.HongDa)，漂浮育成苗，移栽入装有园土得花盆中，于25'C的条件下培养，选长势一致的健康苗200株，用0.5-2%的烟草专用有机无机复混肥水提液灌根，以普通烟草专用肥作为对照，按标准方法接种疫霉菌(寄生疫霉烟草变种98Pn009)的孢子，以植株l/3以上部分出现黑胫病症状作为指标，统计病株率，可知该样品对烟草黑胫病害的防治效果。实验结果发病株率比各自空白对照显著降低29%-52%，说明本发明的有机无机复混可以显著诱导烟草提高对黑胫病的抗性。3、病程相关蛋白基因表达检测a.样品水提液的制备取该有机无机复混肥200g，加蒸馏水至10L,浸泡24小时，过滤得到2%浓度的水提液，或稀释到所需浓度。b.烟苗的培养和诱导取烟草品种"红花大金元"(yWco"朋atatec鹏cv.HongDa)漂浮育成苗，移栽入装有园土得花盆中，于25'C的条件下培养，选长势一致的健康苗，用0.5%的烟草专用有机无机复混肥水提液灌根，以普通烟草专用肥作为对照。于灌根后6、8、12、24、48h、72h取下叶片，置液氮中冷冻固定，然后于-8(TC下保存备测。c.总RNA的提取根据Hughes和Galau(1988)的方法和Melissa(1999)的改进方法，分别提取各处理组的子叶总RNA。利用260/280光吸收值和琼脂糖电泳的方法确保各样品浓度和质量一致；d.PR蛋白基因表达的检测每个样品取10ugRNA经过甲醛变性胶电泳后，转膜至Hybond-N+膜上，亚甲兰染色，根据28SrRNA的量，确保膜上每个样品RNA的浓度和质量得一致性。将8种不同PRs蛋白基因片段(见表l)以内切酶切下后，利用随机引物法将片段标记32pdCTP，作为探针，用于Northern杂交分析。Northern杂交根据标准方法进行(Sambrooketal.，2001)，杂交完成后压X-光片(Kodark)-80°C曝光5-6天。根据X-光片上的曝光强度可以直观的观察到不同处理时间各种PR蛋白基因的相对表达量。表l、用于标记探针的质粒<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>e.试验结果对烟草根部不同时间的水提液处理，利用Northern杂交的方法，在远离根部的叶片中检测出PR-lb、PR-3、PR-5、酸性几丁质酶等4种PR蛋白基因出现持续性的诱导表达。己知PRs蛋白的易位累积，均不是通过转移从感染部位或诱导物处理部位移动到其它部分的，因此在未直接处理物的叶片检出部分PR蛋白的大量表达，说明本发明制作的有机无机复混肥能够诱导烟草产生系统抗病性(systemicacquiredresistance)，而不仅仅是局部抗性(localresistance)。4、烟草大田施用试验a.试验处理实验材料为烟草品种K326，时间2006年4月28日移栽，地点云南大理处理一本发明涉及的烟草专用有机无机肥每亩施用量为65kg，每株施58.5g。处理二本发明涉及的烟草专用有机无机肥每亩施用量为50kg,每株施45.0g。处理三本发明涉及的烟草专用有机无机肥每亩施用量为35kg，每株施31.5g。处理四烟草专用复合肥(NPK比为1:1:2.5)。试验设四个处理三次重复，小区随机排列，共12个小区，每个小区栽烟25株，行株距为L2X0.5m。施用烟草专用复合肥的对照，每千株烟施氮量为7.5kg，移栽时每株烟塘施810克烟草专用复合肥，移栽后十五天，将余下肥料全部施完。施用活性有机无机复混肥的处理，肥料于移栽时一次性施入。试验的田间管理按优质烟栽培技术措施进行。b试验效果对大田烟株生长的影响方差分析结果，有机无机肥的不同施用量处理与烟草专用复合肥的处理在叶面积系数、平均留叶数、平均株高、平均径围差异不显著(见表一)，从首次采烤时间、末次釆烤时间上，以上各施肥处理无明显差异。表一、不同处理田间生物学调査结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>田间花叶类病毒病调查结果封顶前对各处理的田间花叶类病毒病(CMV、TMV)进行调查，结果见表二，用病情指数进行方差分析，各处理在5%水平上差异不明显。但从调査结果看，施用烟草专用有机无机肥的处理，田间花叶类病毒病的发病株率和病情指数都比施用烟草专用复合肥的对照低，说明施用烟草专用有机无机肥后对提高烟株的田间抗病性有一定的作用。_表二、不同处理花叶病发生情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四6.6A13.9对烤烟产值量的影响施用有机无机肥的不同处理其亩产量、亩产值、上中等烟比例均高于施用烟草专用复合肥的对照。而均价则以有机无机肥每亩施用量为50kg的处理最高，施用烟草专用复合肥的对照最低(详见表三)。从亩产量看有机无机肥每亩施用量为65kg的处理，其产量最高，每亩产量175kg，其次为有机无机肥每亩施用量为50kg的处理，每亩产量173.6kg，有机无机肥每亩施用量为35kg的处理，每亩产量164.4kg，施用烟草专用复合肥(千株施氮量7.5kg)的处理，每亩产量155.7kg。从亩产值看:有机无机肥每亩施用量为50kg的处理，其产值最高，每亩产值1992.67元，其次为有机无机肥每亩施用量为65kg的处理，每亩产值1889.13元，有机无机肥每亩施用量为35kg的处理，每亩产值1834.70元，施用烟草专用复合肥(千株施氮量7.5kg)的处理，每亩产值最低为1594.03元。从上中等烟比例看:有机无机肥每亩施用量为35kg的处理，上中等烟比例达90.9%，有机无机肥每亩施用量为50kg的处理，上中等烟比例达88.4%，施用烟草专用复合肥(千株施氮量7.5kg)的处理，上中等烟比例为87.1%，有机无机肥每亩施用量为65kg的处理，上中等烟比例最低为86.9%。综合以上结果可以得出本发明涉及的烟草专用型有机无机肥每亩施用量为50kg的处理较好，其亩产量、亩产值、上中等烟比例、均价都较高。表三、不同处理对产值量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例一将商品褐煤加热至300。C烘干，按照干燥褐煤蚕粪废渣5:5:1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料；利用预处理褐煤的热量保持混合物85。C以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素，按硝铵磷肥:硫酸钾磷酸一铵:钙镁磷肥硫酸亚铁有机预混料25:28:8:4:0.5:34.5的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，粒径4mm，即得到诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥，成分的质量百分比为有机质含量23%，全N8.8y。,P6n/。禾BK14%，其他48.2%。以每亩50公斤的用量(1000株/亩)，将该有机无机复混肥作为基肥施入土中，条施、环施均可，以每亩50公斤施用常规烟草专用复合肥作为对照，按常规移栽漂浮育成烟草苗(品种红花大金元)，浇灌定根水，常规栽培、管理，结果表明黑胫病病株率比对照下降32%，产值提高15%。实施例二基本同实施例。不同之处Xi:用烟草品种K326为供试材料；商品褐煤烘T温度为20(TC烘",十燥糾煤:査粪废旌的质頃:比为10:1:1;硝酸铵:硫酸钾磷酸一铵钙镁磷肥硫酸亚铁有机预混料比例为28::30:10:6:0.3:25.7;粒径3皿n的诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥成分的质量百分比为有机质含量21%，全N9.4%,P7%和K15%，其他仏6%。以每亩50公斤的用量(1000株/亩)，将该有机无机复混肥作为基肥施入土中，条施、环施均可，以每亩50公斤施用常规烟草专用复合肥作为对照，按常规移栽漂浮育成烟草苗(K326)，浇灌定根水，常规栽培、管理，结果表明黑胫病病株率比对照下降26%，赤星病病株比率下降12%，产值提高13%。实施例三基本冋实施例-。不同之处为商品褐煤烘干温度为25(TC烘干，干燥褐煤蚕粪废渣的质虽比为7:2:1;硝酸铵硫酸钾磷酸.邻争5镁磷肥硫酸亚铁有机预混料比例为24:24:5:4:0:'13;褐煤加热温度为250。C，保持混合物85。C以h22分；粒径l()腿的诱导烟草抗病的烟草^用有机无机复混肥成分的质量百分比为有机质含量28%，^N7.7%，P4.3%禾l'.lK12%，其他48%;以每亩50公斤的用量(1000株/亩)，将该烟草专用型有机无机复混肥作为基肥施入土中，条施、环施均可，以每亩50公斤施用常规烟草专用复合肥作为对照，按常规移栽漂浮育成烟草苗(品种红花大金元)，浇灌定根水，团棵期追施烟草专用型有机无机复混肥15公斤，常规栽培、管理，结果表明黑胫病病株率比对照下降37%，产值提高11%。本发明的诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥不但可以满足烟草正常生长需养分，还可以诱导烟草病程相关蛋白基因大量表达，产生系统抗病性，无论盆栽或大田试验均取得良好肥效和防效，具备了很好的应用开发前景。权利要求1、一种诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥，其特征在于该有机无机复混肥成分的质量百分比为有机质含量21～28％，全N7.7～9.4％，P4.3～7％和K12～15％，其他47.6～48.2％。该有机无机复混肥由下列步骤制成；(1)褐煤预处理，将商品褐煤加热至200～300℃烘干；(2)有机预混料制备预处理褐煤后，按照干燥褐煤∶蚕粪∶废渣5～10∶1～5∶1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中搅拌均匀混合成固体粒料；利用预处理褐煤的热量保持混合物85℃以上至少20分钟，以灭活青霉素的固-液废渣中的青霉菌和残留青霉素；(3)有机无机复混肥的料制备按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶硫酸亚铁∶有机预混料24～28∶24～30∶5～10∶4～6∶0～0.5∶25.7～43的质量比充分混合各物料，用常规的设备挤压造粒，即得粒径3-6mm的到诱导植物产生系统抗病性的烟草专用有机无机复混肥。2、权利要求1所述的有机无机复混肥，以基肥、追肥的形式施用，作为诱导烟草表达病程相关蛋白从而产生系统抗病性及提供生长营养需求的应用。全文摘要诱导烟草抗病的烟草专用有机无机复混肥及其应用，属生物
技术领域：
。复混肥成分质量百分比为有机质含量21～28％，全N7.7～9.4％，P4.3～7％和K12～15％，其他47.6～48.2％。制备方法为将褐煤加热至200～300℃烘干；按褐煤∶蚕粪∶废渣5～10∶1～5∶1的质量比，立即将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣和蚕粪倒入预烘干的褐煤中混合成固体粒料；保持混合物85℃以上至少20分钟；按硝铵磷肥∶硫酸钾∶磷酸一铵∶钙镁磷肥∶硫酸亚铁∶有机预混料24～28∶24～30∶5～10∶4～6∶0～0.5∶25.7～43的质量比混合，得到复混肥。该复混肥作为诱导烟草表达病程相关蛋白从而产生系统抗病性及提供生长营养需求的应用。具有效果佳、施用方便等优点，适宜烟草的无公害生产。文档编号C05C1/00GK101113118SQ20071006603公开日2008年1月30日申请日期2007年7月16日优先权日2007年7月16日发明者姬广海,李正跃,李秀军,杨红元,林谷润,陈穗云申请人:云南大学