专利名称：：鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法
技术领域：
：本发明属于水产遗传育种"l支术，是一种采用物理学方法诱导鲆鲽鱼类四倍体的方法。
背景技术：
：以牙鲆、大菱鲆和星鲽等为主的鲆鲽鱼类是我国重要的海水养殖鱼类，目前我国鲆鲽鱼类养殖的年产值接近100亿元。不过，许多鲆鲽鱼类因为性成熟比较早，由于性腺发育影响了鱼体生长和肉质、降低了商品质量，对这些鱼类开展不育技术的研究，研制出不育群体，对于提高这些鱼类的养殖产量和商品价值，非常重要。另外，目前我国引进的海水鲆鲽鱼类种类也越来越多，例如，漠斑牙鲆和大西洋牙鲆等；这些外来生物如果逃逸到自然界中，将会给我国海水生态环境和物种资源造成4艮大危害。因此，研制这些鱼类的高效不育技术，培育不育群体，在渔业生产中推广外来鱼类的不育苗种，这对于保护我国水域不受外来物种^^害、保护我国水产种质资源，显得非常迫切和急需。因此，采用现代生物技术手段，研究鲆鲽鱼类多倍体诱导技术、研制出四倍体鱼，然后与二倍体交配就可以生产不育的三倍体群体，从而可以大量生产鱼类不育群体，这对于缩短鲆鲽鱼类养殖周期，提高养殖产量，^提高养殖的经济效益，推动鲆鲽鱼类养殖产业的发展，具有重要的现实意义和重大的应用价值。同时，多倍体不育苗种的推广必将产生巨大的经济和社会效益。鉴于鱼类不育技术在遗传育种、渔业生产、水环境保护和水生生物遗传多样性保护上的重要意义和应用价值，国际上也非常重视鱼类等水产养殖动物不育技术的研究。而制作鱼类不育的主要途径是生产三倍体。因为三倍体鱼类具有控制过度繁殖、抑制性腺发育、促进生长以及提高鱼肉品质等优点，因而受到普遍的重视。鱼类多倍体的绝大多数研究工作是在淡水鱼类上开展的。迄今已先后获得了草鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼、虹鳟，银大马哈鱼、大鳞大马哈鱼、大西洋鮭、白鲢和鲤等鱼类三倍体；西班牙学者(2000)采用冷休克方法诱导了大菱鲆三倍体，获得三倍体鱼苗。另外，在英国和日本，三倍体虹鳟也进入了商业化养殖。除虹鳟外，日本还开展了诱导三倍体香鱼的研究与开发，发现三倍体香鱼的生长速率和抗寒能力都明显优于二倍体香鱼，很受消费者和养殖家的欢迎，具有很大的商业价值和开发潜力。不过，上述研究都是采用冷休克方法通过抑制第二极体排出使染色体加倍，直接诱导三倍体。由于三倍体诱导率很低，生产的三倍体鱼苗数量非常有限，达不到商业生产的目的，因此，直接诱导三倍体的方法难以达到实用化的要求。迄今为止，有关海水鲆鲽鱼类四倍体的批量化诱导，通过四倍体和二倍体交配生产三倍体不育鱼苗，国内外尚无报道。
发明内容本发明的目的是要克服鱼类三倍体诱导效率低、难以大规^莫推广应用、只能当代使用、不能建立繁殖群体的缺点，建立通过抑制鱼类受精卵第一次卵裂、大量诱导产生四倍体鱼苗的方法。即采用现代生物技术手段，研究鲆鲽鱼类多倍体诱导技术、研制出四倍体鱼，然后与二倍体交配生产不育的三倍体群体，从而可以大量生产鱼类不育群体，本发明其技术内容如下包括二个方面一、四倍体鱼苗的诱导；二、四倍体鱼苗的鉴定。一、四倍体鱼苗的诱导它的技术内容包括1、未受精卵的采集及4受精；2、染色体加倍起始时间的确定；3、静水压Y木克压力和处理时间的确定。1、未受精卵的采集及授精选择性成熟的牙鲆雌鱼，在自然产卵前lh采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，将采集的鱼卵置于15-18°C;将采集的新鲜牙鲆精液或冷冻精液加入未受精卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的授精最小体积比为500pL:50-100ml，加入2倍于卵量体积的温度为15-17。C的海水完成授精过程。授精过程在250ml烧杯中进行。2、染色体加倍起始时间的确定在4受精后60，65，68,70,73,78和80分钟的不同时间，将受升青卵置于60—70Mpa静水压下进行休克处理，休克处理时间为5-7min，休克处理完毕后将卵移入15-17。C海水中培养。在原肠中期计算受精率，在鱼苗孵化出膜后，计算四倍体鱼苗的孵化率。在受精后65-73分钟进行静水压处理，都有20-90%的四4咅体鱼苗产生，而只有在68和70分钟两个组的四倍体"i秀导率最高，达到80-90%。因此确定牙鲆四倍体鱼苗诱导的有效起始时间为受精后68-70分钟。3、静水压休克压力和处理时间的确定根据确定的静水压休克起始时间，设计实验，将受精卵按休克压力和休克持续时间两因素进行正交试^i殳计，根据鱼的种类不同，设计的参数不尽相同；^木克压力取62,65、67、72、80MPa几个水平，休克持续时间选定为5-7分钟，进行静水压休克处理。休克处理完毕后将卵移入15-17。C海水中培养。计数后代中四倍体产生情况，实验结果表明，牙鲆受精卵在62、65,67Mpa压力下休克处理5-7分钟，鱼苗都能孵化出膜，孵化率为27-44%;但只有在67Mpa压力下，休克处理6分钟，四倍体鱼苗的诱导率最高，达到90%。当采用67Mpa的静水压力时，牙鲆受精卵经过5、6或7分钟的休克处理，都能产生一定比例的四倍体鱼苗，不过只有休克处理6分钟时的四倍体鱼苗诱导率最高，达到80%左右。二、四倍体鱼苗的鉴定它的技术内容包括l.通过倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗；2.通过染色体分析鉴定四倍体鱼苗。1.用倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗每次四倍体诱导实验,抽检孵化出膜后2-5天的四倍体实验鱼苗20-30尾。将每尾鱼苗》t/vl个1.5ml的离心管中，用蒸馏水清洗鱼苗l次，随后向每个离心管加入0.2-0.5ml—步法染色试剂，用碾磨棒将鱼苗碾碎成单细胞，制成单细胞悬液。全部磨好后，向每个管中加入0.8-lml从PARTEC公司购买的鞘液，用滤膜过滤后，将滤液转入仪器配套的5ml试管中，轻弹试管，使细胞悬液混合均匀，然后将试管置于PARTEC倍性测定仪(PA)进行测定。测试样品，用正常二倍体胚胎作对照，再分析四倍体诱导组。通过细胞DNA含量分析，得知二倍体鱼苗细胞中的DNA含量绝大多数集中在30-35处，而四倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在60-70，比二倍体鱼苗高l倍，因此证明我们诱导出的鱼苗为四倍体鱼苗。2.染色体分析鉴定四倍体鱼苗采用常规染色体制片方法，对牙鲆等鱼类人工诱导的四倍体鱼苗进行了染色体分析，牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n-48条；而四倍体鱼苗的染色体数目为化=96,发现在优化的静水压休克下产生的鱼苗中90%以上的个体含有96条染色体，证明这些鱼苗为四倍体鱼苗。本发明与已有技术对比其特点是本发明建立了能有效诱导海水鲆鲽鱼类受精卵染色体加倍产生四倍体鱼苗的技术方法；首次筛选出有效的抑制鲆鲽鱼类卯子第一次卵裂的技术参数；和以往的多倍体诱导方法相比较，本发明建立的四倍体鱼苗诱导方法可以大量诱导四倍体鱼苗，而以前报道的方法只能诱导三倍体鱼苗，因此本发明具有明显的创新性，四倍体鱼苗的诱导效率高。本方法诱导出的四倍体鱼苗倍性整齐、均为四倍体，不含二倍体和三倍体，因此，本方法非常有效和可靠。本发明首次建立了静水压批量化诱导鲆鲽鱼类四倍体鱼苗的技术方法，其特点是操作简单、实用性强、易行、安全和可靠，为鲆鲽鱼类性别控制和多倍体育种开辟了新的技术途径，可推广应用于几乎所有鱼类，可应用于鱼类性别控制及不育三倍体苗种的生产。图1:四倍体鱼苗和二倍体鱼苗细胞DNA含量比较A:正常二倍体鱼苗细胞DM含量；B:四倍体鱼苗DNA含量。图2:四倍体鱼苗和二倍体鱼苗染色体比较A:正常二倍体鱼苗染色体；B:四倍体鱼苗染色体。具体实施例方式采用现代生物技术手段，研究鲆鲽鱼类多倍体诱导技术、研制四倍体鱼，然后与二倍体鱼交配就可以生产不育的三倍体鱼群体，从而可以大量生产鱼类不育群体。采用同源精子与牙鲆卵子授精，在受精后一定时间，对受精卵进行静水压休克处理，抑制第一次卵裂，使染色体加倍，可以成功诱导牙鲆四倍体鱼苗的产生，建立海水鲆鲽鱼类通用的四倍体鱼苗高效诱导技术，对于这些鲆鲽鱼类的性别控制、不育三倍体苗种培育，进行不育苗种养殖，提高这些鱼类的养殖产量、产品质量和经济效益，具有重要的现实意义和巨大的推广应用潜力。下面以牙鲆为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明本发明的技术内容包括二个方面一、四倍体鱼苗的诱导；二、四倍体鱼苗的鉴定。一、四倍体鱼苗的诱导它的技术内容包括1、未受精卵的釆集及授精；2、染色体加倍起始时间的确定；3、静水压休克压力和处理时间的确定。1、未受精卵的采集及授精选择性成熟的牙鲆雌鱼，在自然产卵前lh采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，将采集的卵置于15-17°C;将采集的新鲜牙鲆4青液加入未受精卵中，干法授精，轻轻摇动混勻，加入2倍于卵量体积的海水完成授精过程。精液和卵的授精最小体积比为500pL:60ml,授精过程在250ml烧杯中进行。牙鲆精液的冷冻保存和解冻受精按照已报道的方法进行(陈松林主编，鱼类精子和胚胎冷冻保存的理论和技术，2007,中国农业出版社)。2、染色体加倍起始时间的确定在4受精后60，65，68,70，73,78和80分钟等不同时间，将受4青卵置于不同压力的静水压下进行休克处理，^UL压力为65--67Mpa，休克处理时间为6min,d木克处理完毕后将卵移入15-17。C海水中培养。在原肠中期计算受精率，在鱼苗孵化出膜后，计算四倍体鱼苗的孵化率，从而确定适合于牙鲆四倍体诱导的有效起始时间。在受精后65-73分钟进行静水压处理，都有20-90%的四倍体鱼苗产生，而只有在68和70分钟两个组的四倍体诱导率最高，达到80-90%。因此确定牙鲆四倍体诱导的有效起始时间为受精后68-70分钟。见表l。表l:四倍体诱导起始时间的确定(室温为2rC左右，海水温度为15T左右)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、静水压^木克压力和处理时间的确定根据确定的静水压休克起始时间，设计试验，将受精卵按休克压力和休克持续时间两因素进行正交试验i殳计，根据鱼的种类不同，设计的参数不尽相同；休克压力取62,65、67、72和80Mpa,d木克持续时间选定为5-7分钟，进行静水压休克处理。休克处理完毕后将卵移入15-17。C海水中培养。在原肠中期计算受精率，在鱼苗孵化出膜后，计算四倍体鱼苗的孵化率，从而确定适合于牙鲆四倍体^^导的静水压力和处理时间。计数后代中四倍体产生情况，实验结果表明，牙鲆受精卵在62，65、67、72和80Mpa压力下休克处理6分钟，鱼苗都能孵化出膜，孵化率为27-44%;但只有在67Mpa压力下，<木克处理6分钟，四倍体鱼苗的诱导率最高，达到90%(见表2)。表2:牙鲆四倍体诱导静水压力的确定(室温21.4°C，海水温度17。C左右，静水压休克处理6分钟)梯度孵化率卵黄吸收后的存活率鱼苗期四倍体率62MPa43.8%52%0%65MPa27%61%40%67MPa42%47%90%72MPa0%0%0%80MPa0%0%0%我们也测定了静水压休克时间对鱼苗四倍体诱导率的影响，在静水压处理5-7分钟都能获得一定比例的四倍体鱼苗，而只有在静水压处理6分钟时获得的四倍体鱼苗的比例最高，因此确定牙鲆四倍体诱导适宜的静水压处理时间为6分钟(表3)。表3:牙鲆四倍体诱导静水压处理时间的确定(室温21.4°C，海水温度17。C左右，处理压力为67Mpa左右)处理时间(分孵化率卵黄吸收后的鱼苗期四倍体钟)存活率率545%65%15%640%60%80%720%15%10%4.静水压诱导牙鲆四倍体鱼苗结果汇总采用上面建立的方法，我们进行了牙鲆四倍体鱼苗的诱导，在多次诱导实验中获得四倍体鱼苗，现将牙鲆四倍体诱导结果汇总如下表4:表4:牙鲆四倍体鱼苗诱导结果汇总<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>二、四倍体鱼苗的鉴定它的技术内容包括1.通过倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗；2.通过染色体数量和核型鉴定四倍体鱼苗。1.倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗倍性测定仪可以测定鱼苗细胞中的DNA含量，由于四倍体和二倍体在DNA含量上相差一倍，因此可以用倍性测定仪测定鱼苗的染色体倍性。每次四倍体诱导实验，抽检孵化出膜后2-5天的四倍体实验鱼苗20-30尾。将鱼苗^7v1.5ml的离心管中，每管放一尾，向每个管中加入O.5-lml蒸馏水，清洗鱼苗，随后将蒸馏水吸出，再向每个离心管加入0.2-0.5ml从PARTEC公司购买的一步法染色试剂，用碾磨棒将鱼苗碾碎成单细胞，制成单细胞悬液，碾磨下一个前先将^展磨纟奉在蒸馏水中洗干净。全部磨好后，向每个管中加入O.8-lml鞘液(PBS),用滤膜过滤后，将滤液转入倍性测定仪配套的5ml试管，轻弹试管，使细胞悬液混合均勾后，将试管置于Partec公司的倍性测定仪(PA)中进行测定。分析时，先用鞘液清洗倍性测定仪的流动室，然后测试样品，每次测试完后都要清洗，先用正常二倍体胚胎作对照，然后再分析四倍体诱导组。通过细胞DNA含量分析，得知二倍体鱼苗细胞中的DNA含量绝大多数集中在30-35处，而四倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在60-70,比二倍体鱼苗高l倍，因此证明我们诱导出的鱼苗为四倍体鱼苗(见图1:A、B)。采用倍性测定仪主要是证明本发明方法诱导鲆鲽鱼类四倍体的可行性则不必要每次都进行四倍体鱼苗的检测。2、染色体分析鉴定四倍体鱼苗牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为211=48条；而四倍体鱼苗的染色体数目为4n=96，因此通过染色体分析即可鉴定诱导出的鱼苗是否为四倍体鱼苗。如果诱导出的鱼苗的染色体数目为96条，则证明这些鱼苗是四倍体。本发明采用常规染色体制片方法，对牙鲆人工诱导的四倍体鱼苗进行抽样检测。主要步骤包括将鱼苗置于海水配置的0.02%的^火水仙素中，在室温下处理2个小时。然后把鱼苗》文入0.075mol/L的KCL中低渗30分钟。用新配制的卡诺氏液(曱醇冰醋酸=3:1)连续固定3次，每次20分钟。寻取单个鱼苗放入50。/。的冰醋酸中，用尖镊子铗碎，使细胞游离。热滴片法滴片。10%吉姆萨染液染色20-30分钟，镜检。每次四倍体诱导实验抽检10-20尾鱼苗进行染色体分析，发现在优化的静水压休克条件下(受精后65-70分钟，静水压力67Mp,休克处理6分钟)产生的鱼苗都含有96条染色体，从而证明这些鱼苗为四倍体鱼苗(见图2:A、B)。采用染色体分析主要是证明本发明方法诱导鲆鲽鱼类四倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行牙鲆等鲆鲽鱼类四倍体诱导时，则不必要每次都进行四倍体鱼苗的染色体分析。权利要求1.一种鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法，其特征在于它的操作方法包括二个方面(1)、四倍体鱼苗的诱导；(2)、四倍体鱼苗的鉴定；(1)、四倍体鱼苗的诱导它的技术内容包括(a)、未受精卵的采集及授精；(b)、染色体加倍起始时间的确定；(c)、静水压休克压力和处理时间的确定；(a)、未受精卵的采集及授精选择性成熟的牙鲆雌鱼，在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，将采集的鱼卵置于15-18℃；将采集的新鲜牙鲆精液或冷冻精液加入未受精卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的授精最小体积比为500μL∶50-100ml，加入2倍于卵量体积的温度为15-17℃的海水完成授精过程，授精过程在250ml烧杯中进行；(b)、染色体加倍起始时间的确定在授精后60，65，68，70，73，78和80分钟的不同时间，将受精卵置于60--70Mpa静水压下进行休克处理，休克处理时间为5-7min，休克处理完毕后将卵移入15-17℃海水中培养；在原肠中期计算受精率，在鱼苗孵化出膜后，计算四倍体鱼苗的孵化率；在受精后65-73分钟进行静水压处理，都有20-90％的四倍体鱼苗产生，而只有在68和70分钟两个组的四倍体诱导率最高，达到80-90％；因此确定牙鲆四倍体鱼苗诱导的有效起始时间为受精后68-70分钟；(c)、静水压休克压力和处理时间的确定根据确定的静水压休克起始时间，设计实验，将受精卵按休克压力和休克持续时间两因素进行正交试验设计，根据鱼的种类不同，设计的参数不尽相同；休克压力取62，65、67、72、80MPa几个水平，休克持续时间选定为5-7分钟，进行静水压休克处理；休克处理完毕后将卵移入15-17℃海水中培养；计数后代中四倍体产生情况，实验结果表明，牙鲆受精卵在62、65，67Mpa压力下休克处理5-7分钟，鱼苗都能孵化出膜，孵化率为27-44％；但只有在67Mpa压力下，休克处理6分钟，四倍体鱼苗的诱导率最高，达到90％。当采用67Mpa的静水压力时，牙鲆受精卵经过5、6或7分钟的休克处理，都能产生一定比例的四倍体鱼苗，不过只有休克处理6分钟时的四倍体鱼苗诱导率最高，达到80％左右；(2)、四倍体鱼苗的鉴定它的技术内容包括(a).通过倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗；(b).通过染色体分析鉴定四倍体鱼苗；(a).用倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗每次四倍体诱导实验，抽检孵化出膜后2-5天的四倍体实验鱼苗20-30尾；将每尾鱼苗放入1个1.5ml的离心管中，用蒸馏水清洗鱼苗1次，随后向每个离心管加入0.2-0.5ml一步法染色试剂，用碾磨棒将鱼苗碾碎成单细胞，制成单细胞悬液；全部磨好后，向每个管中加入0.8-1ml从PARTEC公司购买的鞘液，用滤膜过滤后，将滤液转入仪器配套的5ml试管中，轻弹试管，使细胞悬液混合均匀，然后将试管置于PARTEC倍性测定仪进行测定；测试样品，用正常二倍体胚胎作对照，再分析四倍体诱导组；通过细胞DNA含量分析，得知二倍体鱼苗细胞中的DNA含量绝大多数集中在30-35处，而四倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在60-70，比二倍体鱼苗高1倍，因此证明我们诱导出的鱼苗为四倍体鱼苗；(b).染色体分析鉴定四倍体鱼苗采用常规染色体制片方法，对牙鲆等鱼类人工诱导的四倍体鱼苗进行了染色体分析，牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝48条；而四倍体鱼苗的染色体数目为4n＝96，发现在优化的静水压休克下产生的鱼苗中90％以上的个体含有96条染色体，证明这些鱼苗为四倍体鱼苗。全文摘要一种鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法，包括四倍体鱼苗的诱导方法和鉴定方法；诱导方法包括未受精卵的采集及授精；确定受精卵染色体加倍起始时间、静水压休克压力和处理时间；鉴定方法包括倍性测定仪鉴定和染色体分析鉴定。该方法首次建立了采用静水压诱导牙鲆等鲆鲽鱼类四倍体鱼苗的方法，筛选到抑制第一次卵裂、进行染色体加倍的静水压处理起始时间和静水压休克条件，建立了四倍体鱼苗批量化诱导的方法。采用本发明方法获得的四倍体鱼苗诱导率高达90％。本发明建立的方法具有先进、高效、准确、可靠的特点，在鱼类多倍体诱导和不育苗种生产中具有重要应用价值，在鱼类养殖和育种上具有广阔的推广应用前景。文档编号A01K61/00GK101595849SQ20091001692公开日2009年12月9日申请日期2009年6月23日优先权日2009年6月23日发明者季相山,磊王,田永胜,邵长伟,陈松林申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所