专利名称：一种春结球甘蓝育种保持自交系春性的繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物育种技术领域，涉及利用一种二年生植物组织的培养实 现作物春季品种选育的方法，尤其是一种春结球甘蓝育种保持自交系春性的 繁殖方法。
背景技术：
结球甘蓝(■Srassics o7e_r<3ces. L , Far. caAzYsz^g L.)属于十字花禾斗 芸薹属中一种重要蔬菜，它具有品质优良、营养丰富、食用多样、耐贮运等 特点，世界各国普遍栽培。据报道，2006年中国结球甘蓝播种面积达到93. 73 万hm2，在国内蔬菜栽培和周年供应中占居重要地位。结球甘蓝适应性强， 一年内可分为春、夏、秋等多季节、多茬次上市，对缓解市场淡旺季、满足 鲜菜周年均衡供应起着关键性作用；特别是近年来随着消费者生活水平的不 断提高和设施栽培的大力发展，促使春结球甘蓝栽培面积迅速扩大。结球甘 蓝为典型的绿体春化型二年生作物，只有植株营养体达到一定体积，经过一 定低温感应才能通过春化，因而一年只能完成一个生长时期，这就对于适宜 春季栽培的春早熟杂种一代品种及其亲本的选育极为不利，并带来了育种障 碍，使春季栽培的春结球甘蓝在春季很难育种。如果春季栽培的结球甘蓝亲 本自交系经常在秋季进行筛选，就会导致春季栽培品种的春性严重退化，春 结球甘蓝品种在春季适应性减弱，如容易出现结球性、耐低温性、耐弱光性 差，也易发生先期抽薹现象。虽然科学家已研究出能够采用春季结球甘蓝腋 芽扦插繁殖方法保留亲本自交系的春性，但腋芽扦插苗栽培期长，经过夏、 秋季，易受夏季高温、干旱影响，使扦插苗成活率很低，并且成本也很高； 即使成活苗秋季栽培，也会因苗龄过长、植株衰老，秋季病害危害会导致植株过早死亡，失去所选育的自交系材料。这就严重影响着选育适宜春季栽培 品种的春结球甘蓝的育种进程。
一种在春季正常进行春结球甘蓝育种，既能保持所选育杂种一代品种的 亲本自交系在春季所具有的表现特性(春性)，又能保证所选自交系的正常 存活，或扩大其繁殖系数增加自交系植株数量，使自交系正常完成生活周期， 这就成为本领域技术人员研究的热点(创新点)。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种春结球甘蓝育种保持自交系春性的繁殖方 法。该方法首次选用结球甘蓝自交系成熟叶球的绿色叶片作为外植体，进行 组织培养，拟获得一种具有高诱导率的再生苗，并保持原自交系春性的繁殖 方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案 一种春结球甘蓝育种保持自交系春性的繁殖方法，其特征在于，包括下 列步骤
1) 外植体选择
以春季正常栽培春结球甘蓝自交系，将入选的春性表现优良的植株叶球 的外层绿色叶片，切成lcm2左右的小片作为离体培养的外植体；
2) 不定芽的分化诱导
把外植体接种到培养瓶内的不定芽分化诱导培养基上，在温度25aC， 每天12h 14h光照，光照强度2000 2500Lx条件下培养，经20 30天
诱导出不定芽；
所述的不定芽分化诱导培养基的配方是:在MS培养基中加入3%蔗糖(质 量)、0.8%琼脂(质量)、3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)及0. 4mg/L的 a-萘乙酸(NAA);
3) 不定芽的生根诱导待不定芽生长至1. 5 2. 5cm高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶 内的不定芽诱导根培养基上，在温度25°C，每天10h 12h光照，光照强 度2000 2500Lx的条件下培养，经15 20天诱导生根，获得再生苗；
所述的不定芽诱导根培养基为在MS培养基中加入3%蔗糖(质量)、 0.8%琼脂(质量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NAA)。
4)再生苗的锻炼与移栽
将有再生苗的培养瓶口打开锻炼3 5天，从培养瓶中取出再生苗，洗 去根部的培养基，移植到装有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长，在秋季， 当再生苗有5 7片真叶时，适应性炼苗7天后定植于田间(露地)。
本发明首次选择春结球甘蓝叶球绿色叶片作为植株再生离体培养的外 植体，保证了春结球甘蓝自交系在春季结球期植株农艺性状的选择和保持了 自交系的春性，克服了其他方法(如子叶、下胚轴诱导培养等)不能进行田 间选择保持春性的缺陷；保证了春结球甘蓝自交系的存活，不受夏季高温、 强光、干旱等不利因素影响，能大幅度提高自交系同一基因型植株数，扩繁 株数50倍以上。
图1-1是实施例春结球甘蓝自交系YCF51-99-835168春季叶球成熟期图； 图1-2是实施例春结球甘蓝自交系YCF51-99-835168春季品种育种入选 单株图1-3是实施例春结球甘蓝自交系YCF51-99-835168叶球叶片外植体图； 图2_1是实施例春结球甘蓝自交系BMP01-88-561336叶球叶片(外植体) 不定芽诱导图2-2是实施例春结球甘蓝自交系BMP01-88-561336不定芽的根诱导图； 图2-3是实施例春结球甘蓝自交系BMP01-88-561336再生苗移栽培养钵图。以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
按照本发明的技术方案，春结球甘蓝育种保持自交系春性的繁殖方法， 具体按下列步骤进行
1) 外植体选择
以春季正常栽培春结球甘蓝自交系，将入选的春性表现优良的植株叶球 的外层绿色叶片，切成lcm2左右的小片作为离体培养的外植体。
2) 不定芽分化诱导培养基制备
不定芽分化诱导培养基配方为在MS培养基中加入396蔗糖(质量)、0. 8% 琼脂(质量)、3. 0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)及0. 4mg/L的a -萘乙酸(NAA)。
3) 不定芽诱导根培养基的制备
不定芽诱导根培养基配方为在MS培养基中加入3%蔗糖(质量)、0. 8% 琼脂(质量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NM)。
4) 不定芽的分化诱导
把外植体接种到培养瓶内的不定芽分化诱导培养基上，在温度25°C， 每天12h 14h光照，光照强度2000 2500Lx条件下培养，经20 30天(d) 诱导出不定芽。
5) 不定芽的生根诱导
待不定芽生长至1. 5 2. 5cm高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶 内的不定芽诱导根培养基上，在温度25'C，每天10h 12h光照，光照强度 2000 2500Lx的条件下培养，经15 20天(d)诱导生根，获得再生苗。
6) 再生苗的锻炼与移栽
将有再生苗的培养瓶口打开锻炼3 5天(d)，从培养瓶中取出再生苗， 洗去根部的培养基，移植到装有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长。在秋季， 当再生苗有5 7片真叶时，适应性炼苗7天(d)后定植于田间(露地)。上述MS培养基的制备方法详见李浚明《植物组织培养教程》(第二版， 北京中国农业大学出版社，2002， 32 38)。
以下是发明人给出的实施例需要说明的是，这些实施例是一些较佳 的实施例，根据实验证明，本发明不限于这些实施例。 实施例l:
本实施例选用申请人的春结球甘蓝育种研究室新育成的春结球甘蓝品 种"秦甘50"(国家品种鉴定)的父本(自交系YCF51-99-835168)的早代为 实验材料。
1) 外植体选择
春结球甘蓝自交系YCF51-99-835168的早代于12月20日冷床育苗，3片真 叶分苗一次，当幼苗长有6 7片真叶时，于3月中旬定植在露地。田间按春 结球甘蓝露地栽培正常管理，当植株生长叶球成熟时(图l-l)，田间选择符 合育种目标、农艺性状表现优良的植株(图l-2),选其叶球叶片作为植株再 生离体培养的外植体(图l-3)。
2) 再生植株诱导培养 ①不定芽的诱导
选用春结球甘蓝自交系YCF51-99-835168的早代成熟叶球的外层绿色叶 片，将叶片切成lci^左右的小方片，用75%酒精(40 50秒)、0. 1%升汞(8 IO分)消毒；接种于不定芽诱导根培养基中，不定芽诱导根培养基的配方为 在MS培养基中加入39&蔗糖(质量)、0.8%琼脂(质量)、3. 0mg/L的6-苄基腺 嘌呤(6-BA)及0.4mg/L的a-萘乙酸(NM)。
在温度25'C，每天12h 14h光照，光照强度2000 2500Lx条件下培养， 经20 30天(d)诱导出不定芽。根据秋季田间(露地)适宜定植时间(陕 西定植时间为8月下旬)，可继代1 3代，延长培养时间。春结球甘蓝自交系 YCF51-99-835168的早代诱芽率86. 5%，分化率128%。
7上述诱芽率(％) ^诱导出芽的外植体数/总外植体数X100(以下相同)；
分化率(％) 二分化的总芽数/总外植体数xioo(以下相同)。
② 不定根的诱导
待不定芽生长至1. 5 2. 5cm高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶 内的不定芽诱导根培养基上，不定芽诱导根培养基为在MS培养基中加入 3%蔗糖(质量)、0.8%琼脂(质量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NAA)。 在温度25°C，每天10h 12h光照，光照强度2000 2500Lx的条件下培 养，经15 20天(d)诱导生根，生根率100%。
③ 再生苗移栽
将有再生苗的培养瓶口打开锻炼3 5天(d)，从培养瓶中取出再生苗， 洗去根部的培养基，移植到装有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长。在8 月下旬，当再生苗有5 7片真叶时，适应性炼苗7天(d)后定植于田间(露 地)。秧苗成活率95%，以后管理同于常规田间(露地)管理。 实施例2:
本实施例选用申请人的春结球甘蓝育种研究室新育成的春结球甘蓝品
种"秦甘50"(国家品种鉴定)的母本(自交系BMP01-88-561336)的早代为 实验材料。
1) 外植体选择
母本自交系BMP01-88-561336的早代田间培养和外植体选择方法同父本 自交系YCF51-99-835168的早代(参看实施例1)。
2) 再生植株诱导培养 ①不定芽的诱导
选取入选春结球甘蓝自交系BMP01-88-561336的早代叶球的外层绿色叶 片作为离体培养的外植体。采集叶片后带回实验室，先用流水冲洗3次，再 在超净工作上用75%酒精浸泡50秒(s)， 0. 1%升汞消毒10分(min)、无菌水冲洗3遍，然后将叶片切成边长为lcm的正方形方块后，叶背朝下，接种于不 定芽诱导根培养基中，不定芽诱导根培养基配方是，在MS培养基中加入3呢 蔗糖(质量)、0. 8%琼脂(质量)、3. 0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)及O. 4mg/L 的a -萘乙酸(NM)。在温度25。C ，每天12h 14h光照，光照强度2000 2500Lx 条件下培养，经20 30天(d)诱导出不定芽。根据秋季田间(露地)适宜 定植时间(陕西定植时间为8月下旬)，可继代1 3代，延长培养时间。春结 球甘蓝自交系BMP01-88-561336的早代诱芽率91.5%，分化率135% (图2-1)。
② 不定根的诱导
待不定芽生长至1. 5 2. 5cm高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶 内的不定芽诱导根培养基上，不定芽诱导根培养基为，在MS培养基中加入 3%蔗糖(质量)、0.8%琼脂(质量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NAA)。 在温度25°C，每天10h 12h光照，光照强度2000 2500Lx的条件下培 养，经15 20天(d)诱导生根，生根率100%。
③ 再生苗移栽
将有再生苗的培养瓶口打开锻炼3 5天(d)，从培养瓶中取出再生苗， 洗去根部的培养基，移植到装有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长。在8 月下旬，当再生苗有5 7片真叶时(图2-3)，适应性炼苗7天(d)后定 植于田间(露地)。秧苗成活率97%，以后管理同于常规田间(露地)管理。
权利要求
1. 一种春结球甘蓝育种保持自交系春性的繁殖方法，其特征在于，包括下列步骤1)外植体选择以春季正常栽培春结球甘蓝自交系，将入选的春性表现优良的植株叶球的外层绿色叶片，切成1cm2左右的小片作为离体培养的外植体；2)不定芽的分化诱导把外植体接种到培养瓶内的不定芽分化诱导培养基上，在温度25℃，每天12h～14h光照，光照强度2000～2500Lx条件下培养，经20～30天诱导出不定芽；所述的不定芽分化诱导培养基的配方是在MS培养基的基础上，加入3％蔗糖(质量)、0.8％琼脂(质量)、3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)及0.4mg/L的α-萘乙酸(NAA)；3)不定芽的生根诱导待不定芽生长至1.5～2.5cm高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶内的不定芽诱导根培养基上，在温度25℃，每天10h～12h光照，光照强度2000～2500Lx的条件下培养，经15～20天诱导生根，获得再生苗；所述的不定芽诱导根培养基为在MS培养基中加入3％蔗糖(质量)、0.8％琼脂(质量)和0.5～1.0mg/L的α-萘乙酸(NAA)。4)再生苗的锻炼与移栽将有再生苗的培养瓶口打开锻炼3～5天，从培养瓶中取出再生苗，洗去根部的培养基，移植到装有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长，在秋季，当再生苗有5～7片真叶时，适应性炼苗7天后定植于田间露地。
全文摘要
本发明公开了一种春结球甘蓝育种保持自交系春性的繁殖方法，在春季选取春结球甘蓝自交系的成熟叶球的外层绿色叶片，按照一定大小接种在不定芽分化诱导培养基上培养，当不定芽生长至1.5～2.5cm高时，转接到不定根分化诱导培养基中培养获得完整再生苗。随后将再生苗移至培养土中进行培养，当幼苗生长有5～7片真叶时，适应性炼苗7天后定植于田间(露地)，秧苗成活率达95％以上。采用本发明方法能够提高春结球甘蓝育种效果，保证春结球甘蓝自交系在春季完成结球期和在此期的植株农艺性状选择，并保持所选植株特性(春性)不变，保证自交系完成生活周期；能够大幅度提高自交系同一基因型植株数量，扩繁株数50倍以上。
文档编号A01H4/00GK101473791SQ20091002110
公开日2009年7月8日 申请日期2009年2月11日 优先权日2009年2月11日
发明者张恩慧, 张高翔, 朱守亮, 李宏伟, 杨安平, 程永安, 许忠民, 马青山 申请人:西北农林科技大学