专利名称：一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法
技术领域：
本发明是涉及一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，属于生物工程 技术领域。
背景技术：
细叶小羽藓(77"/ /oc/a^ww m/crap/^/wm (Hedw.)Broth.)隶属羽藓科 (7TmWaceae)的小羽藓属(//"p/oc/a&Mm)苔藓植物。植物体体形中等，黄 绿色或绿色，老时呈黄褐色，常交织成片；茎匍旬，长可达5cm以上，规则 羽状分枝，中轴分化；鳞毛披针形至线形，密生茎上，而枝上稀少或缺失；茎 叶干燥时疏松贴生，由阔卵形基部渐上成细长尖，长可达1.2mm;茎叶叶边平 展，或部分背卷，具齿，中肋一般贯顶或终止于叶尖下；枝叶阔卵形，具短披 针形尖，中肋不及顶，或略突出于叶尖；蒴柄细长，可达2cm以上，红棕色， 平滑，孢蒴弓形弯曲，长约2mm。丘林地区以腐木着生为多，其次为土生及 石生。
很多研究结果表明细叶小羽藓(//. m/crap/^/M附)的匍甸羽状分枝结构对 大气环境污染的变化十分敏感，其对Cu、 Pb、 Zn、 Cr、 Cd五种重金属的富集 能力(应用生态学报，2006， 17 (8): 1490-1494)几乎是常见几种杂草如小 飞蓬、龙葵、加拿大一枝黄花等植物茎叶体的3~10倍(上海交通大学学报 农业科学版，2002， 20 (1): 22~29)，利用它作为指示大气重金属污染具有明 显优势。因此，建立细叶小羽藓快繁系统，对研究大气重金属元素在苔藓植物 体内的迁移、分布和富集机制具有重要意义。但现有技术中还没有在试管内大 量扩繁羽藓属植物配子体的相关培养技术报道，更没有将细叶小羽藓组织培养 成配子体的相关技术报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，以填补现有技术的空白，实现人工大量快速扩繁细叶小羽藓，为研究苔藓植物 对大气重金属污染的生理响应和重金属元素在苔藓植物体内的迁移、分布和富 集机制提供便捷。
为实现上述发明目的，本发明釆用的技术方案如下
本发明提供的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，包括如下顺序步
a) 切取细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端，进行表面灭菌，然后接种 到改良Knop' s培养基上，进行培养10天，培养条件为温度25士2。C,光 照强度20001x，光照时间10小时/天；所述改良Knop' s培养基配方为改良 Knop' s基本培养基+ 0 10g/l蔗糖；
b) 将步骤a)得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上， 进行培养50天，培养条件为温度(20~35) 土2。C,光照强度30001x,光照 时间12小时/天；所述诱导新生配子体产生的培养基配方为改良Knop' s基 本培养基+ 0.1 ~ 2.0mg/l 6-节氨基嘌呤+ 0.01 ~ 0.2mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
c) 将步骤b)诱导培养得到的新生配子体切割剪碎，接种到配子体增殖扩 繁的培养基上，进行培养50天，培养条件为温度(20~35) 士2。C，光照强 度30001x，光照时间12小时/天；所述配子体增殖扩繁的培养基配方为改良 Knop' s基本培养基+ 0 ~ 0.5mg/l 6-节氨基喋呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗
糖；
所述改良Knop' s基本培养基的配方为KN03 250mg/l、 MgS04 . 7H20 250mg/l、 KH2PO4250mg/l、 Ca(N03)2 . 4H20 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/l、 NaFe-EDTA36.7mg/l、 MnS04 4H20 11.15mg/l、 H3B03 3.1mg/l、 KI0.415mgA、 ZnS04 7H20 4.3mg/l、 CuS04 5H20 0.0125mg/l、 NaMo04 2H20 0.125mg/l、 CoCl2 6H20 0.0125mg/l。
步骤a)中切取的细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端的长度优选0.3mm。
步骤a)中对细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端表面的灭菌条件优选如 下先用75%的酒精溶液灭菌20秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌2分钟。
步骤b)中的诱导新生配子体产生的培养基配方优选为改良Knop' s基 本培养基+ 0.5mg/l 6-节基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
步骤b)中的培养条件优选为温度25士2。C，光照强度3000k,光照时间
512小时/天。
步骤c)中的配子体增殖扩繁的培养基配方优选为改良Knop' s基本培养 基+ 0.2mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
步骤c)中的培养条件优选为温度25士2。C,光照强度30001x，光照时间 12小时/天。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下首次建立了组织培养 快繁细叶小羽藓配子体的方法，填补了现有技术的空白；并且，使用本发明的 快速扩繁方法，极利于高度集约化和高密度工产化生产，也利于自动化控制生 产，在短时间内可实现人工大量扩繁细叶小羽藓，为研究苔藓植物对大气重金 属污染的生理响应和重金属元素在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制提供 了便捷途径，具有明显的科研利用价值。
具体实施例方式
本发明提供的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，包括如下顺序步
a) 切取细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端，进行表面灭菌，然后接种 到改良Knop' s培养基上，进行培养10天，培养条件为温度25土2。C，光 照强度20001x，光照时间10小时/天；所述改良Knop' s培养基配方为改良 Knop' s基本培养基+ 0 10g/l蔗糖；
b) 将步骤a)得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上， 进行培养50天，培养条件为温度(20~35) ±2°C,光照强度30001x,光照 时间12小时沃；所述诱导新生配子体产生的培养基配方为改良Knop' s基 本培养基+ 0.1 ~ 2.0mg/l 6-苄氨基嘌呤+ 0.01 ~ 0.2mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
c) 将步骤b)诱导培养得到的新生配子体切割剪碎，接种到配子体增殖扩 繁的培养基上，进行培养50天，培养条件为温度(20~35) ±2°C，光照强 度3000k,光照时间12小时/天；所述配子体增殖扩繁的培养基配方为改良 Knop' s基本培养基+ 0 ~ 0.5mg/l 6-节氨基P票呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/1蔗
糖；
所述改良Knop' s基本培养基的配方为KN03 250mg/l、 MgS04 . 7H20 250mg/l、 KH2PO4250mg/l、 Ca(N03)2 4H20 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/lNaFe-EDTA36.7mg/1、 MnS04 4H20 11.15mg/l、 H3B03 3.1mg/l、 K10.415mg/1、 ZnS04 7H20 4.3mg/l、 CuS04 . 5H20 0.0125mg/l、 NaMo04 2H20 0.125mg/l、 CoCl2 6H2O0.0125mg/l。
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明 实施例1
切取长度为0.3mm的细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端，按以下灭菌 条件(先用75%的酒精溶液灭菌20秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌2分钟)进 行表面灭菌，然后接种到以下两种配方组成的改良Knop' s培养基上，分别进 行培养10天，培养条件为温度25土2。C,光照强度2000k,光照时间10小 时沃。
两种改良Knop' s培养基的配方组成如下
a) 改良Knop' s基本培养基+ Og/l蔗糖；
b) 改良Knop' s基本培养基+ 10g/l蔗糖。 培养结果分别如下
a) 获得的无菌分枝先端伸长生长，分技平均长度为5.4mm;
b) 获得的无菌分枝先端伸长生长，分枝平均长度为5.6rnrn。 由上述培养结果可以得知改良Knop' s培养基的配方组成中的蔗糖对无
菌配子体的生长状态基本没有影响。 实施例2
将实例1得到的无菌外植体转接到以下四种配方组成的诱导新生配子体 产生的培养基上，分别进行培养50天，培养条件为温度25°C，光照强度 30001x，光照时间12小时/天。
四种诱导新生配子体产生的培养基的配方组成如下
a) 改良Knop' s基本培养基+ 0.1mg/1 6-苄基氨基嘌呤+ 0.01mg/l萘乙酸 + 108/1蔗糖；
b) 改良Knop' s基本培养基+ 0.5mg/1 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 10§/1蔗糖；
c) 改良Knop' 8基本培养基+1.0111§/16-节基氨基嘌呤+ 0.111^/1萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
d) 改良Knop' 3基本培养基+ 2.0111§/16-糠基氨基嘌呤+ 0.211^/1萘乙酸+10g/l蔗糖。
培养结果分别如下
a) 无菌分枝先端伸长生长速度较缓慢，新生分枝较少，无菌分技平均长 度为2.6cm，每个分技上产生的长度超过0.5cm的新生分枝数平均为3个；
b) 无菌分技先端伸长生长速度较快，新生分枝较多，无菌分枝平均长度 为4.2cm,每个分枝上产生的长度超过0.5cm的新生分技数平均为8个；
c) 无菌分技先端膨胀变粗且伸长生长速度很缓慢，新生分枝多且短，无 菌分枝平均长度为l.lcm，每个分枝上没有长度超过0.5cm的新生分技；
d) 无菌分技先端明显变粗，颜色变得浓绿，生长速度极其缓慢，分枝上 有很多新生粒状芽点，无菌分枝平均长度为0.8cm。
由上述培养结果可以得知6-节基氨基嘌呤和萘乙酸两种激素的添加浓 度的组合不同，对配子体的生长和新分枝的诱导形成有很大影响，诱导新生配 子体产生的培养基的最优配方组成是改良Knop' s基本培养基+ 0.5mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
实施例3
将实例1得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上，按以 下四种培养条件分别进行培养50天，所述诱导新生配子体产生的培养基的配 方组成为改良Knop' s基本培养基+ 0.5mg/16-苄基氨基嘌呤+ 0.0Smg/l萘乙 酸+ 10g/l蔗糖。
四种培养条件如下
a) 温度20土2。C,光照强度30001x，光照时间12小时/天；
b) 温度25土2。C,光照强度30001x，光照时间12小时/天；
c) 温度30土2。C,光照强度30001x，光照时间12小时/天；
d) 温度35士2。C，光照强度30001x,光照时间12小时/天。 培养结果分别如下
a) 无菌配子体分枝先端均伸长生长，颜色鲜绿，平均长度为4.1cm,每个 分枝上长度超过lcm的新生分枝数平均为4个；
b) 无菌配子体分技先端均伸长生长，颜色鲜绿，平均长度为6.7cm，每个 分枝上长度超过lcm的新生分枝数平均为9个；
c) 无菌配子体分枝先端均伸长生长，颜色淡绿，平均长度为5.2cm,每个分枝上长度超过lcm的新生分枝数平均为5个；
d)无菌配子体分枝先端均伸长生长，颜色黄绿，平均长度为3.2cm,每个 分技上没有长度超过lcm的新生分枝。
由上述培养结果可以得知培养温度对于无菌配子体分技先端伸长生长状 态和新生分枝形成有显著影响，25士2。C是最适宜的培养温度，温度过高或过 低都不利于配子体的生长和新生分枝的形成，因此，诱导新生配子体产生的最 优培养条件是温度25士2。C,光照强度30001x，光照时间12小时/天。
实施例4
将实施例3中在b)培养条件诱导得到的新生配子体切割剪碎，接种到以 下四种配方组成的配子体增殖扩繁的培养基上，分别进行培养50天，培养条 件为温度25士2。C，光照强度30001x,光照时间12小时/天。
四种配子体增殖扩繁的培养基配方组成如下
a) 改良Knop' s基本培养基+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖；
b) 改良Knop' s基本培养基+ 0.1mg/1 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 10g/l蔗糖；
c) 改良Knop' s基本培养基+ 0.2mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 108/1蔗糖；
d) 改良Knop' s基本培养基+ 0.5mg/l 6-节基氨基P票呤+ 0.05mg/l萘乙酸 + 108/1蔗糖。
培养结果分别如下
a) 细碎分技上新生分枝较少，无菌分枝平均长度为2.2cm，每个细碎分枝 上产生的新生分枝数平均为1.6个；
b) 细碎分枝上新生分技较少，无菌分技平均长度为1.8cm，每个细碎分枝 上产生的新生分技数平均为2.4个；
c) 细碎分技上新生分枝较多，无菌分技平均长度为1.7cm,每个细碎分枝 上产生的新生分枝数平均为3.8个；
d) 细碎分枝上新生分枝较少，无菌分枝平均长度为l.lcm，每个细碎分枝 上产生的新生分枝数平均为4.1个。
由上述培养结果可以得知6-节基氨基嘌呤和萘乙酸两种激素的添加浓 度的组合不同，对配子体的生长和增殖有很大影响，配子体增殖扩繁培养基的
9最优配方组成是改良Knop' s基本培养基+ 0.2mg/1 6-节基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。 实施例5
将实施例3中在b)培养条件诱导得到的新生配子体切割剪碎，接种到配 子体增殖扩繁的培养基上，按以下四种培养条件分别进行培养50天，所述配 子体增殖扩繁的培养基配方为改良Knop' s基本培养基+ 0.2mg/l 6-节基氨 基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
四种培养条件如下
a) 温度20土2。C，光照强度30001x,光照时间12小时/天；
b) 温度25士2。C，光照强度30001x，光照时间12小时/天；
c) 温度30土2。C，光照强度30001x,光照时间12小时/天；
d) 温度35土2。C，光照强度30001x,光照时间12小时/天。 培养结果分别如下
a) 新生分枝颜色鲜绿，无菌分技平均长度为Ucm，每个细碎分技上产生 的新生分枝数平均为2.8个；
b) 新生分枝颜色鲜绿，无菌分技平均长度为1.7cm,每个细碎分枝上产生 的新生分枝数平均为3.8个；
c) 新生分枝颜色淡绿，无菌分枝平均长度为1.6cm,每个细碎分枝上产生 的新生分枝数平均为3.1个；
d) 新生分枝颜色黄绿，无菌分技平均长度为1.2cm，每个细碎分技上产生 的新生分枝数平均为2.9个。
由上述培养结果可以得知培养温度对于细叶小羽藓配子体生长和新生分 枝增殖有显著影响，25士2。C是最适宜的培养温度，温度过高或过低都不利于 配子体的生长和新生分技的增殖，因此，配子体增殖扩繁的最优培养条件是 温度25土2。C,光照强度30001x，光照时间12小时/天。
权利要求
1.一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特征在于，所述方法包括以下顺序步骤a)切取细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端，进行表面灭菌，然后接种到改良Knop′s培养基上，进行培养10天，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000lx，光照时间10小时/天；所述改良Knop′s培养基配方为改良Knop′s基本培养基+0～10g/l蔗糖；b)将步骤a)得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上，进行培养50天，培养条件为温度(20～35)±2℃，光照强度3000lx，光照时间12小时/天；所述诱导新生配子体产生的培养基配方为改良Knop′s基本培养基+0.1～2.0mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.01～0.2mg/l萘乙酸+10g/l蔗糖；c)将步骤b)诱导培养得到的新生配子体切割剪碎，接种到配子体增殖扩繁的培养基上，进行培养50天，培养条件为温度(20～35)±2℃，光照强度3000lx，光照时间12小时/天；所述配子体增殖扩繁的培养基配方为改良Knop′s基本培养基+0～0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.05mg/l萘乙酸+10g/l蔗糖；所述改良Knop′s基本培养基的配方为KNO3 250mg/l、MgSO4·7H2O250mg/l、KH2PO4 250mg/l、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/l、NaFe-EDTA 36.7mg/l、MnSO4·4H2O 11.15mg/l、H3BO3 3.1mg/l、KI0.415mg/l、ZnSO4·7H2O 4.3mg/l、CuSO4·5H2O 0.0125mg/l、NaMoO4·2H2O 0.125mg/l、CoCl2·6H2O 0.0125mg/l。
2. 根据权利要求1所述的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特 征在于，步骤a)中切取的细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端的长度为 0.3rnrn。
3. 根据权利要求1所述的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特 征在于，步骤a)中对细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端表面的灭菌条件如 下先用75%的酒精溶液灭菌20秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌2分钟。
4. 根据权利要求1所述的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特 征在于，步骤b)中的诱导新生配子体产生的培养基配方为改良Knop' s基本培养基+ 0.5mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
5. 根据权利要求1所述的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特 征在于，步骤b)中的培养条件为温度25士2t:,光照强度30001x,光照时间 12小时/天。
6. 根据权利要求1所述的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特 征在于，步骤c)中的配子体增殖扩繁的培养基配方为改良Knop' s基本培养 基+ 0.2mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 0.05mg/l萘乙酸+ 10g/l蔗糖。
7. 根据权利要求1所述的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，其特 征在于，步骤c)中的培养条件为温度25土2。C,光照强度30001x,光照时间 12小时/天。
全文摘要
本发明公开了一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，所述方法包括以下顺序步骤切取细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端，进行表面灭菌后接种到改良Knop′s培养基上，进行培养10天，以筛选获得无菌外植体；将得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上，进行培养50天；将诱导培养得到的新生配子体切割剪碎，接种到配子体增殖扩繁的培养基上，进行培养50天即可。本发明首次建立了组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，填补了现有技术的空白。本发明方法极利于高度集约化和高密度工产化生产，可为研究苔藓植物对大气重金属污染的生理响应和重金属元素在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制提供便捷。
文档编号A01H4/00GK101606486SQ20091005435
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者娄玉霞, 同 曹, 曾元元, 郭水良 申请人:上海师范大学