专利名称：一种来源于水稻的植物转化终止子dna序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从水稻基因组序列中分离获得的终止子序列的用途，及其在植物生物技术领域中载体构建、植物转化以及基因表达中的应用。
背景技术：
在植物转基因技术中，外源基因的表达要经过转录、转录后加工、转译及转译后加工等一系列步骤，并且在特定的时间和空间产生特定的氨基酸序列。通过对基因表达的不同阶段进行调控可以控制基因表达方式和表达水平。在这些调控方式中，除基因本身的特点之外，其两端的表达调控序列，尤其是5’端的启动子序列以及基因3’端非编码序列(终止子序列)往往对基因的表达有强烈的影响。在真核细胞中，前体mRNA(Pre-mRNA)在转录后需要经过进一步加工后才能形成有转译活性的mRNA，在此过程中mRNA3’末端往往加上由25-250个核苷酸残基poly (A)组成的尾部，此过程主要由基因3’端非编码区域一段核苷酸序列决定的，这一区域称之为3’ 端力口工信号(3，-processing signal)或终止子(Terminator)。终止子序列中最重要的因子是位于mRNA聚腺苷位点上游15_20个核苷酸处的聚腺苷信号(Polyadenylation signal)，一般由六个有高度的保守性的核苷酸AAUAAA(或 AAUUAA,)组成。在植物mRNA中第六个核苷酸有时有所变化，AAUAAA序列对于前体mRNA3’ 末端的断裂和腺苷酸的聚合是必要的。AAUAAA信号下游一般富含尿嘧啶(U)或尿嘧啶鸟嘌呤核苷酸(UC)的序列，其保守性不及AAUAAA序列，但对于断裂反应也是必要的。终止子虽然不具有增强子的功能，但不同来源的植物终止子对于外源的表达有着非常不同的影响。文献报道表明，不同来源的3’端序列对于Npt-II酶在转化烟草细胞内的表达水平有强烈影响，最高可达相差60倍。目前转基因工程中最常用的终止子为胭脂碱合成酶(NOS)终止子(T-Nos)。本发明包含了一段从水稻基因组中来源的DNA序列trbcs，试验结果表明在植物转基因应用中，trbcs序列具有与T-Nos相同的终止子功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种在植物转化中可用作外源基因表达结构中的终止子序列。本发明所提供的终止子序列来源于水稻基因组，具有下述核苷酸序列。1)序列表中的SEQ ID Na 1的DNA序列；2)将序列表中SEQ ID Na 1的核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代或加入，并且与所示核苷酸序列中由733个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过 90%的核苷酸序列的DNA，该DNA具有终止子功能。所述一个或多个碱基缺失、取代或加入，是指不多于10%的碱基缺失、取代、或加入。
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件可为在杂交液中60°C下杂交，并在0. 5XSSC，0. SDS的溶液中，在60°C下洗膜。含有本发明DNA序列的表达载体、人工导入细胞系、宿主菌及表达盒均属于本发明的保护范围。使用含有本发明DNA序列的表达载体、人工导入细胞系、宿主菌及表达盒通过现有分子生物学的方法可以得到的转化微生物细胞和转化植物细胞、组织及植株等均属于本发明的保护范围。本发明的终止子序列在构建到植物表达载体中时，其序列前可加上任何一种启动子序列和目的基因序列。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物， 其中，单子叶植物可为草坪草、小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米等，双子叶植物可为马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、甜菜或向日葵等。携带有该终止子序列的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的组织培育成植株。
图1植物表达载体pBI121物理图谱图2植物表达载体pBI121_trbcs物理图谱图3转基因高羊茅草图4转基因植株PCR检测图5转基因植物⑶S组织化学分析
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参考(Sambrook 等人，分子克隆实验室手册，New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。部分用于本说明书和权利要求书的术语具有以下含义一术语“核酸”是指DNA或RNA ；一术语“核酸序列”是指从5’端读至3’端的单链或双链的核苷酸碱基的寡聚体或聚合物，它包括自我复制型质粒、感染性或非感染性的基因和DNA或RNA聚合物、以及功能性或非功能性DNA或RNA。在用于本申请中的核苷酸符号中，除具体提及的以外，单链或双链核苷酸序列的左端均为5’端；—术语“启动子”或短语“启动子区核酸序列”是指位于翻译起始密码子上游、RNA 聚合酶和其它转录蛋白的识别和结合的核酸区；-“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子；一短语“以功能方式连接的”或“功能性连接的”是指一段核酸序列(例如一个启动子或一个调节或功能框)与另一段核酸序列(例如另一调节或功能框、或编码待产生的蛋白的待表达的基因)的连接，使得所述序列在已经引入其的细胞、基因组、载体或表达盒中发挥其原始功能，即使得它们在这样的环境中有功能。就启动子而言，启动子序列也包括在转录起始位点和翻译起始位点之间的转录序列；一术语“表达盒”是指这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够在与这种序列相容的宿主生物中指导编码待产生的多肽的核酸序列或基因的表达。这样的盒至少包括一个启动子和一个转录终止信号、以及任选的表达所需要的或可用于表达的其它因子；一术语“载体”是指表达系统，例如DNA包被的轰击粒子、基于核酸的转运载体和已被改变以运送所述核酸的核酸分子、以及自主自我复制型环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等。所述载体能够或者作为整合到宿主基因组中的自主结构通过在有丝分裂期间由所述细胞稳定复制，或者维持在宿主的细胞核或细胞质中；一术语“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括所谓的“表达”质粒和所谓的“非表达”质粒。如果一种重组细胞培养物或微生物被描述为是“表达质粒”的宿主，则该术语既包括染色体外环状DNA分子，又包括已经整合到宿主染色体中的DNA。如果所述质粒被宿主细胞保持，则所述质粒或者在有丝分裂期间作为一种自主结构由所述细胞稳定地复制，或者整合到所述宿主的基因组中；一术语“框”是指负责调节功能的核酸序列；一术语“位于”是指已鉴定元件(例如“框”、限制位点或具有特定功能的密码子) 在核酸序列中的位置。以数字给出的位置是指所述元件在所述核酸序列中的起始位置，只是当具体提及时，以所述核苷酸序列的阅读方向即5' —>3'方向提及；一术语“转基因植物”是指通过遗传操作技术获得的植物，并包括通过这些技术所获得的整株植物、在其基因组中已经整合了这类操作或表达这类操作的再生植物、其后代以及植物器官，例如根、茎和叶。按照本发明的转基因植物可以具有不同的倍性水平，可以是多倍体、二倍体或单倍体。实施例1、终止子DNA序列克隆与分析(1)基因组DNA的抽提用CTAB法(Rogers，S. 0.等，1985)提取水稻基因组DNA，具体方法如下取水稻叶片液氮研磨，每1克的植物材料中加入5毫升经68°C预热的CTAB溶液(用前加0. 2%巯基乙醇)，60°C加热30分钟。然后加入等体积氯仿异戊醇，15000g离心15分钟，取上清。在上清液中加入2/3倍体积的异丙醇，混勻，用注射针针尖将DNA丝搅出置于新管中，再加入 75 %乙醇，洗涤沉淀及离心管壁，然后将乙醇吸干，空气烘干剩余的乙醇，加入TE溶解DNA。 并于-20°C保存。(3) trbcs序列的克隆与分析以PCR(聚合酶链反应)方法扩增trbcs终止子DNA片段。PCR反应液含有1 μ g 基因组 DNA、1. 5mMMgC12、20mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)、50mM KCl、0.8mM dNTP 混合物、1 μ M5，引物和1 μ Μ3’引物，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下5，弓丨物5， -tggcaactaagccgtcatcgtc-3，3，弓丨物5， -ctatcatctgccaacctttctg-3，按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增 trbcsDNA片段94°C 5分钟；94°C 1分钟；60°C 1分钟；72°C 2分，共30个循环，和72°C 10分钟。将扩增得到的约73!3bp DNA片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司) 按供应商提供的方案回收该片段，测序。实施例2、植物表达载体构建(1)阳性对照质粒的选择植物表达载体的构建按常规方法进行。以质粒pBI121 (Genebank :AF485783)作为阳性对照，在该质粒中编码β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1987)的⑶S基因在CaMV 35S启动子和根农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂碱合酶基因终止子的控制之下，如图1所示。(2)转化载体pBI121_trbcs的构建植物表达载体的构建按常规方法进行。经实施例1中获得的73!3bpDNA片段，用 DNA聚合酶I (Klenow大片段)(宝生物工程(大连)有限公司)进行平端化处理(37°C， 30分钟)。用DNA凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按供应商提供的方案在 0. 8%琼脂糖凝胶上分离并回收。取5yg质粒pBI121用限制性内切酶Mel (宝生物工程(大连)有限公司)和 EcoR I (宝生物工程(大连)有限公司)于37°C消化1小时。用T4DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)和DNA聚合酶I (Klenow大片段)(宝生物工程(大连)有限公司) 分别进行平端化处理(37°C，30分钟)。用DNA凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按供应商提供的方案在0. 8%琼脂糖凝胶上分离并回收长为14493bp的DNA片段，此片段为已去除了 Nos终止子、而保留了 CaMV 35S启动子和⑶S基因的原pBI121质粒的骨架结构。取上述两种凝胶回收片段各约0. 2 μ g，用T4连接酶于16°C过夜连接，转化大肠杆菌DH5a，经克隆筛选和酶切鉴定，得到质粒pBI121-trbcs，如图2所示。实施例3、农杆菌介导转化植物(1)根农杆菌的培养将阳性对照质pBI121和实施例2中构建的植物表达载体pBI121_trbcS分别转化农杆菌，农杆菌菌种为LBA4404。将得到的农杆菌转化菌株在YEB培养基上培养2天，用小勺将菌刮下在液体共培养培养基中打散，静置2小时，摇勻后调整菌液浓度至0D600为0. 1。(2)转基因烟草的获得利用改良叶盘法，通过农杆菌介导转化烟草。取完全展开的烟草无菌苗叶片，用打孔器(直径0.9cm)制成叶盘，在菌液中浸泡lOmin。取出叶盘，用无菌滤纸吸干后，转入覆盖有一层无菌滤纸的共培养培养基中于25°C暗培养2 3天后，将叶盘转入继代筛选培养基中。在继代培养基中光照培养(光/暗周期为16/8hrs)3天后，将叶盘转入筛选培养基。 继续培养7 10天后，将叶盘转入再生培养基。15 20天即可观察到叶片边缘长出愈伤或丛生再生芽，一个月左右可长至1 2cm，转入新的再生培养基中，待其长到3 km时， 用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基中。再生苗在含有卡那霉素(50mg/L)的生根培养基上生根，一个月后待根系发育完全后，将幼苗转移至温室生长。每升共培养培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美国)0. lmg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g, pH
5 · 2 ο
每升继代培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1. Omg, 吲哚乙酸(Gibco，美国)0. lmg、羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg、蔗糖 (北京益利精细化学品有限公司)30g，pH 5. 8。每升筛选培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1. Omg, 吲哚乙酸(Gibco，美国)0. lmg、羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg、卡那霉素(北京欣经科生物技术有限公司)75mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g，pH 5. 8。每升再生培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1. Omg, 羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg、卡那霉素(北京欣经科生物技术有限公司)75mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g，pH 5.8。每升生根培养基成分如下MS基本培养基加卡那霉素(北京欣经科生物技术有限公司)50mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)20g，pH 5.8。(2)转基因高羊茅草的获得1、愈伤组织诱导选取成熟饱满的草坪草早熟禾的种子，室温下在蒸馏水中浸泡4小时后剥去种皮，再放入蒸馏水中继续浸泡过夜。浸泡好的去皮种子先用70%酒精过两遍，再用30%次氯酸钠消毒30分钟，无菌水冲洗三遍。在无菌条件下，将种子接入愈伤组织诱导培养基。接种密度100粒/皿，平皿直径75mm。每升愈伤组织诱导培养基的组成如下在MS基本培养基的基础上加入生长素类物质2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0，5丨811^，美国)&^，6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)0. lmg，pH 5. 8。2、愈伤组织的农杆菌侵染将愈伤组织置于经过重悬静置菌液浓度为0D600 = 0. 1的LBA4404根农杆菌菌液中侵染10分钟，倒去菌液，在无菌滤纸上将愈伤晾干(约5分钟)，置于覆有一层无菌滤纸的共培养培养基，25°C暗培养3天。所用共培养培养基为步骤一的愈伤组织诱导培养基。3、抗性愈伤组织的筛选共培养后用筛选培养基对愈伤组织进行筛选，每三星期转皿一次，约两个月后上分化培养基。每升抗性愈伤组织筛选培养基的组成如下在MS基本培养基的基础上加入2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D, Sigma，美国)ang，6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)0. lmg, G418(青岛生工)20mg-100mg，羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg，pH5. 8。4、抗性愈伤组织的分化将经过筛选的直径达到0. 5cm以上的抗性愈伤组织放到分化筛选培养基上进行分化，并于25°C下光照培养(1 光/ 暗)。10天后有绿色小芽出现，约两周后即可生长为幼苗。每升分化培养基的组成如下在MS基本培养基的基础上加入6-苄氨基嘌呤 (Sigma，美国)0. 2mg，激动素(Sigma，美国)0. 2mg，G418 (青岛生工)50mg，pH 5.8。5、转化植株的生根将已分化的幼苗接种于生根培养基，生根。大约3-5天后可见白色幼根长出，之后约两周可形成较发达成熟的根系，如图3所示。生根培养基为MS基本培养基。实施例4、转化植株的PCR鉴定如实施例1⑴所述方法提取转化植株的基因组DNA，并以IOOng基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增⑶S基因3’端及trbcs终止子全序列，扩增片段大小为约llOObp。 反应液含有 IOOng基因组DNA、1. 5mM MgC12、20mM Tris-HCl (pH8. 4)、50mM KC1、0. 2mM dNTP 混合物、1 μ M 5’引物和1 μ M 3’引物，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下5，引物5， -tgcatcagccgattatcatc-3，3，引物5， -ctatcatctgccaacctttc-3，阳性质粒对照分别为pBI121-trbcs和pBI121。其中pBI121扩增片段为增⑶S基因3’端及nos终止子全序列，片段大小为649bp。引物序列如下5，引物5， -tgcatcagccgattatcatc-3，3，引物5， -gatctagtaacatagatgac-3，按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环扩增 940C 5分钟；94°C 1分钟；58°C 1分钟；72°C 1分，共30个循环，和72°C 10分钟。将扩增产物进行电泳分析可见在预计处有清晰的条带。如图4所示。(图中I=Marker, 2:非转基因植株对照，3 阳性质粒PBI121对照(扩增片段649bp)，4 阳性质粒pBI121-trbcs对照， 5-10 转基因植株，11 空白(水)对照。Marker条带分别为8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb， 2kb，1600bp，lkb，517bp，396bp。)实施例5、报告基因活性检测一-GUS组织化学分析⑶S组织化学染色参考Jefferson等(1987)的检测方法。取转基因植株的新鲜叶片浸泡于GUS反应液(0. IM NaP04缓冲液，pH 7. 0，IOmM EDTA，pH7. 0，5mM铁氰化钾，5mM 亚铁氰化钾，1. OmMX-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，对浸泡的组织进行抽真空，于37°C黑暗过夜。用蒸馏水清洗染色组织，用固定液(无水乙醇/冰醋酸，3/1)固定1小时，进行脱色、脱水，观察。结果表明转pBI121-trbcS的植株与转pBI121的阳性对照植株一样，可明显显示组织染色。如图5所示。
权利要求
1.一种能够在植物细胞中发挥功能的终止子，其特征为如SEQ ID NO :1所示的DNA序列。
2.一种载体，其特征为包含权利要求1的终止子DNA序列。
3.产生转化体的方法，其特征为包含将权利要求2中的载体导入宿主细胞的步骤。
4.转化的微生物细胞，其特征为含有导入的权利要求1中的终止子序列或权利要求2 中的载体。
5.转化的植物细胞和组织，其特征为含有导入的权利要求1中的终止子序列或权利要求2中的载体。
6.转基因植株，其特征为该植株是应用权利要求1中的终止子序列或权利要求2中的载体经过转化获得的，其最终转化体中含有或者已经去除了权利要求1中的终止子序列或权利要求2中的载体。
7.根据权利要求6中所述，转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物，如草坪草、小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、甜菜或向日葵寸。
全文摘要
本发明涉及一种从水稻基因组中分离获得的DNA序列，该序列在植物转化中可用作外源基因表达结构中的终止子区域。本发明包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA，或在所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代或加入，并且与所示核苷酸序列中由733个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA等效。本发明还涉及包含有该终止子序列的转化载体构建，以及相应转基因植株的获得。
文档编号A01H5/00GK102191243SQ201010117379
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者吴茜, 徐健勇, 李钦清, 温红雨, 赵建杰, 陈婉丽, 陈蕾 申请人:北京北方杰士生物科技有限责任公司