专利名称：猕猴超数排卵和腹腔镜取卵方法
技术领域：
本发明属于用于动物繁殖的方法，特别是刺激猕猴一次获得多个成熟卵母细胞的 方法。
背景技术：
猕猴属于灵长类动物，与人类有着非常接近的遗传物质，其数量较多，分布较广， 可避开伦理束缚，成为人类的理想实验替代品，广泛应用在临床前疾病模型研究、药物筛选 等涉及人类健康的诸多领域。生殖生物学和胚胎工程技术在近10年来发展迅速，转基因、 核移植、胚胎干细胞替代治疗等方面的研究取得了纵深发展。这些研究的终极目标是提高 人类的健康水平和生活质量。然而，目前的绝大多数研究基于小鼠等小型、低等的哺乳动 物，利用猕猴开展相关研究势在必行。在常规状态下，猕猴仅在10月份到次年3月份的生 殖季节出现月经，期间排卵2-3次，每次只排卵1个。超数排卵技术是利用外源激素，刺激动物在一个排卵周期排出比正常情况下更多 的成熟卵子的技术，它和卵子收集技术是体外受精等胚胎工程研究的前提和基础。灵长类 的超数排卵研究最早是在人上开展的。1970年，英国妇科学家StePtoe及胚胎学家Edwards 开始人超数排卵、体外受精和胚胎移植的研究工作。1976年第一例输卵管妊娠成功。1978 年StePtoe等报道了世界首例试管婴儿诞生。在非人灵长类，1973年，Gould等首先报道了 岩石猴体外受精发育到卵裂。随后，在黑猩猩(Gould等，1983)，猕猴(Bavister等，1984)， 狒狒(Kuehl等，1984)，食蟹猴(Bamaeede等，1984)，绒猴(Lopata等，1988)等均有报道。超数排卵可以一次得到多个质量较好的卵，但总的来看超排效果还不稳定，文献 报道的非人灵长类的超排成功率仍然很低，而且受年龄、季节和月经的规律性等因素的影 响。超数排卵还可能产生不正常的发育和多黄体功能(季维智等，1993)，超排过程中血液 孕酮和雌激素水平比正常月经周期要高得多；黄体期要比自然月经周期短3-5天。造成这 种异常可能是hCG较长的半衰期使黄体延续，促性腺激素升高。此外，外源激素促性腺激素 的药理环境和较高的留体激素水平可能抑制了垂体的功能使内源LH在hCG的作用消失后 不足以维持黄体。这些异常都可能影响早期胚胎的发育。猕猴的超数排卵效果非常稳定的 报道尚不多见。另一方面，传统的猕猴采卵技术基本采用手术方法，剖开动物腹壁，暴露卵巢，然 后用注射器等吸取卵泡，收集卵子。该方法手术创面大，动物容易受感染，动物2-3次手术 后，腹腔内脏器粘连严重，很难继续利用。腹腔镜取卵多用于大动物和人。St印toe等在人体注射hCG32_36小时后，利用腹 腔镜采卵获得近成熟卵母细胞并体外受精成功，成为世界首例试管婴儿。但腹腔镜取卵在 猕猴上的应用还不十分成熟。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种猕猴超数排卵和腹腔镜取卵方法，该方法能够大幅提高每次获得的卵子的数量和质量，且操作过程微创，受试动物无痛 苦，可提高猕猴每年的利用次数和利用年限，为进一步开展胚胎工程相关研究提供材料。为实现这样的目的，本发明用人源重组的超排激素促卵泡激素(FSH)刺激猕猴卵 巢多个卵泡发育，然后利用人绒促性腺素(HCG)使卵泡进一步成熟，约36小时后，利用腹腔 镜收集超排所得的卵母细胞。本发明包括如下步骤(1)从猕猴月经周期1-5天内开始注射人源重组的超排激素促卵泡激素FSH ；(2)给药后4天，检测卵泡发育情况，对卵泡发育均勻、数目合适的猕猴继续给药；(3)给药8天后，注射人绒促性腺素(HCG)；(4)约36小时后，利用腹腔镜收集卵母细胞、分级、处理。所述的注射人源重组的超排激素促卵泡激素FSH是将70IU的FSH用生理盐水稀 释混勻后，根据动物的年龄、体重、重复超排次数、血液雌二醇和孕酮水平决定用药量，早晚 肌肉注射给药。所述的给药4天后，用B型超声波检测卵泡发育情况。本发明方法简单，易于推广，其体系的特点是1)可以针对不同的猕猴个体制定相应的超数排卵和取卵方案，每次可以获得平均 40枚左右的卵母细胞，其中，成熟卵母细胞超过20枚；2)每个繁殖季节每只猕猴可以处理2次，提高了猕猴有限生殖季节的利用效率；3)利用人源重组的超排激素促卵泡激素(FSH)和人绒促性腺素(HCG)避免猕猴对 药物依赖性，保证每次超数排卵的数量和质量；4)超排取卵的对象可以扩大到2岁-16岁；5)利用微创、快速、高效的腹腔镜技术取卵，减少了手术对猕猴的损伤，术后没有
后遗症。利用外源激素诱发猕猴超数排卵和微创、快速高效的取卵技术是开展胚胎医学研 究的基础和关键技术。发明人利用自身拥有的丰富的猕猴资源，通过近10年的研究和探 索，建立了一套较为完善的猕猴超数排卵和腹腔镜取卵技术。以下结合实施例对本发明做进一步描述，本发明保护范围包括但不限于实施例的 内容。
具体实施例方式实施例1 在猕猴的生殖季节观察猕猴的月经，在月经周期1-5天的任意一天开始注射促卵 泡激素(FSH)；给药FSH后4天开始，用B型超声波检测卵泡发育情况，发育均勻、数目合适 的继续给药；给药8天后注射HCG ；约36小时后，利用腹腔镜收集卵母细胞，分级、处理。实施例2 对于重复超排的猕猴，在猕猴的生殖季节观察猕猴的月经，在月经周期1-5天的 任意一天开始注射促卵泡激素(FSH)；将70IU的FSH用生理盐水稀释混勻，根据动物的年 龄、体重、重复超排次数、前次超排取卵情况、血液雌二醇和孕酮水平决定用药量，早晚肌肉 注射给药；给药后4天开始，用B型超声波检测卵泡发育情况，发育均勻、数目合适的继续给药；给药8天后，注射HCG ；约36小时后，利用腹腔镜收集卵母细胞；将收集的卵母细胞送到 胚胎操作间进一步分级、处理，开展后续实验。
权利要求
一种猕猴超数排卵和腹腔镜取卵方法，其特征在于包括以下步骤(1)在猕猴月经周期1-5天内开始注射人源重组的超排激素促卵泡激素(FSH)；(2)给药4天后，检测卵泡发育情况，对卵泡发育均匀、数目合适的猕猴继续给药；(3)给药8天后，注射人绒促性腺素(HCG)；(4)约36小时后，利用腹腔镜收集卵母细胞、分级、处理。
2.根据权利要求1所述的猕猴超数排卵和腹腔镜取卵方法，其特征在于所述的注射人 源重组的超排激素促卵泡激素(FSH)是将70IU的FSH用生理盐水稀释混勻后，根据动物的 年龄、体重、重复利用次数、血液雌二醇和孕酮水平决定用药剂量，早晚肌肉注射给药。
3.根据权利要求1或2所述的猕猴超数排卵和腹腔镜取卵方法，其特征在于所述的给 药4天后，用B型超声波检测卵泡发育情况。
全文摘要
一种猕猴超数排卵和腹腔镜取卵技术，属于用于动物繁殖的方法，特别是刺激猕猴一次获得多个成熟卵母细胞的方法。本发明用人源重组的超排激素促卵泡激素(FSH)刺激猕猴卵巢多个卵泡发育后，用人绒促性腺素(HCG)使卵泡成熟，并利用腹腔镜收集卵母细胞。本发明大幅提高了猕猴卵子的数量和质量，操作过程微创，受试动物无痛苦，也提高了猕猴利用次数/年和利用年限，增加了胚胎工程相关研究所需材料。
文档编号A61D19/00GK101849861SQ20101019867
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者唐向辉, 季维智, 牛昱宇, 王宏, 纪少珲, 陈永昌 申请人:昆明亚灵生物科技有限公司