专利名称：一种鉴定结球甘蓝—大白菜异附加系的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定结球甘蓝-大白菜异附加系的方法，属于分子遗传学理论应 用与育种技术领域。
背景技术：
^n 1ξ[" M (Brassica oleracea var. capitata L.，CC)禾口；^ 白胃(Brassica campestris L. ssp. pekinensis (Lour)Olsson, AA)都是芸薹属中的重要蔬菜，在我国蔬菜 生产和人民生活中占有重要的地位。创建结球甘蓝-大白菜异附加系是进行遗传理论研究 和利用大白菜有益基因对结球甘蓝进行品种改良的重要途径。由于结球甘蓝和大白菜的染 色体均较小，相邻染色体形态又非常相似，仅通过传统细胞学方法很难准确识别每一条染 色体。随着分子细胞遗传学的发展，rDNA-荧光原位杂交和基因组原位杂交成为染色体准 确识别和异附加系中外源染色体精确鉴定的有效工具，但由于rDNA在大白菜和结球甘蓝 基因组中的位点数有限，仅能识别部分染色体。可见在结球甘蓝背景下准确识别大白菜的 不同染色体十分困难，这也就制约了结球甘蓝-大白菜异附加系在育种实践和遗传理论研 究中的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种鉴定结球甘蓝-大白菜异附加系的方法，该方法既提高了 鉴定的效率和准确性，又使获得的异附加系在实验室间具有很好的交流性，为利用大白菜 基因改良结球甘蓝遗传背景奠定基础。本发明的基本原理是利用大白菜连锁群相对于结球甘蓝的特异SSR标记，以杂 交种及其亲本结球甘蓝、大白菜及异附加系基因组DNA为模板进行PCR扩增，比较它们的扩 增产物，若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与结球甘蓝一致，则表明异附 加系中没有附加大白菜的该连锁群，若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与 杂交种一致，则表明异附加系中附加了大白菜的该连锁群。本发明的特点是利用大白菜不同连锁群相对于结球甘蓝特异的SSR标记，在分 子水平鉴定结球甘蓝_大白菜异附加系中附加的大白菜连锁群。具体地，本发明通过以下 步骤完成(1)根据已发表的芸薹属A基因组遗传图谱，选用了位于芸薹属A基因组10个连 锁群的207个SSR标记，SSR引物序列由上海生工生物技术有限公司合成；(2)CTAB法提取不同品种的结球甘蓝和大白菜的基因组DNA，以其为模板进行 上述SSR标记的PCR扩增。每个PCR反应体系为20 μ L，含模板DNA 30ng，正反引物各 0. 2 μ mol · Γ1，IOx PCR Buffer (含 Mg2+)，2. 5mmol · L-1 dNTPs, IU Taqase，余体积用 ddH20 补齐。PCR扩增程序为，为94°C预变性2min ；94°C变性Imin, 55 60°C复性30s，72°C延伸 45s，35个循环；72°C延伸5min，4°C保存；(3)扩增产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染检测；
(4)筛选大白菜连锁群相对于结球甘蓝特异的SSR标记。筛选在结球甘蓝中没有 扩增产物，而大白菜中有扩增产物的标记，或在二者中都有扩增产物，但大白菜的扩增产物 不同于结球甘蓝扩增产物的标记，作为大白菜连锁群相对于结球甘蓝的特异SSR标记；(5)利用筛选到大白菜连锁群相对于结球甘蓝的特异SSR标记，以杂交种及其亲 本甘蓝、大白菜及异附加系基因组DNA为模板进行PCR扩增，鉴定结球甘蓝-大白菜异附加 系若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与结球甘蓝一致，则表明异附加系 中没有附加大白菜的该连锁群，若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与杂交 种一致，则表明异附加系中附加了大白菜的该连锁群。本发明的技术效果是从分子水平鉴定结球甘蓝-大白菜异附加系，既提高到了 鉴定的准确性，又使通过这种方法鉴定的异附加系在不同的实验室间具有很好的交流性。
图1是33个特异SSR标记在10个甘蓝品种和9个大白菜品种中的扩增结果。图1中的标号代表的含义1，中甘自交系 2，日本铁头一号 3，极早甘蓝 4， 83125，中甘11 6，京丰一号 7，中甘17 8，中甘18 9，中甘19 10，晚丰甘蓝 11， 78-13 12，京春娃娃菜 13，小杂56号 14，京夏王 15，北京改良67号 16，北京大牛心 17，北京80号18，北京新一号19，北京新三号。图2是大白菜连锁群特异SSR标记在杂交种及其亲本和结球甘蓝_大白菜异附加 系中的扩增结果。图2中的标号含义如下1、大白菜2、结球甘蓝3、杂交种4、异附加系。以下结合附图和发明人给出的具体实施例对本发明进一步进行详细说明。
具体实施例方式依照本发明的技术方案，结球甘蓝-大白菜异附加系的鉴定方法，具体实施步骤 为(1)根据已发表的芸薹属A基因组遗传图谱，选用了位于芸薹属A基因组连锁群的 207个SSR标记，SSR引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。(2)将10个甘蓝品种(多代自交亲本‘中甘’；春季早熟品种‘日本铁头一号’， ‘极早甘蓝’，‘8312’，‘中甘11’;春季中熟品种‘京丰一号’；春秋兼用早熟品种‘中甘17’; ‘中甘18’秋季中熟品种‘中甘19’ ；秋季晚熟品种‘晚丰甘蓝’)和9个大白菜品种(多 代自交亲本‘78-13’ ；极早熟品种‘京春娃娃菜’；早熟品种‘小杂56号’，‘京夏王’；中 早熟品种‘北京改良67号’；中熟品种‘北京大牛心’；中晚熟品种‘北京80号’；晚熟品 种‘北京新一号’，‘北京新三号’)种子播种于穴盘，常规管理，当幼苗长到2 3片真叶 时，剪取幼嫩新叶，采用CTAB法提取基因组DNA。以这些材料基因组DNA为模板，以获取的 甘蓝连锁群SSR引物进行PCR扩增。每个PCR反应体系为20 μ L，含模板DNA 30ng,正反引 物各 0. 2 μ mol · ΙΛ IOx PCR Buffer (含 Mg2+)，2. 5mmol · L-1 dNTPs, IU Taqase，余体积用 ddH20补齐。PCR扩增程序为，为94°C预变性2min ；94°C变性lmin，55 60°C复性30s，72°C 延伸45s，35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。(3)扩增产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，采用银染法检测，并照相。(4)筛选大白菜连锁群相对于结球甘蓝特异的SSR标记，其筛选的标准如下大白 菜上有扩增片段，而结球甘蓝上没有扩增片段的；或是二者均有扩增片段，但扩增片段大小 存在差异的。结果表明，33个SSR标记能够在结球甘蓝、大白菜间扩增出有差异的片段。 这33个SSR标记涉及了大白菜的10个连锁群(表2)，在结球甘蓝和大白菜中的扩增结果 如图版1。(5)利用这33个大白菜连锁群相对结球甘蓝的特异SSR标记，以杂交种及其亲本 结球甘蓝、大白菜及异附加系基因组DNA为模板进行PCR扩增，比较它们的扩增产物，若某 连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与结球一致，则异附加系中没有附加大白菜 的该连锁群，若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与杂交种一致，则异附加 系中附加了大白菜的该连锁群。结果表明，该异附加系对位于大白菜A7连锁群的2个SSR 标记Nal2A02b、Ra2A05b(图2，A7)扩增出与杂交种相同的片段，而对位于其他连锁群引物 的扩增结果均与结球甘蓝一致(图2，A1-A6、A8-A10)，这就表明，该异附加系是附加1条大 白菜染色体的单体异附加系，这1条外源染色体与大白菜A7连锁群相对应。
权利要求
一种鉴定大白菜 甘蓝异附加系的方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据已发表的大白菜遗传图谱，选用了位于大白菜10个连锁群的207个SSR标记，合成SSR引物序列；(2)提取不同品种的大白菜和甘蓝的基因组DNA，以其为模板进行上述SSR标记的PCR扩增；(3)扩增产物在10％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染法检测；(4)筛选大白菜连锁群相对于结球甘蓝特异的SSR标记，其筛选的标准如下大白菜上有扩增产物，而结球甘蓝上没有扩增产物的，或是二者均有扩增产物，但扩增产物片段大小存在差异的标记；(5)利用筛选到的大白菜连锁群相对于结球甘蓝的特异SSR标记，以杂交种及其亲本大白菜、结球甘蓝及异附加系基因组DNA为模板进行PCR扩增，比较它们的扩增产物，若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与结球甘蓝一致，则说明异附加系中没有附加大白菜的该连锁群，若某连锁群中的特异引物在异附加系中的扩增产物与杂交种一致，则表明异附加系中附加了大白菜的该连锁群。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定结球甘蓝—大白菜异附加系的方法。该方法包括(1)根据已发表的甘蓝遗传图谱，选用了位于大白菜10个连锁群的207个SSR标记，引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。(2)提取不同结球甘蓝和大白菜品种的基因组DNA，PCR扩增。(3)扩增产物电泳分离，银染检测。(4)筛选大白菜连锁群相对于结球甘蓝特异的SSR标记。(5)利用大白菜连锁群相对于结球甘蓝特异的SSR标记，鉴定结球甘蓝-大白菜异附加系。由于大白菜和甘蓝染色体小且形态相近，在细胞水平很难准确鉴定，本发明可以实现分子水平快速、准确鉴定大白菜-结球甘蓝异附加系、异代换系、易位系等重要的遗传分析材料，为利用大白菜基因改良结球甘蓝遗传背景奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK101956012SQ201010297749
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者李晓峰, 李雪姣, 王彦华, 申书兴, 罗双霞, 轩淑欣, 陈雪平, 顾爱侠 申请人:河北农业大学