专利名称：：玉米单倍体胚芽鞘节组织培养的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物组织培养和作物育种领域，特别涉及玉米单倍体胚芽鞘节组织培养及其单倍体加倍与专用培养基。
背景技术：
：玉米(ZeamaysL.)亦称玉蜀黍、包谷、苞米、棒子；粤语称为粟米，闽南语称作番麦，是一年生禾本科草本植物，也是全世界总产量最高的粮食作物。商业等级主要根据籽粒的质地划分，分为马齿种、硬质种、粉质种、爆裂种及糯玉米、甜玉米等。籽粒顶端凹陷，因籽粒硬淀粉和软淀粉的干燥度不相等而致的。硬粒玉米含软淀粉少，干燥后顶部凹陷。粉质玉米主要含软淀粉，粉质，易碾碎。甜玉米发皱，透明，糖分不转化为淀粉。爆裂玉米是硬玉米的极端型，籽粒小而硬，不含软淀粉，加热时细胞内水分膨胀，籽粒爆裂。用优良自交系杂交可改良玉米类型。玉米用作饲料、食物和工业原料，在许多地区作为主要食物。除食用外，玉米也是工业酒精和烧酒的主要原料。玉米植株的其它部分用途也相当广泛玉米秆用于造纸和制墙板；包皮可作填充材料和草艺编织；玉米穗轴可作燃料，也用来制备工业溶剂，茎叶除用作牲畜饲料外，还是沼气池很好的原料。利用单倍体育种可以克服杂种分离，缩短育种年限，提高选择率。通过获得单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。玉米单倍体胚芽鞘节组织培养获得单倍体植株的技术，目前未见有报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于玉米单倍体胚芽鞘节愈伤组织分化培养的专用培养基。本发明提供的分化培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基脯氨酸、酪蛋白水解物、碳源和凝胶剂；上述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；上述分化培养基中脯氨酸的终浓度是0.6-0.8g/L、酪蛋白水解物的终浓度是0.4-0.6g/L。表1.MS基本培养液的溶质<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述凝胶剂是琼脂粉、卡拉胶或Gelrite等组织培养常用固化剂，优选是Gelrite，Gelrite(明胶)的用量以能达到的培养基硬度为基础，可适当调整用量，Gelrite在分化培养基中的浓度具体可以是3.Og/L。上述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，蔗糖在分化培养基中的浓度具体可以是30g/L。进一步，上述分化培养基中脯氨酸和酪蛋白水解物的终浓度优选是脯氨酸为0.7g/L、酪蛋白水解物为0.5g/L。本发明的目的还在于提供一种生产玉米单倍体植株的方法。本发明提供生产玉米单倍体再生植株的方法，包括以下步骤1)将单倍体玉米籽粒的成熟胚置于MSVS34培养基中培养，萌发得到胚芽，选取无色的单倍体胚芽；2)将上述步骤1)中得到的单倍体胚芽切取胚芽鞘节接种于MSW57愈伤组织诱导培养基中培养，得到单倍体愈伤组织；3)将上述步骤2)中得到的单倍体愈伤组织置于上述的分化培养基中培养，得到单倍体再生植株。上述MSVS34培养基和MSW57愈伤组织诱导培养基均是植物组织培养中常用的培养基。本发明的生产玉米单倍体植株的方法在所述步骤2)和步骤3)之间还可包括继代培养，所述继代培养是将所述步骤2)中得到的单倍体愈伤组织置于N6继代培养基中培养增殖，得到增殖的单倍体愈伤组织。上述N6继代培养基是在N6基本培养液中添加酪蛋白水解物、脯氨酸、2，4_D、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述碳源优选为蔗糖，凝胶剂优选为Gelrite。所述蔗糖在所述N6继代培养基中的终浓度是30.Og/L,所述Gelrite在所述N6继代培养基中的终浓度是2.7g/L所述N6基本培养液的溶剂是水、溶质如表2所示；其中酪蛋白水解物、脯氨酸和2,4-D的终浓度分别是如下1)或2)1)酪蛋白水解物为0.5g/L，脯氨酸为0.7g/L，2，4-D为1.5-2.5mg/L；2)酪蛋白水解物为0.5g/L，脯氨酸为0.7g/L，2，4_D为2mg/L。最优的N6继代培养基中酪蛋白水解物、脯氨酸和2，4-D的终浓度是上述2)所述。表2.N6基本培养液的溶质大量元素培养基中浓度(g·Γ1)KNO3283~(NH4)2S04ΟθKH2PO40ΛMgSO4.7Η200.185CaCl2.2Η200.166<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述的生产玉米单倍体植株的方法还可包括将步骤3)中得到的单倍体植株接种到生根培养基中进行生根培养，得到生根的单倍体植株。上述生根培养基是在MS基本培养液中添加NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述碳源优选为蔗糖，凝胶剂优选为Gelrite。所述蔗糖在所述生根培养基中的终浓度是30g/L，所述Gelrite在所述生根培养基中的终浓度是1.2g/L。其中NAA的终浓度为0.25-0.7mg/L，优选是0.5mg/L。本发明的分化培养基可有效地将玉米胚芽鞘节诱导的愈伤组织分化为植株，不定芽分化率达36%，经过生根培养基培养后，生根率达88.9%。本发明的方法是利用玉米单倍体胚芽的胚芽鞘节作为外植体诱导愈伤组织分化得到单倍体植株的，本发明建立的组织培养体系可有效地用于单倍体育种研究，对于保留优良的单倍体材料，及将优良的单倍体材料加倍为纯合二倍体提供良好的材料。图1为玉米单倍体籽粒。图2为本发明成熟胚萌发的单倍体胚芽。图3为本发明待接种的单倍体胚芽鞘节。图4为单倍体胚芽鞘节诱导得到的单倍体愈伤组织。图5为继代的单倍体愈伤组织。图6为愈伤组织诱导分化得到的单倍体再生植株。图7为已生根移栽成活的单倍体植株。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、玉米单倍体植株的制备及统计观察一、单倍体籽粒的获得以玉米单倍体诱导系Stock6(美国高士得公司，GarstSeedCo)作为父本，与农大108(购买于北京中农大康科技开发有限公司)进行杂交。种子成熟、干燥后，挑选紫顶白胚的籽粒，备用。二、单倍体胚芽的获得与统计观察1、单倍体籽粒的预处理从步骤一中得到的紫顶白胚的玉米籽粒(即玉米单倍体籽粒，如图1所示)中挑选100粒，装入信封，开口将信封放入干燥器内。使用250mL的烧杯，盛200mL5.25%(体积百分数)次氯酸钠溶液，再向烧杯内加入2mL浓盐酸，放入干燥器中央，密封处理8-15小时。将籽粒取出，放入烧杯，于超净工作台中加入70%(体积百分数)乙醇处理lmin;除去70%乙醇，加入2%(体积百分数)次氯酸钠溶液，浸泡20min;用无菌水洗4-5次，最后用无菌水浸泡过夜。2、得到单倍体胚芽在超净台上，将浸泡过夜的籽粒进行剥离，得到成熟胚，接种于MSVS34培养基中，放置光照培养室中培养7-10天，光照培养室中培养条件为放置25°C光照培养，光照强度20001x，每天光照16h，培养7-10d。得到萌发后的胚芽，剔除胚根、胚或胚芽呈紫色的胚芽材料，选取获得胚根、胚和胚芽均为无色的单倍体胚芽(如图2所示)材料。上述MSVS34培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的培养基酪蛋白水解物、MES(2-morpholinoethanesulfonicacid)、氯化镁、谷氨酰胺、抗坏血酸、piclOTam(毒莠定).BAP(benzyladenine)、碳源和凝胶剂；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；其中酪蛋白水解物的终浓度是0.lg/L，MES的终浓度是1.95g/L，氯化镁的终浓度是0.75g/L，谷氨酰胺的终浓度是0.5g/L，抗坏血酸的终浓度是0.lg/L，piCl0ram的终浓度是10mg/L，BAP的终浓度是3mg/L，上述碳源为麦芽糖，凝胶剂为琼脂；麦芽糖的终浓度是40g/L，琼脂的终浓度为8g/L，可适当调整其用量，MSVS34培养基的pH为5.8。3、统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤2中MSVS34培养基诱导成熟胚萌发的结果以及单倍体胚芽的得率。实验结果见下表3。从表3可以看出，成熟胚萌发后，剔除胚根、胚芽为紫色的材料，保留胚根和胚芽为非紫色的单倍体材料。表3.MSVS34培养基诱导成熟胚萌发情况统计<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、愈伤组织的获得与统计观察1、愈伤组织的获得待上述步骤二中到的单倍体胚芽长至约5-6cm单倍体幼苗时，切取约lem的胚芽鞘节(茎节上、下各0.5cm,如图3所示)，并用手术刀等分，切面紧贴培养基，接种于MSW57愈伤组织诱导培养基中，在25°C光照培养，光照强度20001x，每天光照16h，光照培养21d，得到单倍体愈伤组织(如图4所示)。上述MSW57愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加盐酸硫胺素、酪蛋白氨基酸、脯氨酸、硝酸银、2，4-D、picloram、碳源和凝胶剂得到的培养基；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；其中盐酸硫胺素的终浓度为0.9mg/L，酪蛋白氨基酸的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为1.38g/L，硝酸银的终浓度为3.4mg/L，2，4-D的终浓度为0.5mg/L，picloram的终浓度为2.2mg/L；上述碳源为蔗糖，凝胶剂为琼脂；蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为8g/L，培养基的pH为5.8。2、统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤1中愈伤组织的诱导情况，实验结果见下表4，愈伤组织的诱导率可达到36.9%以上。表4.愈伤组织诱导率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四、愈伤组织的继代培养及统计观察1、继代培养将步骤三中得到的愈伤组织转接到N6继代培养基中，在温度为25°C的条件下，暗培养，每21天继代一次，得到所需增殖数量的单倍体愈伤组织(如图5所示)。上述N6继代培养基是在N6基本培养液中添加如下物质得到的培养基酪蛋白水解物、脯氨酸、2，4-D、碳源和凝胶剂；其中碳源为蔗糖，蔗糖在培养基中的终浓度为30g/L，凝胶剂为Gelrite，Gelrite的终浓度为2.7g/L，酪蛋白水解物的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.7g/L，2，4-D的终浓度为2mg/L；培养基的pH为5.8，N6基本培养液的溶质如表2所示，其溶剂是水。五、单倍体再生植株的获得及统计观察1、得到单倍体再生植株将上述步骤三得到的单倍体愈伤组织或步骤四中继代培养得到的单倍体愈伤组织切成小块转入分化培养基中，光照培养，培养条件是，温度为25°C，放置在20001x的光照强度下培养，每天光培养16小时，暗培养8小时，分化得到单倍体再生植株(如图6所示)。上述分化培养基是在MS基本培养液中添加脯氨酸、酪蛋白水解物、碳源和凝胶剂得到的培养基，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；其中碳源是终浓度为30g/L的蔗糖，凝胶剂是Gelrite，Gelrite的终浓度为3.Og/L，脯氨酸的终浓度为0.7g/L，酪蛋白水解物的终浓度为0.5g/L，培养基的pH为5.8。2、统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤1中再生分化的情况，实验结果见下表5，从表5可以看出，愈伤组织的分化率可达到54%以上，不定芽的分化率达22%以上。表5.再生分化培养的分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>六、生根培养与统计观察1、单倍体生根植株的获得当上述步骤五中得到的单倍体植株长至3_5cm时，转入生根培养基中进行生根培养，培养条件是25°C光照培养，光照强度20001x，每天光照16h，培养约21天，得到生根良好的单倍体生根植株。上述生根培养基是在MS基本培养液中添加NAA、碳源和凝胶剂得到的培养基，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；其中碳源是终浓度为30g/L的蔗糖，凝胶剂是Gelrite,Gelrite的终浓度为1.2g/L，NAA的终浓度为0.5mg/L，培养基的pH为5.8。2、统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤1的生根培养情况，实验结果见下表6，生根率达到81.7%以上，每株单倍体植株平均生根2.1根。表6.生根培养的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>七、炼苗移栽及检测分析1、炼苗移栽将上述步骤六中生根良好的单倍体生根植株炼苗后，移栽至花盆，于温室中生长7-10天，将移栽成活的植株种植于温室中，得到移栽成活的单倍体植株(即再生的植株，如图7所示)。移栽的成活率为75%。2、检测分析将上述步骤1中再生植株(即单倍体生根植株)移栽花盆时，切取1-2个根尖，用卡诺固定液(无水乙醇冰醋酸=31)固定2h以上。用ddH20清洗数次后，加入适量的纤维素酶和果胶酶混合物酶解2h。压片，在显微镜下观察染色体数目，结果发现染色体数目都为10条，说明再生的植株都是单倍体植株。权利要求一种分化培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基脯氨酸、酪蛋白水解物、碳源和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述分化培养基中脯氨酸的终浓度是0.6-0.8g/L、酪蛋白水解物的终浓度是0.4-0.6g/L。2.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于所述凝胶剂是琼脂粉、卡拉胶或Gelrite，优选是Gelrite，其中Gelrite在所述分化培养基中的终浓度是3.Og/L；所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，其中蔗糖在所述分化培养基中的终浓度是30g/L。3.根据权利要求2所述的分化培养基，其特征在于所述分化培养基中脯氨酸和酪蛋白水解物的终浓度分别是脯氨酸为0.7g/L、酪蛋白水解物为0.5g/L。4.一种生产玉米单倍体再生植株的方法，包括以下步骤1)将单倍体玉米籽粒的成熟胚置于MSVS34培养基中培养，萌发得到胚芽，选取无色的单倍体胚芽；2)将上述步骤1)中得到的单倍体胚芽切取胚芽鞘节接种于MSW57愈伤组织诱导培养基中培养，得到单倍体愈伤组织；3)将上述步骤2)中得到的单倍体愈伤组织置于权利要求1-3中任一所述的分化培养基中培养，得到单倍体再生植株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的生产玉米单倍体植株的方法在所述步骤2)和步骤3)之间还包括继代培养，所述继代培养是将所述步骤2)中得到的单倍体愈伤组织置于N6继代培养基中培养增殖，得到增殖的单倍体愈伤组织。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述N6继代培养基是在N6基本培养液中添加酪蛋白水解物、脯氨酸、2，4-D、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述碳源优选是蔗糖，所述凝胶剂优选是Gelrite；所述N6基本培养液的溶剂是水、溶质如表2所示；其中酪蛋白水解物、脯氨酸和2，4-D的终浓度分别是如下1)或2):1)酪蛋白水解物为0.5g/L，脯氨酸为0.7g/L，2，4-D为1.5-2.5mg/L；2)酪蛋白水解物为0.5g/L，脯氨酸为0.7g/L，2，4-D为2mg/L。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述蔗糖在所述N6继代培养基中的终浓度是30.Og/L，所述Gelrite在所述N6继代培养基中的终浓度是2.7g/L。8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述的生产玉米单倍体植株的方法还包括将步骤3)中得到的单倍体植株接种到生根培养基中进行生根培养，得到生根的单倍体植株。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述生根培养基是在MS基本培养液中添加NAA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；其中NAA的终浓度为0.25-0.7mg/L，优选是0.5mg/L。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述生根培养基中的碳源是蔗糖，凝胶剂是Gelrite；所述蔗糖在所述生根培养基中的终浓度是30g/L，所述Gelrite在所述生根培养基中的终浓度是1.2g/L。全文摘要本发明公开了一种玉米单倍体胚芽鞘节组织培养的方法及其专用培养基。本发明提供的分化培养基是玉米单倍体胚芽鞘节诱导的愈伤组织分化成芽时所用的培养基，它是在MS基本培养液中添加如下物质得到的培养基脯氨酸、酪蛋白水解物、碳源和凝胶剂；其中脯氨酸的终浓度是0.7g/L、酪蛋白水解物的终浓度是0.5g/L。本发明的方法是利用玉米胚芽鞘节作为外植体诱导愈伤组织，再将愈伤组织分化成单倍体植株建立稳定高效的组织培养体系。本发明可用于分化率遗传研究、组织培养的材料选育等方面。文档编号A01H4/00GK101805721SQ20101013973公开日2010年8月18日申请日期2010年4月1日优先权日2010年4月1日发明者严建兵,刘志鹏,张义荣,惠国强,李建生,杜何为,郑艳萍申请人:中国农业大学