专利名称：：一种蛋清内注射leptin的方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋清内注射leptin的方法，具体地讲，本发明涉及一种以leptin作为信号物质介导对肉鸡子代早期生长发育的程序化作用，属于动物生长调节
技术领域：
。二
背景技术：
：二十一世纪，肥胖成为重要的公共健康问题而越来越为世人所关注。我国随着经济的发展和物质生活的改善，越来越多的儿童已悄然加入了肥胖者的行列，肥胖儿童已占儿童总数的10%，并正以每年8%的速度递增。在对动物食品品质的要求日益提高的今天，由于肉用畜禽的脂类沉积直接关系肉品质量，动物的肥胖问题也不容忽视。研究发现，肥胖与生命早期的营养状况密不可分，胚胎和新生期的营养与脂肪细胞数量和肥大直接相关。目前，"肥胖程序化"的研究己经成为当今世界生命科学研究的前沿，其中母源性激素信号的介导作用更成为该研究的焦点。母源性激素作为反映母体营养和代谢状况的媒介，在子代生长发育过程中扮演着十分重要的角色，这些激素包括性腺激素(gonadalhormones)、糖皮质激素(glucocorticoids)、甲状腺激素(thyroidhormones)和促生长类激素以及反映机体能量平衡和脂肪代谢状况的胰岛素(insulin)和瘦素(leptin)等。自1994年小鼠的o6基因及其人类的同源序列被克隆以来，对W基因编码的蛋白质leptin的研究一度成为热点。L印tin能抑制脂肪的蓄积、维持脂肪细胞的正常大小，其水平是反映动物机体脂肪蓄积量的信号，作为反映能量摄取、脂肪含量及组成状态的传入信号，参与动物体重稳态的反馈调节。此外，leptin作为母子信息传递的媒介物质，在肥胖的程序化研究中也倍受关注。近年来，leptin在肥胖程序化中的作用逐渐被人们认识。对噬齿类和反刍类的研究表明，母体循环leptin浓度可能是提供给胎儿关于现在和潜在的营养环境的关键信号。这个信号可能"指导"胎儿和新生儿完成"脂-脑"反馈调节环的早期发育，并最终主导成年后能量平衡和体重稳态调节模式。与哺乳动物不同，肝脏不但是禽类leptin的合成和分泌的主要场所，同时又是禽类最重要的脂肪代谢器官，然而母源性leptin或禽类胚胎发育早期l印tin处理是否会影响胚胎和新生雏鸡肝脏leptin合成和分泌，并对肝脏脂肪代谢模式产生程序化影响，尚未见报道。有文献报道(PoultryScience2008Sep.87:1810—1817)，以三黄肉鸡为实验对象，观察到日粮添喂半胱胺导致母鸡肝脏leptin合成、分泌以及蛋中leptin沉积发生变化，同3时伴随子代维鸡早期生长受到影响，提出leptin可能作为一种信号物质介导半胱胺对肉鸡子代生长程序化影响的假说，认为蛋中沉积的leptin会改变子代肝脏leptin合成及其功能，并影响子代生长早期肝脏脂肪酸合成关键因子的表达，从而改变子代早期的生长和代谢模式。
发明内容技术问题本发明提出了一种蛋清内注射leptin的方法，往蛋清内注射一定浓度的leptin后，leptin抑制肉鸡胚胎发育，降低出雏重，却促进出雏后肉鸡的早期生长发育，leptin可能作为信号物质介导对肉鸡子代早期生长发育的程序化作用。技术方案一种蛋清内注射leptin的方法，其特征在于孵化前，对种蛋小头端进行消毒，用蟾蜍脊髓穿刺针轻轻在消毒部位钻孔，用微量进样器通过钻孔向蛋清内导入leptin注射试剂，石蜡封口。包括a、器械准备玻璃棒、微孔滤器、蟾蜍脊髓穿刺针、10-25mL钠钙玻璃模制注射剂瓶、碘酊、酒精棉、巻纸、酒精灯、lmL—次性注射器；b、试剂准备NaCl、Na2HP04.12H20、NaH2P04.2H20、双蒸水、小鼠重组leptin(498-OB-01M,R&D，USA)、石蜡；C、操作步骤(1)孵化箱消毒；微孔滤器、蟾蜍脊髓穿刺针、10-25mL钠钙玻璃模制注射剂瓶高压灭菌；(2)种蛋称重、甲醛熏蒸消毒、分组；(3)小鼠重组leptin溶液的配制①PBS(0.01M，pH7.4)配方NaC18.0g，Na2HP04.12H203.23g，NaH2P04.2H200.45g，加蒸馏水至1000ml，调pH值7.4;②将PBS高压灭菌；③在消毒灭菌的超净工作台中，用高压灭菌后的PBS配制leptin溶液，微孔滤器过滤后，盛入高压灭菌后的钠钙玻璃模制注射剂瓶中，密封待用；(4)蛋清内注射①鸡蛋消毒将鸡蛋移入开放式超净工作台，手持鸡蛋，小头朝上，碘酊消毒，体积比75%酒精脱碘；②打孔将消毒后的鸡蛋小头朝上置于蛋拖上，用蟾蜍脊髓穿刺针在小头顶端位置打孔，入针位置以刚好突破内壳膜，旋转针尖，扩大针眼方便注射；③注射用lmL—次性注射器吸取注射液，由打孔处导入100nlleptin溶液，然后4用石蜡封孔；(5)入孵在孵化器中随机排列鸡蛋，孵化。有益效果与现有技术相比，本发明的蛋清内注射leptin的方法及其引发的生物学效应具有以下优点(1)本发明的蛋清内注射leptin的方法简单，并且可排除其他未知因素的影响，单纯研究蛋中高水平的leptin沉积对胚胎和新生雏鸡生长发育的影响。(2)通过本发明技术提出了蛋清内注射leptin对肉鸡胚胎发育的影响，并证实这种影响伴随禽类胚胎肝脏leptin合成与分泌、以及新生雏鸡肝脏脂质代谢模式的改变。G)通过本发明提出了蛋清内注射leptin抑制肉鸡胚胎发育，但是出雏后生长速度加快，肝脏脂肪代谢模式发生改变，并且leptin对胚胎发育和出雏后生长的影响存在不同的时效性和性别特异性。此外，蛋内注射leptin影响出雏后肉鸡生长和代谢的机制可能有甲状腺激素和生长轴基因的参与。具体实施例方式用75%酒精对种蛋小头端进行消毒，用蟾蜍脊髓穿刺针轻轻在消毒部位钻孔，用微量加样器通过钻孔向蛋清内导入特定体积和浓度leptin注射溶剂，石蜡封口；鸡蛋正常孵化；观察肉鸡胚胎、新生雏鸡和出雏后快速生长期的生长情况，研究不同发育阶段肝脏leptin合成及其受体的变化，并比较肝脏脂肪酸合成关键因子表达的差异。包括a、器械准备玻璃棒、微孔滤器、蟾蜍脊髓穿刺针、10-25mL钠钙玻璃模制注射剂瓶、碘酊、酒精棉、巻纸、酒精灯、lmL—次性注射器；b、试剂准备NaCl、Na2HP04.12H20、NaH2P04.2H20、双蒸水、小鼠重组leptin、石蜡；c、步骤(1)孵化箱消毒；微孔滤器、蟾蜍脊髓穿刺针、10-25mL钠钙玻璃模制注射剂瓶高压灭菌；(2)种蛋称重、甲醛熏蒸消毒、分组；(3)特定的小鼠重组leptin溶液的配制①PBS(0.01M，pH7.4)配方NaC18.0g，Na2HP04.12H203.23g，NaH2P04.2H200.45g，加蒸馏水至1000ml，调pH值7.4;②将PBS高压灭菌；③在消毒灭菌的超净工作台中，用高压灭菌后的PBS配制特定浓度的leptin溶液，5微孔滤器过滤后，盛入高压灭菌后的钠钙玻璃模制注射剂瓶中，密封待用(现配现用)；(4)蛋清内注射①鸡蛋消毒将鸡蛋移入开放式超净工作台，手持鸡蛋，小头朝上，碘酊消毒，75%酒精脱碘；②打孔将消毒后的鸡蛋小头朝上置于蛋拖上，用蟾蜍脊髓穿刺针在小头顶端位置轻巧快速打孔，入针位置以刚好突破内壳膜，稍微旋转针尖，扩大针眼方便注射；③注射用lmL—次性注射器吸取注射液，由打孔处导入一定体积的注射液(体积均为100pl，对照组导入PBS溶液，试验组导入新鲜配制的leptin溶液)，然后用石蜡封孔；使用的lmL—次性注射器每次导入6-8枚鸡蛋，更换注射器，各组轮换进行；(5)入孵在孵化器中各组鸡蛋随机排布，在相同条件(温度为37.5-37.8。C，相对湿度为50-70%)下同时开始孵化。种蛋在入孵24h设定为1胚龄，分别于胚胎期、出雏期和快速生长期选取特定时间点对肉鸡的生长情况进行观测，并采取相应组织样品，进行相关分子生物学分析。实施例l选用三黄肉鸡种蛋，随机分为两组，对照组在蛋清内注射100pL溶剂(PBS)，试验组注射100nL含0.5吗小鼠重组leptin(498-OB-01M，R&D，USA)(PhysiolRes2003;52(2):201-9)的PBS。分别于12、17胚龄和出雏当天(0日龄)称重并采取血样及肝脏组织样品。用放射免疫分析法测定血清和肝脏leptin浓度，实时荧光RT-PCR定量肝脏LEPR和脂肪代谢相关基因，用Westernblot测定肝脏LEPR蛋白含量。结果表明，leptin处理组出雏重极显著降低(户=0.000)，而肝体指数显著升高(尸=0.018)，特别是雌性差异极显著(出雏重和肝体指数均为户=0.000)(见表l-l、1-2)。12胚龄和0日龄试验组肝脏leptin含量显著高于对照组(户=0.053，0.041)(见表1-3)，同时伴随0日龄试验组血清中leptin的含量极显著升高(尸=0.009)(见表1-4)，然而0日龄时肝脏LEPR的mRNA表达和蛋白含量均未发现显著差异。试验组肝脏TG和Tch含量显著下降，而血清中TG和Tch浓度却显著升高(见表l-5)，血清ApoB的水平升高，提示脂质转运出肝加强；试验组肝脏中ACC和FASmRNA的表达没有差异，但是SREBP-1mRNA的表达显著升高，提示肝脏脂肪酸合成潜力增强。并且这些肝脏脂质代谢指标的变化也表现性别特异性，leptin对雌性的影响更为显著。以上结果提示蛋内注射leptin抑制肉鸡胚胎发育，降低出雏重，提高胚胎发育过程中肝脏leptin含量和血清leptin浓度，并影响新生雏鸡肝脏脂质代谢。6表l-l蛋内注射leptin对胚胎期肉鸡体重、肝重和肝体指数的影响参数体重(g)肝雌(mg)鹏激(％)分组12胚龄17胚龄0日龄对照组5.71±0.2417.88±0.7436.34±0.32试验组5.54±0.2016.92±0.4133,30±0,65**对照组120.9±2.8392.8±25.7亂0±22.0试验组99.6±7.6*358.0±12.6亂7±16.1对照组2.13±0.072.19'±0.072.21±0,06试验组1.78±0.08**2.10±0.042,42±0.07*数据表示的是平均值±标准误，*表示相同胚(日)齢试验组与对照组相比差异显著<^<0.05)，**表示相同胚(日)齢试验组与对照组相比差异极显著(尸<0.01)，n=12。表l-2蛋内注射leptin对不同性别新生雏鸡体重、肝重和肝体指数的影响参数雄性雌性对照组试验组对照组13式验组体重(g)肌间脂肪带宽度(cm)肌间脂肪带相对宽度肝鹏(mg),識(％)崩,激36.49±0.750.30±0.020.82±0.07862.1±17.12,44±0.1098.0±8.20.276±0.01633.17±1.150.26±0.020.79±0,07788.0±23.3*2.40±0.1378.2±3.5**0.236±0.004*36.25±0.320.28±0.020.73±0.06764.1±22.52.11±0.0698.6±6.60.273士0.01933.06±0,61**0.29±0.020.92±0.07*804.7±22.72.43±0.06**83.7±4.70.253±0.014数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.05)，**表示试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01),n=7。表1-3蛋内注射l印tin对胚胎期肉鸡肝脏leptin含量的影响参数对照组试验组数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.05),n=5-12。712胚龄17胚龄0日龄14.77±1.4017.20±1.4711.51±0.3510.36±0.7410.80±0.799.92±1.3542.71±4.0639.60±5.1947.39±6.6718.86±1.31*21.39±1.1817.85±1.60*11.07±0.7011.10±1.2711.05±0.9758.06±5.42*48.55土6.5771.38±5.21*组性性组性性组性性整緞雌整雄雌整雄雌表1-4蛋内注射leptin对新生雏鸡血清中leptin浓度的影晌<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(f<0.05)，**表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.01)，n=5-12。表1-5蛋内注射leptin对新生雏鸡血清及肝脏脂类代谢指标的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.05)，**表示试验组与对照组相比差异显著(P〈0.01)'n=7-14。实施例2选取本实验挑选蛋重相近的三黄肉鸡种蛋，随机分为三组对照组(control,Con)在蛋清内注射100溶剂(PBS)，leptin处理组分别注射0.5ng/100pLPBS(低剂量组，LL)和5.0ng/100PBS(高剂量组，HL)的小鼠重组leptin,出雏后饲养至21日龄时采取肝脏和血清样品。用放射免疫分析法测定肝脏和血清中leptin和甲状腺激素的浓度，用Westernblot测定雏鸡肝脏LEPR蛋白含量，实时荧光RT-PCR定量肝脏LEPR和脂肪代谢相关基因表达。结果表明，蛋内注射leptin影响肉鸡出雏后早期生长，并呈现性别特异性和剂量依赖性(见表2-l、2-2、2-3)。无论低剂量还是高剂量，leptin处理组肉鸡的出雏重均低于对照组(P=0.042，0.154)，低剂量组差异显著，并且主要针对雌性(P=0.005，0.094)。然而，两个处理组出雏后生长速度均高于对照组。21日龄时，蛋内注射leptin的肉鸡体重均显著高于对照组(P=0.042，0.003)。此外，HL组雄性肉鸡肌间脂肪带宽度显著增加(P:0.018)(见表2-4)，同时伴随肝脏leptin(P=0.036)、血清leptin(P=0.053)、FT3(P=0.021)和T3(P=0.034)水平显著升高(见表2-5)，肝脏与血清中Tch浓度升高(见表2-6)，同时肝脏中SREBP-1、ACC、ApoB、GHR和IGF-I的表达均显著上调(P=0.052，0.017，0.010,0.028，0.020)。以上结果提示蛋内注射leptin抑制肉鸡胚胎发育，但是出雏后生长速度加快，肝脏脂肪代谢模式发生改变，并且leptin对胚胎发育的影响以低剂量显著，主要针对雌性，而对出雏后生长的影响却主要表现在高剂量，主要针对雄性，说明不同剂量leptin的作用存在不同的时效性和性别特异性。此外，蛋清内注射leptin影响出雏后肉鸡生长和代谢的机制可能有甲状腺激素和生长轴基因的参与。表2-1蛋内注射leptin对肉鸡新生早期体重和相对增重的影响(g)体重ConIXHL出雏重37.1±0.435.5±0.5*36.1±0.4第l周体重72.2±1.870.2±3.978.4±1.4*第1周增重34.6±1.733,8±3,643.4±1.6**第2周体重154.1±5.1155.9±10.0177.0±5.2**第2周增重81.8±3.985.8±6.797.4±3.9**第3周体重256.2±3,8297.1±19.3*313.6±10.8**第3周增重112.0士2.7143.0±8,7**136.6±6,2"数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示试验组与对照组相比差异显著(f<0.01)，n=20。表2-2蛋内注射leptin对雄性肉鸡新生早期体重和相对增重的影响(g)体重ConIXHL出雏重36.7士0.637.2±0.736.5±0.6第l周体重73.5±3.177.2±2.681.9±1"第l周增重35.5±2.939.8±2.447.2±1.6**第2周体重161.7±8.7172.9±8.5196.7±5.7**第2周增重88.3±6.595.6±6.4111.5±4.2*第3周体重252,2±8.2323.7土17.2*357.4±10.6**第3周增重112.1±7.6158.0±6，160.7±5.9**数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示试验组与对照组相比差异显著(P<0.01)，n=8-13。表2-3蛋内注射leptin对雌性肉鸡新生早期体重和相对增重的影响(g)体重ConIX出雏重37,6±0.534.2±0.5**35.8±0.8第1周体重71.6±1.759.8±5.9**76.3±1.7第l周增重34.2±1.524.2±5"40.5±1.9第2周体重150.3±4.1127.1±9.7**161.3±3.7第2周增重78.7±2.967.4±4.5*85.9±2.6第3周体重259.9±4.1244.9±11.9277.3±5.1*第3周增重111.9±1.7112.3±2.5118.1±3.09数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.05)，**表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.01),n=6-12。表2-4蛋内注射leptin对21日龄肉鸡器官/组织生长的影响参数分组ConIX整组0.72±0.050.75±0.020.75±0.04肌间脂肪带宽度(cm)雄性0,58±0.040.75±0.03*0.74±0.05*雌性0.84±0.030.76±0.040.76±0.06整组0.26±0.020.26±0.020.24±0,01肌、顿鹏+iM雄性0.20±0.010.20±0.010.21±0.01雌性0.33±0.010.31±0.010.27±0.02*整组7.01±0.278.82±0.55**7.66±0.32肝鹏(mg)雄性7.09±0.529.62±0.49**8.14±0.41雌性6.95±0.327.85±0.947,24±0.46整组2.57±0.092.86土0.162.45±0.09月稱激(％)雄性2.37±0.072.60±0.142.29±0.05雌性2.72±0.113.17±0.252.59±0.15整组0,83±0.060.98±0.080.95±0.03雄性0.94±0.131.22±0.02**1.06±0.04雌性0.75±0.030.69±0.030.86±0.02**整组0.298±0.0090.309士0.0090.303±0.005《蹈雄性0.307±0.0200.330±0.0050.298±0.006雌性0.293±0.0070.284±0.0110.307±0.008数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(P〈0.05)，**表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.01)，n=6-15。表2-5蛋内注射leptin对21日龄肉鸡肝脏和血清激素含量的影响参数分组ConIXHL肝脏leptin(ng/gT-protein)整组雄性雌性41.9±6329.0±5,951.1±9.240.2±6.331.2±3.953.9±11.164.1±9.7*58.0±13.6*68.6±13.3血清leptin(ng/mL)整组雄性1.14±0.071.16±0.061.05±0.051.08±0,041.26±0.091.34±0.07*雌性1.11±0.131.02±0.101.18±0.16血清FT3整组1.15±0.061.45±0.181.57±0.15*10(pg/mL)血清T3(ng/mL)血清T4(ng/mL)雄性1.28±0.061.73±0.221.90±0.16*雌性1.06±0.081.04±0.131.04±0.02整组1.50±0.131.61±0.131.67±0.15雄性1,77±0.101.89±0.082.08±0.11*雌性1.01±0.011.04±0.061.12±0.03整组59.2±1.858.8±1.560.3±1.5雄性61.5±2.76U±1.362.2±2.2雌性56.1±1.654.3±2.658.0±1.9数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(P<0.05)，"表示试验组与对照组相比差异显著(尸<0.01),n=6-15。表2-6蛋内注射l印tin对21日龄肉鸡血清及肝脏脂类代谢参数的影响肝脏TG(mmol/gliver)血清TG(mmol/L)肝脏Tch(mmol/gliver)血清Tch(mmol/L)血清ApoB(g/L)分组ConIXHL整组24.13±1.1922.31±0.7624.98±1.05雄性22.45±1,5622.09±0.9325.78±0.97雌性25.39±1.6522.90±1.4924.29±1.81整组0.30±0.030.37±0.060.23±0.03雄性0.27±0.050.24±0.030.21±0.04雌性0.34±0.020.58±0.04**0.27±0.03整组4.74±0.144.73±0.245.90±0.45*雄性4.68±0.144.88±0.406.79±0.70**雌性4.73±0.304.59±0.295.14±0.44整组3.34±0,153.79±0.224.33±0.20"雄性3.50±0.133.74±0.304.87±0.22**雌性3.04±0.213.99±0.43*3,79±0.19*整组0.140±0.0150.142±0.0130.121±0.012雄性0.150±0.0270.132±0.0170.110±0.018雌性0.137±0.0200.153±0.0200.133±0.013数据表示的是平均值±标准误，*表示试验组与对照组相比差异显著(P<0.05),**表示试验组与对照组相比差异显著(P<0.01)，n=6-15。1权利要求1、一种蛋清内注射leptin的方法，其特征在于孵化前，对种蛋小头端进行消毒，用蟾蜍脊髓穿刺针轻轻在消毒部位钻孔，用微量进样器通过钻孔向蛋清内导入leptin注射试剂，石蜡封口。2、根据权利要求l所述一种蛋清内注射leptin的方法，其特征在于a、器械准备玻璃棒、微孔滤器、蟾蜍脊髓穿刺针、10-25mL钠钙玻璃模制注射剂瓶、碘酊、酒精棉、巻纸、酒精灯、lmL—次性注射器；b、试剂准备NaCl、Na2HP04.12H20、NaH2P04.2H20、双蒸水、小鼠重组leptin、石蜡；C、操作步骤(1)孵化箱消毒；微孔滤器、蟾蜍脊髓穿刺针、10-25mL钠钙玻璃模制注射剂瓶高压灭菌；(2)种蛋称重、甲醛熏蒸消毒、分组；(3)小鼠重组leptin溶液的配制①PBS(0.01M，pH7.4)配方NaCl8.0g，Na2HP04.12H203.23g，NaH2P04.2H200.45g，加蒸馏水至1000ml，调pH值7.4;②将PBS高压灭菌；③在消毒灭菌的超净工作台中，用高压灭菌后的PBS配制leptin溶液，微孔滤器过滤后，盛入高压灭菌后的钠钙玻璃模制注射剂瓶中，密封待用；(4)蛋清内注射①鸡蛋消毒将鸡蛋移入开放式超净工作台，手持鸡蛋，小头朝上，碘酊消毒，体积比75%酒精脱碘；②打孔将消毒后的鸡蛋小头朝上置于蛋拖上，用蟾蜍脊髓穿刺针在小头顶端位置打孔，入针位置以刚好突破内壳膜，旋转针尖，扩大针眼方便注射；③注射用lmL—次性注射器吸取注射液，由打孔处导入10(^lleptin溶液，然后用石蜡封孔；(5)入孵在孵化器中随机排列鸡蛋，孵化。全文摘要本发明公开了一种蛋清内注射leptin的方法，属于动物生长调节
技术领域：
。孵化前，对种蛋小头端进行消毒，用蟾蜍脊髓穿刺针轻轻在消毒部位钻孔，用微量进样器通过钻孔向蛋清内导入leptin注射试剂，石蜡封口。本发明往蛋清内注射一定浓度的leptin后，观察到leptin抑制肉鸡胚胎发育，降低出雏重，却促进出雏后肉鸡的早期生长发育，leptin可能作为信号物质介导对肉鸡子代早期生长发育的程序化作用。文档编号A01K45/00GK101507422SQ20091002983公开日2009年8月19日申请日期2009年3月18日优先权日2009年3月18日发明者艳胡,赵茹茜申请人:南京农业大学