琥珀酸的用途的制作方法

专利名称：：琥珀酸的用途的制作方法琥珀酸的用途本发明涉及包含活性成分琥珀酸、其衍生物或代谢产物的营养药物组合物用于动物、尤其是猪的新颖用途。琥珀酸衍生物的特定例子包括琥珀酸盐，如琥珀酸碱金属盐、琥珀酸碱土金属盐和琥珀酸铵。如在本文中使用的，术语“营养药物性”表示在营养和药物两个应用领域中的有用性。因此，营养药物性组合物可用作完全的动物饲料(膳食)、用作为动物饲料的补剂和用作为用于肠应用或肠胃外应用的药物配制物，其可以是固体配制物或液体配制物。术语动物包括所有动物，包括人。动物的例子是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括下述动物，例如绵羊、山羊和牛，例如肉牛和奶牛。在一个具体的实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物单胃动物，例如猪或豕(swineM包括但不仅限于猪仔、生长猪(growingpig)和母猪)；家禽例如火鸡、鸭和鸡(包括但不仅限于肉鸡(broilerchick)、蛋鸡(layer))；鱼(包括但不仅限于三文鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳动物(包括但不仅限于虾和蟹)。术语饲料或饲料组合物表示适用于或旨在被动物摄入的任何化合物、制备物、混合物或组合物。有机酸在动物喂养中的用途是已知的。例如，EP-A-O683985公开了包含苯甲酸及其盐的饲料组合物，其可以被用于最小化猪场中来自有机废弃物(尤其是动物粪便和废料)的臭味氨的散发。还已知对断奶小猪膳食添加苯甲酸改善动物的畜牧学表现。还已知其他有机酸例如柠檬酸或丁酸可以在动物营养学中用作抗生素生长促进剂的可能的替代方式，尤其是对猪而言。迄今为止，琥珀酸在动物营养学中的用途尚无描述。本发明人惊讶地发现琥珀酸及其衍生物具有在动物饲料中使用的巨大潜力，例如用于改进动物的每日体重/平均增重和/或用于改进饲料转换比(FCR)。本发明人惊讶地发现琥珀酸还具有抗微生物活性以及调控动物肠菌群(gutflora)的潜力。抗微生物活性可以例如是杀菌的、抑菌的、杀真菌的、抑真菌的、和/或杀病毒的。术语“杀菌的”应当被理解为能够杀死细菌细胞；术语“抑菌的”应当被理解为能够抑制细菌生长，即抑制生长中的细菌细胞；术语“杀真菌的”应当被理解为能够杀死真菌细胞；术语“抑真菌的”应当被理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长中的真菌细胞；术语“杀病毒的”应当被理解为能够使病毒灭活。本发明的一个主要目的是提供用于在动物饲料中使用琥珀酸的组合物和方法。琥珀酸可以商业获得，或由技术人员使用现有技术中公知的工艺和方法容易地制备。然而，就动物饲料中的用途而言，琥珀酸不需要如此纯净；其可包含其它烷基衍生物，和/或如果其由微生物(例如重组或非重组的真核细胞如酵母)生产时，可提取和纯化自生物质。本发明的第二个方面是在动物喂养中使用琥珀酸，以改进每日体重/平均增重和/或饲料转换比(FCR)和/或调控动物的肠菌群。在本文上下文中，术语饲料转换比(FeedConversionRatio)或FCR与术语饲料转化率(feedconversion)作为同义词使用。FCR被计算为相对于体重增加(以g/动物表示)的饲料摄入(以g/动物表示)。本发明的第三方面涉及含有包含琥珀酸的组合物的动物饲料和预混物或添加剂组合物。琥珀酸或其衍生物可以作为常规被喂养给动物的营养组合物的组分被施用给动物。因此，琥珀酸及其衍生物可作为动物饲料的组分或在动物的饮用水中被合适地施用给动物。施用给动物的琥珀酸或其衍生物的量在以喂养给动物的每种饲料的总重为基础0.1%-5%的范围内。在本发明的一个优选的实施方案中，琥珀酸或琥珀酸衍生物以下述量使用，所述量足以对要施用琥珀酸的动物提供每kg体重300mg到每kg体重约15000mg的每日剂量。在第一个特别的实施方案中，本发明涉及在动物饲料中使用琥珀酸例如用于改进饲料转换比(FCR)和/或调控肠微生物区系的方法。在可选的实施方案中，琥珀酸通过帮助适当的消化和/或支持免疫系统功能来改进动物饲料可消化性，和/或维持动物健康。可基于小猪生长试验测定FCR，所述试验包含第一处理和第二处理，所述第一处理中以合适的每kg饲料浓度向动物饲料中添加琥珀酸，所述第二处理(对照)中不向动物饲料添加琥珀酸。如通常所已知的，改进的FCR低于对照FCR。在一些具体的实施方案中，与对照相比，FCR被改进(即降低)至少1.0%，优选地至少1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%,2.1%,2.2%,2.3%,2.4%或至少2.5%。如本文所使用的，术语“肠”是指胃肠道或消化道(也表示消化管)，其表示多细胞动物内摄入食物、消化食物提取能量和养分并排出剩余废物的器官系统。如本文所使用的，术语肠“微生物区系”是指下述天然微生物培养物，其居住在肠中，并通过帮助适当的消化和/或支持免疫系统功能来维持健康。如本文与肠微生物区系结合使用的，术语“调控”通常表示在健康和正常发挥功能的动物中改变、操作、变更或调节其功能或状态，即非治疗性用途。调控处于对琥珀酸和/或本发明微生物株系的应答中。以下是通过本发明的琥珀酸获得的肠微生物区系调控作用的非限制性具体例子(与不含本发明琥珀酸的对照相比的改变)⑴例如在小猪或肉鸡中，体内出现Salmonellaspp和/或Clostridiumperfringens的频率降低；(ii)例如在小猪禾口/或肉鸡中，体内Escherichiacoli禾口/或Enterococcusfaecalis数量降低；再进一步，仍然与肠微生物区系调控作用相关，并涉及不含本发明琥珀酸的对照，本发明的琥珀酸优选地(iii)不显著影响(例如降低)例如从小猪和/或肉鸡肠内含物中分离的有害微生物如细菌的体外生长。在第二个特别的实施方案中，本发明涉及包含含有琥珀酸的组合物的动物饲料和预混物或添加剂组合物。在小猪饲料的一个优选的实施方案中，琥珀酸或琥珀酸衍生物以下述用量使用，所述用量足以对要进行施用的受试者提供每kg体重300mg到每kg体重约15000mg的每日剂量。最终猪饲料中琥珀酸或其衍生物的量在从1到50g/kg饲料的范围内，优选地在10到20g/kg饲料的范围内，在最终家禽饲料中在1到40g/kg饲料的范围内，优选地在2到IOg/kg饲料的范围内。本发明组合物的具体例子如下-动物饲料添加剂，其包含(a)琥珀酸，(b)至少一种脂溶性维生素，(C)至少一种水溶性维生素，(d)至少一种微量矿物质和/或(e)至少一种大量矿物质；-动物饲料组合物，其包含(a)琥珀酸和50到800g/kg饲料的粗制蛋白质含量。-动物饲料组合物，其具有50到800g/kg的粗制蛋白质含量，并且包含上文定义的微生物菌株。所谓的预混物是本发明动物饲料添加剂的例子。预混物优选地是指一种或多种微量成分与稀释剂和/或运载体的均勻混合物。预混物被用于促进更大混合物中微量成分的均勻分布。另外，任选的饲料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；产生活性氧的物类；和/或至少一种选自以下的酶植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.)、磷脂酶Al(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(EC3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶，例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。多不饱和脂肪酸的例子是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和Y-亚麻酸。产生活性氧的物类的例子是化学品例如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶例如氧化酶、加氧酶或合成酶。通常，脂溶性和水溶性维生素以及微量矿物质形成旨在被添加进饲料的所谓预混物，而大量矿物质通常被单独地添加至饲料。当富含琥珀酸时，这些组合物类型中的任一一种都是本发明的动物饲料添加剂。以下是这些组分的例子的非排它性列表脂溶性维生素的例子是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的例子是维生素B12、生物素和胆碱、维生素Bi、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如D-泛酸钙。微量矿物质的例子是镁、锌、铁、铜、碘、硒和钴。大量矿物质的例子是钙、磷和钠。这些组分(以家禽和猪仔/猪为例)的营养需求列于WO01/58275的表A中。营养需求表示这些组分应当以指出的浓度在膳食中提供。5或者，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种WO01/58275的表A中所列的个体组分。至少一种表示任一种，一种或多种，一种、或两种、或三种、或四种依此类推直至所有十三种，或直至所有十五种个体组分。更特别地，该至少一种个体组分以下述用量包含在本发明的添加剂中，所述用量提供表A的第4列或第5列或第6列中所指范围内的饲料内浓度(in-feed-concentration)0动物饲料组合物或膳食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪膳食的特征可如WO01/58275的表B第2-3列中所示。鱼膳食的特征可如该表B的第4列中所示。另外，这类鱼膳食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275对应于US09/779334，其通过引用并入本文。根据本发明的动物饲料组合物具有50_800g/kg的粗蛋白质含量，并另外包含本文所述和/或要求保护的琥珀酸。另外，或(针对上文指出的粗蛋白质含量)可选地，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.l-200g/kg的钙含量；和/或0.l_200g/kg的可用磷含量；和/或0.l-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.l-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。在一些具体的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白质、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在WO01/58275的表B中范围2、3、4或5任一中(R.2-5)。粗蛋白质被计算为氮(N)乘以因数6.25，即粗蛋白质(g/kg)=N(g/kg)x6.25。氮含量通过Kjeldahl方法测定(Α.0.Α.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)。可代谢的能量可基于NRCpublicationNutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.，pp.2-6禾口EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&Iooijenbv,ffageningen.ISBN90-71463-12-5来计算。基于饲料表(feedtable)来计算完全动物膳食中钙、可利用磷和氨基酸的膳食含量，所述词料表例如Veevoedertabel1997,gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种植物蛋白或蛋白来源。其也可含有动物蛋白，例如肉粉和骨粉，和/或鱼粉，通常含量为0-25%。如在本文使用的，术语植物蛋白是指下述任何化合物、组合物、制备物或混合物，其包含至少一种衍生自或来源于植物的蛋白质，包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在具体的实施方案中，植物蛋白的蛋白质含量至少为10%、20%、30%、40%、50%或60%(w/w)0植物蛋白可衍生自植物蛋白来源，例如豆类和谷物，例如来自Fabaceae(Leguminosae)>Cruciferaceae>Chenopodiaceae禾口Poaceae禾斗植物的材料，例如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。在一个具体的实施方案中，植物蛋白来源是来自一种或多种Fabaceae科植物例如大豆(soybean)、羽扇豆、豌豆或黄豆(bean)的材料。在另一个具体的实施方案中，植物蛋白来源是来自一种或多种Chenopodiaceae科植物例如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)、菠菜或奎奴亚藜(quinoa)的材料。植物蛋白来源的其它例子是油菜籽、向日葵籽、棉籽和卷心菜。植物蛋白来源的其它例子是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(苞谷)、水稻、黑小麦和高粱。还在其它一些具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麦；和0-70%大麦；和/或0-30%燕麦；和/或0-30%黑麦；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%鱼粉；和/或0-25%肉粉和骨粉；和/或0_20%乳清。动物膳食可例如被制作为醪液饲料(mashfeed)(非丸状)或丸状的饲料。通常，将经研磨的饲料混合，并根据所述物种的规范添加足量的必需维生素和矿物质。琥珀酸和/或其衍生物可作为固体或液体配制物被添加。以下实施例进一步阐述了本发明，但是它们不应被理解为限制本发明。实施例1动物饲料添加剂通过向以下预混物(每kg预混物)中添加IOOg琥珀酸，制备动物饲料添加剂1100000IE维生素A300000IE维生素D34000IE维生素E250mg维生素Bl800mg维生素B21200mgD-泛酸钙500mg维生素B62.5mg维生素B125000mg烟酸IOOOOmg维生素C300mg维生素K315mg生物素150mg叶酸50004mg胆碱氯化物6000mgFe3000mgCu5400mgZn8000mgMn124mgI60mgCo29.7mgSe9000mg(LasalocidSodium)(Avatec)17.3%Ca0.8%Mg11.7%Na实施例2动物饲料通过混合成分制备具有以下组成(％，w/w)的生长肉鸡(broilergrower)膳食。小麦、黑麦和SBM48可得自MoulinModerneHirsinque，Hirsingue，法国。混合后，在期望的温度例如约70°C下将饲料制成丸(3x25mm)。0096]小麦46.000097]黑麦15.000098]大豆粉(SBM48)30.730099]大豆油4.900100]DL-甲硫氨酸0.040101]DCP(磷酸二钙)1.650102]石灰石0.430103]盐0.150104]Τ020.100105]动物饲料添加剂(上文)1.00得到的动物饲料每kg含有Ig琥珀酸(IOOOppm)。可以用相似的方式制备其他动物饲料和饲料添加剂组合物。实施例3体外评价琥珀酸对肠微生物区系的影响针对从胃肠微生物区系中分离的微生物体外评价琥珀酸(118，lg/mol)和柠檬酸(210，14g/mol)的比较性抗微生物活性。使用适当的API系统(BioMerieux,Marcy1'Etoile，法国)进行生物化学测试和革兰氏染色后，通过显微镜检查确定微生物的身份。通过在595nm下测量吸光度的微量滴定发酵液稀释方法(microtitrebrothdilutionmethod)，测定琥珀酸和柠檬酸对这些细菌的细菌生长的影响。所有体外实验在无菌的96孔平板(Falcon353072微量滴定板，BectonDickinsonLabware，Meylan，法国)中以200微升的终体积按照下文所述来进行将在适当发酵液中含有约105CFU/ml纯细菌的100微升悬浮液添加至以连续2倍稀释度含有琥珀酸或柠檬酸的100微升发酵液中，或添加质100微升发酵液中作为对照。在对纯细菌的最适生长而言适当的温度下孵育适当时间后，通过用MultiskanAscent(ThermoLabsystems,Helsinki,芬兰)测量595nm下的吸光度来测定生长抑制。通过从对照培养物的0D595中减去M小时或48小时后测试培养物的0D595，来测定培养物密度的降低。通过将培养物密度的降低表述为对照培养物0D595的百分比，将其标准化。MIC90对应于将培养物密度降低90%(表示抑制测试的生物90%的生长)所需的酸浓度(MIC90被定义为抑制生物90%生长所需的最小抑制浓度)。这些评价的结果展示于图1到4。优选地被选择的可能有害的微生物是共生的hcherichiacoli，致病性EscherichiacoliK88,SalmonellaentericasubspentericaserovarEnteritidis禾口Typhimurium,Enterococcusfaecalis禾口Clostridiumperfringens,对它们而言玻拍酸和柠檬酸的MIC90是相当的，并优选地低于31250μM(3.69g/l)，这比有益的革兰氏阳性bacillus如Lactobacillusacidophilus菌株的MIC90至少小50%。对其他有益的革兰氏阳性bacillus如Lactobacillusfermentum菌株而言，琥珀酸和柠檬酸的MIC90低于125000μM0与有益细菌相比，琥珀酸和柠檬酸对从小猪内含物中分离的有害细菌而言更有活性。结果在图1到4中进一步阐述。图1琥珀酸(黑色曲线)和柠檬酸(灰色曲线)针对hcherichiacoli的体外抗微生物活性·图2琥珀酸(黑色曲线)和柠檬酸(灰色曲线)针对MlmonellaentericasubspentericaserovarEnteritidis禾口Typhimurium白勺体夕卜抗微生物活性图3琥珀酸(黑色曲线)和柠檬酸(灰色曲线)针对LactobaciIlusfermentum和Lactobacillusacidophilus的体外抗微生物活性图4琥珀酸(黑色曲线)和柠檬酸(灰色曲线)针对Clostridiumperfringens和Enterococcusfaecalis的体外抗微生物活性实施例4评价断奶小猪膳食中琥珀酸的影响使用72只早期断奶的小猪。将动物分配进18个畜栏中(每个畜栏4只动物)。对动物喂养基本膳食(Tl组)或添加由DSMFineChemicalsLinz，Austria提供的琥珀酸的膳食(T2组)。如下将每个膳食处理指派给9个重复组(36只小猪/处理)·膳食和喂养基于玉米、大麦、干燥的乳清和大豆粉作为主要饲料成分(18.7%CP,14.2MJME/kg)的标准起始者膳食，以丸状形式无限制地喂养。测试制品DSMFineChemicals,Linz,Austria提供的琥珀酸。膳食处理T-1)阴性对照(基础膳食)T-2)1.0%的琥珀酸。实验参数活重增加(第0、14、对和36天)，每日体重增加(第0-14天、14-24天、24-36天和总体)，饲料摄入(每个阶段&总体)，饲料/增重比(每个阶段&总体)，死亡率。这些结果概括于下表1和2中。表权利要求1.琥珀酸或其衍生物用于制备在动物饲料中使用的组合物的用途。2.根据权利要求2的用途，用于制造下述营养药物组合物，所述营养药物组合物用于改进饲料转换比(FCR)和/或调控肠微生物区系。3.根据权利要求1或2的用途，其中琥珀酸的衍生物包括琥珀酸盐例如琥珀酸碱金属盐、琥珀酸碱土金属盐和琥珀酸铵。4.包含琥珀酸、其衍生物或其代谢产物作为活性成分的饲料或动物饲料添加剂。5.根据权利要求4的饲料或动物饲料添加剂，其包含琥珀酸盐作为活性成分。6.根据权利要求4或5的动物饲料添加剂，所述添加剂包含(a)至少一种脂溶性维生素，(b)至少一种水溶性维生素，(c)至少一种微量矿物质，和/或(d)至少一种大量矿物质。7.根据权利要求4到6中任一项的动物饲料或饲料添加剂，其除琥珀酸以外还包含二氢丁香酚。8.根据权利要求4到7中任一项的动物饲料或饲料添加剂，其通过改进饲料转换比(FCR)和/或调控肠微生物区系来改进动物饲料利用。9.根据权利要求5的动物饲料组合物，其具有50到800g/kg饲料的粗制蛋白质含量。10.根据权利要求6的组合物，其为抗细菌、抗真菌和/或消除恶臭的组合物。11.用饲料喂养动物的方法，其中向所述饲料添加琥珀酸。12.根据权利要求11的用饲料喂养动物的方法，其中除了琥珀酸以外还向所述饲料添加二氢丁香酚。13.用于改进动物饲料转换比(FCR)和/或调控动物肠微生物区系的方法，其中向所述饲料添加琥珀酸或其衍生物。全文摘要本发明涉及包含琥珀酸或其衍生物的组合物。发明人已惊讶地发现琥珀酸及其衍生物具有用于动物饲料中的巨大潜力，例如用于改进饲料转换比(FCR)和/或用于调控肠菌群。因此，本发明的一个主要目的是提供用于在动物饲料中使用琥珀酸的组合物和方法。文档编号A23K1/16GK102112009SQ200980130234公开日2011年6月29日申请日期2009年6月2日优先权日2008年5月30日发明者卡洛斯·斯莫思-奴恩斯,吉瑞·布洛兹,奥雷利娅·塞奥恩申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司