专利名称：高静水压处理提高牡蛎成活率的方法
技术领域：
本发明涉及一种水产动物的育苗方法，特别涉及利用高静水压处理提高牡蛎幼体 成活率的方法。
背景技术：
静水压(hydrostatic pressure)是自然界中一个常见的物理参数，生活在水生 环境中的生物或多或少都受静水压的影响，但只有深海生物才时刻处于高静水压(high hydrostatic pressure, HHP)之中。高静水压是指压力在IOMPa以上的静水环境，它相当 于IOOOm水深所产生的压强。地球表面有50%以上的面积都是被水深超过IOOOm的海洋所 覆盖，其中生活着大量耐受高静水压的生物类群。静水压是影响海洋生物垂直分布区系的 重要环境因子，其重要性仅次于温度。目前，有关高静水压的研究主要集中在食品保鲜工业方面，其工作原理是运用超 高静水压(压力大于150MPa)将食品中的细菌、病毒等灭活，由于这是一个非热源的灭菌过 程，它不会使食品中的风味蛋白质等变性，因此最大限度的保留食品原有的风味。运用高 静水压灭活食品中的微生物，其压力往往在IOOMPa以上，最常用的压力约为200MPa。高静 水压的另一个运用领域是将植物或细菌的种子在萌发之前用高静水压处理，以期获得生长 快，抗逆性好的后代。虽然有文献将高静水压处理植物或菌类的种子描述成一个“诱导突变 的过程”(王岁楼，吴晓宗，段旭昌，孙君社，鸡腿菇漆酶产生菌的高静水压诱变研究，食品科 技，2006，6 29-32 ；)，但更多的研究认为该过程可重复，不属于诱变的过程，而是诱导新的 代谢途径的过禾呈(Xuncheng Liu,Mei Zhang, Jun Duan and Keqiang Wu. Gene expression analysis ofgerminating rice seeds responding to high hydrostatic pressure. Journal of PlantPhysiology,2008,165(18) 1855-1864 ；Naparat Prapaiwonga,Richard K. Wallacea and CovadongaR. Arias, Bacterial loads and microbial composition in high pressure treated oysters during storage. International Journal of Food Microbiology, 2009,131 (2-3) =145-150) 0目前将高静水压运用于提高生物种植或养殖成 活率的研究仅见于植物的种子、细菌以及猪牛精子的冷冻保存方面，未见有将此技术运用 于提高水生动物养殖成活率的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高静水压处理提高牡蛎成活率的方法。本发明的具体步骤如下用静水压处理牡蛎胚胎，所述静水压的压力为10 40MPa，所述用静水压处理牡蛎胚胎的时间为10 50min，所述牡蛎胚胎可为牡蛎胚胎中至 少有50%的牡蛎受精卵发育至囊胚期。所述静水压的压力最好为lOMPa，所述用静水压处理牡蛎胚胎的时间最好为 50min，所述处理的开始时刻为牡蛎胚胎中50%的牡蛎受精卵发育至面盘幼虫，所述用高静水压处理牡蛎胚胎之前，最好先用筛网将所述牡蛎胚胎进行过滤浓缩，浓缩后的牡蛎胚胎浓度可< 100个/mL。所述用于浓缩牡蛎胚胎的筛网的孔径可为25 60 μ m。所述牡蛎胚胎可以通过如下步骤获得1)挑选性腺饱满的牡蛎亲贝，用显微镜区别雌雄亲本；2)采用人工授精的方法获得精子和卵子，混合精子和卵子，获得受精卵；3)将受精卵置于正常孵化条件下进行孵化，处理开始时刻为牡蛎胚胎中至少有 50 %的牡蛎受精卵发育至囊胚期。根据不同牡蛎胚胎的生长特性，选择不同的孵化条件，优选的孵化条件为受精卵 置于沙滤海水中，每个充气头以< lL/min的出气量往所述沙滤海水中充入空气，在25°C水 温的条件下，培养22h。本发明与已有的研究存在明显的差异，具体如下与植物的种子、细菌、以及猪牛等家畜的精子相比，牡蛎胚胎具有显著的特殊性。 首先，牡蛎胚胎是动物，而水稻、灵芝等属于植物或真菌，植物的种子可以在离水的条件下 存活相当长的时间，它们在结构和成份上与牡蛎胚胎有很大的区别；其次，植物、真菌等配 子的有效作用压力一般在SOMPa左右，而牡蛎胚胎的有效作用压力在20MPa左右；第三，在 自然条件下，陆生的植物、真菌等的种子没有机会接触到高静水压的条件，即使偶尔被海流 带入深海，仍然没成活的可能，而体外受精水生动物的胚胎(如牡蛎等)一般能在海里浮游 几天至数周，甚至一年多(如锦绣龙虾)，被海流带入深海再回到浅海的可能性很高，高静 水压对于牡蛎胚胎而言，并非特别特殊的人工条件。因此，牡蛎胚胎与陆生植物的巨大区别 决定了它们之间采用高静水压技术时方法上的显著区别。与牡蛎诱导三倍体或四倍体的目的不同，本发明中的高静水压处理牡蛎胚胎的目 的是抑制其体内某些正常代谢通路，从而启动生物体内的代谢补偿通路，实现提高抗逆性 或者提高产率的目的。而牡蛎三倍体或四倍体的诱导，其目的在于使染色体组加倍，获得不 育的后代实现增产的目的。不同的原理与目的必然有不同的处理方法。牡蛎三倍体或四倍体的“开始处理时 刻”必须在受精卵排出第一极体或者第一次卵裂的时候进行休克处理(包括冷休克、热休 克、压力休克、药物休克等)，此过程一般需要在受精后30min内完成，而本发明所述方法的 “开始处理时刻” 一般在受精后5h以上，甚至在受精后36h。综上所述，本发明在实验对象、实验原理、实验方法等方面均与现有的研究有显著 区别。本发明所述方法处理后的牡蛎胚胎成活率显著升高，能够极大地提高牡蛎的养殖成 功率，具有良好的应用前景。
具体实施例方式本发明以中国东南沿海养殖量最大的僧帽牡蛎为研究对象，设计了 3因素3水平 的正交实验，用于探究静水压对于牡蛎胚胎发育的影响。3个实验因子及3个实验水平分别 是胚胎发育阶段(即受精后开始进行高静水压处理的时刻，对应的3个水平分别是50% 的胚胎发育至囊胚期、50%的胚胎发育至单轮幼虫、或50%的胚胎发育至面盘幼虫时期)； 静水压的持续时间(分别是10、30、50min)；静水压强的大小(分别是10、20、40MPa)。以牡 蛎受精后第15天的成活率为指标，分析了 9个实验组牡蛎胚胎的成活率。由于活的胚胎是悬浮的，死亡的个体是沉淀的。牡蛎成活率的检测方法为用ImL的玻璃移液管吸取ImL养 殖水，在透光的条件下计算其中的牡蛎幼体数量，3次平均获得的每mL养殖水中牡蛎幼体 数量与最开始时刻(未处理前)的每毫升养殖水中牡蛎幼体数量的比值就是成活率。结果显示，静水压的大小是影响僧帽牡蛎成活率的关键因素，其次是静水压持续 时间，不同胚胎发育阶段对于牡蛎成活率的影响最小。最佳的实验组合是当50%的胚胎 发育至面盘幼虫时，采用IOMPa的静水压处理50min，能够获得最高的成活率。60L养殖水 体中培养15天的相对成活率(42.7%)显著高于对照组(1.9%)。胚胎染色体的制片以及 倍性分析仪分析结果显示，各实验组均未发现三倍体或者多倍体的胚胎(表1)。表1染色体众数观察记录表
二倍体18192021对照组21234实验组(实施例1)42183从表1可以看出，对照组染色体数为20的中期分裂相检测到23个，明显多于染色 体数为18、19、21的中期分裂相，对应的数量为2、1、4 ；实验组染色体数为20的中期分裂相 检测到18个，也明显多于染色体数为18、19、21的中期分裂相，对应的数量为4、2、3。实施例1现以其中的一组参数为例，阐述本发明的操作方法如下1.挑选性腺饱满的牡蛎亲贝，用显微镜区别雌雄亲本；2.采用人工授精的方法获得精子、卵子，按照10 1的比例混合精子、卵子，获得 受精卵；3.受精卵置于沙滤海水中培养，每个充气头以< lL/min的出气量往所述沙滤海 水中充入空气；4.将受精卵置于正常孵化条件下进行孵化，在50%的胚胎发育至面盘幼体期(又 称D形幼体期)时，开始进行压力诱导；5.由于静水压仪(可参见中国专利ZL02241798. 2.)的空间有限，为了取得较好的 处理效果，在将牡蛎胚胎移入压力容器腔；先用25 μ m孔径(即500目)的筛网将牡蛎胚胎 进行浓缩；6.快速加压至lOMPa，持续50min ；7. 50min后迅速释放压力，取出牡蛎胚胎，放入养殖池中进行常规牡蛎育苗；8.经过这样处理过的牡蛎仍然是正常二倍体，且15天后的成活率(42. 7% )显著 高于对照组(1.9% )0实施例2牡蛎幼体处于囊胚期，IOMPa的压力处理lOmin，其余步骤与实施例1类似，15天后 的成活率为14.7%。实施例3牡蛎幼体处于原肠胚，40MPa的压力处理IOmin，其余步骤与实施例1类似，15天后的成活率为16.7%。实施例4牡蛎幼体处于原肠胚，IOMPa的压力处理30min，其余步骤与实施例1类似，15天后 的成活率为11.8%。以上实施例对照组15天的成活率约为1.9%。
权利要求
高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于用高静水压处理牡蛎胚胎，静水压力为10～40MPa，处理开始时刻为至少50％的牡蛎受精卵发育至囊胚期，处理持续时间为10～50min。
2.如权利要求1所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于所述静水 压力为lOMPa，处理开始时刻为50%的牡蛎受精卵发育至面盘幼虫，处理时间为50min。
3.如权利要求1所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于所述用高 静水压处理牡蛎胚胎之前，先用筛网将所述牡蛎胚胎进行过滤浓缩。
4.如权利要求3所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于所述过滤 浓缩后的牡蛎胚胎浓度< 100个/mL。
5.如权利要求3所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于所述筛网 的孔径为25 60 μ m。
6.如权利要求1所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于所述牡蛎 胚胎通过如下步骤获得1)挑选性腺饱满的牡蛎亲贝，用显微镜区别雌雄亲本；2)采用人工授精的方法获得精子和卵子，混合精子和卵子，获得受精卵；3)将受精卵置于正常孵化条件下进行孵化，处理开始时刻为牡蛎胚胎中至少有50% 的牡蛎受精卵发育至囊胚期。
7.如权利要求6所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于步骤2)中 所述精子与卵子的比例为10 1。
8.如权利要求6所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，其特征在于步骤3)中 的正常孵化条件为受精卵置于沙滤海水中，每个充气头以< lL/min的出气量往所述沙滤 海水中充入空气，在25°C水温的条件下，培养22h。
全文摘要
高静水压处理提高牡蛎成活率的方法，涉及一种水产动物的育苗方法。用静水压处理牡蛎胚胎，所述静水压的压力为10～40MPa，所述用静水压处理牡蛎胚胎的时间为10～50min，所述牡蛎胚胎可为牡蛎胚胎中至少有50％的牡蛎受精卵发育至囊胚期。所述用高静水压处理牡蛎胚胎之前，先用筛网将所述牡蛎胚胎进行过滤浓缩，浓缩后的牡蛎胚胎浓度可＜100个/mL。所述用于浓缩牡蛎胚胎的筛网的孔径可为25～60μm。其对象、原理和方法等方面均与现有的方法有显著区别。处理后的牡蛎胚胎成活率显著升高，能够极大地提高牡蛎的养殖成功率，具有良好的应用前景。
文档编号A01K61/00GK101940178SQ201010269159
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者柯才焕, 梁翠, 王德祥, 虞晋晋, 黄建荣 申请人:厦门大学